硒形态分析研究进展摘要:综述了近年来关于微量元素硒形态分析领域取得的最新研究成果,尤其是联用技术在硒形态分析中的应用,主要包括不同的样品前处理方法以及形态分析所取得的结果｡关键词:硒;形态分析;联用技术Research Progress of Selenium Speciation AnalysisAbstract: This article gave a review about the latest progress on speciation analysis of microelement—Selenium(Se), especially the application of hyphenated technique,mainly the methods of pretreatment and the results of these applications. Key words: Selenium; speciation analysis; hyphenated technique硒是人体必需的微量元素｡人体内含有多种以硒化合物为活性中心的酶,如红细胞谷胱甘肽过氧化物酶(RBC GSH-PX)､磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHG-PX)､血浆谷胱甘肽过氧化物酶(PGSH-PX)｡这些酶具有抗氧化作用､提高红细胞的携氧能力､提高人体免疫机能等重要的生物功效｡人体缺硒会导致克山病､大骨节病等地方病,血硒水平偏低会引起癌症死亡率升高,因此硒享有―生命的火种‖―具有保健作用的神奇矿物‖的美誉｡但硒同时也是一个典型的双功能元素｡适量的硒有利于人体健康,但摄入硒过量会导致人体多种中毒症状｡1960年,在湖北恩施发现一种临床表现为―毛发脱落,指(趾)甲损害,皮肤损害,神经系统损害‖的症状,现在已经确认该病为地方性硒中毒,是当地自然环境和农作物含硒量过高所引起的｡美国生物学家Joseph认为,―硒在所有具有毒性的化学制品中具有最狭窄的安全和危险界限‖｡硒所具有的重要生物功能使其成为功能性食品的青睐元素,但由于硒的摄入量存在限值,比如英国规定人体每日的硒摄入量不能超过70 μg,而中国营养学会推荐的日摄入量为100~240 μg,所以对食品和营养强化剂中硒含量的检测是食品安全领域的热点｡但是研究表明,硒的营养性和毒性､在环境中的迁移转化规律,不仅取决于硒的总量,同时更取决于它的形态｡但是形态分析比传统的总量分析复杂很多,因为大多数食品中硒含量比较低,而且在前处理的过程中硒容易挥发和转化｡为了克服这些难题,近些年来,科技工作者从新技术手段的引用(主要表现为分析仪器的联用技术)､前处理的改进等方面对食品中硒的形态分析做了大量工作,以实现对不同基质的食品进行准确､高效的定量和定性分析｡1不同基质样品的前处理对于生物体样品,前处理方法相对比较简单｡血浆､乳清和尿液等样品经过过滤和稀释可直接进入色谱柱｡含硒的氨基酸多为水溶性,用热水可浸取出与大分子结合的硒化合物｡样品用水搅匀,经超声振荡加热处理和超声离心,硒浸取率约为90%｡含硒氨基酸还可用超滤或透析分离｡在实验中发现,某些含硒氨基酸容易氧化降解,用羟甲基衍生物可以对其加以稳定,以防降解｡在分析鼠尿样品中的硒含量时,Yasumitsu等[1]指出必须对样品进行纯化,去除NaCl和脲以满足ESI–MS的测定要求｡在对植物性样品进行分析时,根据不同的分离､检测目的,所采用的前处理方法也有差异｡Emese等[2]用酶水解胡萝卜样品以提取蛋白硒和非蛋白硒,离心分离测定硒的各种形态｡实验表明,胡萝卜的叶子和根中硒的提取率分别是(75±2)%和(78±3)%(n=3),检测限是45 ng/g(80Se)｡Sasi等[3]在测定巴西干果中的硒形态时,采用了先去除脂肪,然后利用蛋白酶进行水解的方法,提取效率达到了89%,检测到多种含硒氨基酸｡Maria等[4]用含Na2SeO3的营养液培养大蒜和芥菜,用微波消解(1.5 mL HNO3,1.5 mL H2O2)的方法作为测总硒的预备试验;在做硒的形态分析时,前处理中该试验比较了3种提取液(0.1 mol/L盐酸,25 mmol/L醋酸铵缓冲液,蛋白酶水溶液)对硒的浸提效果,发现当用0.1 mol/L的盐酸作浸提剂时,硒的形态分析进行得比较好｡同时发现用盐酸或者醋酸铵作提取剂时,超声波探测器能快速提取含硒物质,由此带来的形态降解可以忽略不计｡Gergely等[5]分析双孢蘑菇(Agaricus bisporus)､香菇中的硒形态时,比较了3种蛋白质提取方案(0.1 mol/L NaOH,30 mmol/L Tris-HCl缓冲液,酶消解)的效果,发现24h Tris-HCl缓冲液提取,加入丙酮的方法提取水溶态的含硒蛋白质效果最好;在利用酶体系进行消解时,胰蛋白酶在50℃的条件下处理24 h可以达到比较高的降解和提取效率｡同样是分析富硒双孢蘑菇(Agaricus bisporus)中的硒形态,Stefa′nka等人[6]采用三步提取法(水提取,胃蛋白酶提取,胰蛋白酶提取)对样品中的硒进行浸提,提取效率达到75%;用高效液相色谱和水力高压雾化器连用对浸提液进行分析,成功检测出SeCys2和Se(Ⅳ),检出限达到0.25 mg/L｡在对细香葱进行分析时,不同的提取剂得到的含硒物质并不相同｡Emese等[7]用三种不同的硒营养液(Se(Ⅳ),Se(Ⅵ),硒蛋氨酸)培养细香葱,分别用高氯酸—乙醇和酶提取细香葱中的含硒物质,分析结果表明高氯酸—乙醇提取液中主要含L-硒甲基硒半胱氨酸,而酶提取液中检测到L-硒蛋氨酸｡Gómez-Ariza等[8]对酵母进行硒的形态分析时比较了4种不同的提取方法的效果,包括加压液相提取法(PLE)､机械搅拌法､声波降解法和索氏抽提器法｡试验发现PLE法能够更高效率地提取硒半胱氨酸､硒蛋氨酸和Se(Ⅳ)｡同时对酵母的提取条件进行优化,认为11 mL的PLE槽､硅藻土作分散剂､1∶1 (V∶V) H2O∶MeOH是比较优化的提取条件｡在测定自然水样中的硒物质含量时, Bueno 等[9] 用Amberlite IRA-743 树脂浓缩水样,成功检测出Se(Ⅳ)､Se(Ⅵ)､硒胱氨酸｡试验证明该方法的准确性适于检测环境水平的硒浓度(10 ng/L)｡张玲金等[10]建立微波密闭H2O2-HNO3消解､分离､测定植物样品中不同形态硒,以差减法获得了5种不同形态硒化合物的含量,包括可溶态硒､不溶态硒､四价硒､六价硒､有机硒,该方法的回收率达到95%~105%｡2分离与检测在近些年的研究中,硒的分离和检测主要是利用各种联用技术实现的｡气相色谱､液相色谱的迅速发展,原子荧光､原子吸收､等离子体质谱的技术更新,以及各种连接技术的陆续发现,为硒的形态分析提供了技术支持｡根据各种含硒化合物的不同性质,采用不同的联用技术进行分析｡2.1气相色谱分离与检测气相色谱可以用来分离挥发性的二甲基硒､二甲基二硒;如果分离硒氨基酸需要用衍生法增加其挥发性｡Beril等[11]用GC-MS进行硒酵母中硒的形态分析时,用氯甲酸乙酯衍生法分离､测定富硒酵母中的硒蛋氨酸､硒半胱氨酸,试验证明该法能够迅速､有效地分离､测定两种氨基酸｡目前已用于食品强化剂中硒化合物的测定｡2.2毛细管电泳分离和检测毛细管电泳与紫外和可见光检测已用于金属硫蛋白的分离｡Sasi[3]等用毛细管电泳的方法分离巴西干果提取液中的各种含硒物质,ICP-MS检测,在7 min内分离出亚硒酸､硒酸､硒胱氨酸和硒蛋氨酸｡计算各种硒的相对含量,认为硒代蛋氨酸是巴西干果中硒的主要形式｡2.3高效液相色谱分离与检测2.3.1体积排阻色谱(SEC)SEC是按溶质分子的大小来分离混合物的,是一种比较温和的分离技术,通常不会引起元素形态的丢失,适用于不稳定或与金属络合较弱的生物大分子｡Katarzyna等[12]用含硒标准溶液培养洋葱一周,将其分为叶和鳞茎,用0.1 mol/L的NaOH提取液,用SEC-MS分析,结果证实硒与高分子部分的结合在叶子中比在鳞茎中多;去除低分子化合物和无机硒后,用离子对高效液相色谱进行硒的形态分析,证实其叶的提取物中主要的有机硒是硒甲基硒半胱氨酸;用酶水解富硒洋葱,发现鳞茎中的主要有机硒是γ-谷胺酰基硒甲基硒半胱氨酸｡Moreno等[13]用SEC与ICP-MS和UV检测器联用对冷冻干燥的生物样品(鱼类､甲壳类､蔬菜类､酵母)进行分析;对生物样品的水溶部分和残渣态进行酶消解,用阳离子交换色谱连接ICP-MS进行分析,用Hamilton PRP-X200柱和不同pH条件下的4 mmol/L吡啶(1 mL/min)作流动相｡结果只在蔬菜样品中检测到硒胱氨酸(0.1~0.7 mg/kg);在牡蛎､蛤贝､鲑鱼､白三叶草中检测到三甲基硒(0.1~0.3 mg/kg);在硒化酵母､磷虾､白三叶草中检测到亚硒酸(0.2~3.0 mg/kg);硒酸盐只存在于酵母中,含量为8 mg/kg｡2.3.2离子交换色谱(IEC)与SEC相比,IEC的优点是分离效率高,应用范围广｡其分离过程是基于带电溶质离子与固定相的反电荷表面的交换平衡｡Emese等[7]在种植胡萝卜时施叶面肥100 mg/LSe(Ⅳ),阴离子交换和阳离子交换HPLC法与ICP-MS联用检测根部提取液,检测到硒蛋氨酸､γ-Glu-MeSeCys､Se(Ⅳ);实验表明γ-Glu-MeSeCys､硒蛋氨酸是胡萝卜根中硒的主要有机形态,检测限是45 ng/g(80Se)｡Fangshi等[14]用HPLC柱子(25 cm×4 mm×5 μm),阴离子交换ESA Anion Ⅲ进行硒的形态分析,检测到Se(Ⅳ)､Se(Ⅵ)､三甲基硒离子､硒蛋氨酸｡使用pH5.5的0.0055 mol/L醋酸铵作流动相,流速为1.5 mL/min,在m/z为78时用ICP-MS测量硒,用超声波雾化提高雾化的效率｡此方法中各种硒的检测限(μg/L):三甲基硒离子,0.08;Se(Ⅳ),0.34;硒蛋氨酸,0.18;Se(Ⅵ),0.07｡Zheng等[15]用混合离子对试剂分离了8种含硒化合物:Se(Ⅳ)､Se(Ⅵ)､硒胱氨酸,硒脲､硒蛋氨酸､硒乙基硫氨酸､硒胱胺､三甲基硒离子,所使用的流动相是2.5 mmol/L丁烷磺酸钠和8 mmol/L羟化四甲胺,使用LiChrosorb RP18反相柱,耗时18 min｡Zhang等[16]用阴离子交换树脂Dowex 1-10X对长药芥属(Stanleya pinnata)的提取液进行分析,HG-AAS检测｡结果表明硒化合物可以被树脂柱定量分离;5种硒化合物(三甲基硒离子､二甲基硒氧化物､硒蛋氨酸､Se(Ⅳ)､Se(Ⅵ))的回收率范围是92.9%~103.0%;植物中可溶态硒化合物:硒氨基酸占73.0%~85.5%,Se(Ⅵ)占7.5%~19.5%,非氨基酸有机硒<7%｡实验表明,植物生长过程中积累的大量Se(Ⅵ)被代谢为含硒氨基酸｡本方法的检出限为1 mg/kg｡Lin[17]用Dowex 1X2树脂和AAS检测系统对地下水中的Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)进行了分析,分别用0.1和 1.0 mol/L的硝酸作淋洗液,测得溶解态硒的平均浓度是(32.1±17.6)ng/L,Se(Ⅵ)占总可溶态硒的47.6%~61.2%,平均为53.8%,检测限为5.6 ng/L｡Gosetti等[18]用离子交换色谱和离子阱质谱对食品增补剂中的含硒物质进行形态分析;用甲醇､水混合物作流动相对含硒有机物进行梯度淋洗;用含甲醇､四丁基氨的水溶液对含硒无机物进行梯度淋洗;色谱分析中使用Luna C18固定相｡该实验得到的硒形态有:硒-L-蛋氨酸､L-硒胱氨酸､苯基-L-硒半胱氨酸､甲基-硒-L-半胱氨酸､甲烷硒酸､硒氰酸盐､硒酸､亚硒酸｡Niedzielski[19]用HPLC–HG–AAS 法对地下水进行形态分析,实验中用到了Supelco LC-SAX1阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)同时检测到As(Ⅲ),As(Ⅴ),Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ),其中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的检测限分别为2.4 μg/L和18.6 μg/L｡王振华等[20]用PRP-X100阴离子交换柱和保护柱同时进行了砷和硒的形态分析,流动相为pH值5.6的10 mmol/L NH4H2PO4溶液(添加2.5%的甲醇),在12 min内同时分离了As(Ⅲ)､MMA､DMA､As(Ⅴ)､SeCys2､SeMet和Se(Ⅳ)等化合物,实验中的相对标准偏差为1.9%~6.1%｡韦昌金等[21]建立了离子交换色谱-氢化物发生双道原子荧光联用同时测定4种As形态和3种Se形态的方法,采用PRP-X100阴离子交换分析柱可以在10 min 内同时分离､检测As和Se形态,各种硒化合物的检测限为:SeCys2 0.6 μg/L､Se(Ⅳ)0.5 μg/L､SeMet 3 μg/L｡各形态的精密度RSD(n=7)均小于5%,用此方法测定了富硒营养品中的As和Se形态,加标回收率在91%~115%之间｡2.3.3反相高效液相色谱(RP-HPLC)RP-HPLC利用极性比流动相弱的固定相来分离分析物｡保留机制是基于分析物的憎水性｡该方法的应用范围广,对不同形态的分辨率高｡用多种流动相可以提供分离的多样性,另一优点是重复性好｡Ipolyi 等[22]用反相液相色谱直接氢化物发生原子荧光光度法进行硒的形态分析;用pH 为4的0.01 mol/L的醋酸铵溶液作淋洗液,其中含有0.5%的甲醇､0.1 mol/L的DDAB;各种硒化物的检测限(μg/L)为:硒蛋氨酸,70;硒乙基硫氨酸,96;Se(Ⅳ),16｡彭岚等[23]用Inertsil ODS-3反相色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)对底泥中的硒进行了形态分析,试验中优化的流动相条件:浓度为 5 mmol/L的四丁基硫酸氢铵(pH6.0)､2.5 mmol/L磷酸二氢铵､体积分数5%甲醇､流速1.5 mL/min;实验中检测到Se(Ⅳ)､Se(Ⅵ)､SeMet和SeCys2等4种不同的硒形态,检测限为0.5~1.9 μg/L｡张涛等[24]用RPLC-ICP-MS法对富硒大米的酶解液中的硒代氨基酸含量进行分析,色谱柱为Waters RP18反相柱((150 mm×39 mm×5 μm),并联有RP18保护柱(20 mm×39 mm×5 μm),流动相为0.1%七氟丁酸,含甲醇0.3%,流速为0.8 mL/min,实验结果发现,大米中的硒主要以硒代半胱氨酸的形式存在｡2.3.4离子对色谱(IP-HPLC)RP-HPLC仅能分离非极性不带电的分析物,在分离带电的极性分析物时需要用离子对试剂｡固定相是标准硅烷化的硅胶填料如C8､C18,流动相是由磷酸盐或醋酸盐､有机改进剂甲醇或乙腈和离子对试剂组成的水溶液缓冲体系｡离子对试剂与分析物生成离子对保留在反相柱上｡离子对试剂参与流动相中分析物与非极性固定相之间的平衡｡Zheng等[25]用两相离子对反相色谱对硒营养强化剂进行分离,ICP-MS检测,得到9种含硒物质:亚硒酸､硒酸､硒脲､三甲基硒离子､硒胱胺､硒胱氨酸､硒半胱氨酸､硒蛋氨酸､硒乙基硫氨酸,检测限为1 μg/L,达到了很好的分离效果｡Wang等[26]用IC-ICP-DRC-MS对环境和生物样品进行分析｡pH为9时(NH4)2CO3和CH3OH进行梯度淋洗,在12 min内色谱分离所有的物质,离子色谱柱上的洗脱液输送至ICP-DRC-MS的雾化系统中,检测砷和硒的化合物｡用峰高作定量研究,硒的检测限是0.01~0.02 μg/L｡2.3.5多维色谱联用技术为了更好地分离各种硒化合物以利于后续检测,多维色谱联用技术方兴未艾｡Maria等[4]用盐酸浸提富硒植物大蒜和芥菜,用离子对反相色谱和体积排阻色谱/离子交换液相色谱与ICP-MS方法联用对浸提液进行形态分析,发现硒的主要形态是硒甲基硒半胱氨酸和硒蛋氨酸｡Gergely等[5]用RP-IP-HPLC-ICP-MS测定双孢蘑菇和香菇的蛋白质酶提取液中的硒物质,鉴别出3种含硒氨基酸:硒胱氨酸､甲基硒代半胱氨酸､硒蛋氨酸,检测限为12 μg/L｡Smrkol等[27]用HPLC-UV-HG-AFS对喷洒了硒酸钠溶液的苦荞麦进行硒的形态分析,其中液相色谱部分用了Hamilton PRP X-100阴离子交换柱和Hamilton PRP X-200阳离子交换柱,分别用40 mmol/L的NH4H2PO4溶液(pH 6)和10 mmol/L的吡啶溶液(pH 1.5)作流动相,采用酶水解的方法,发现荞麦种子提取物中(93±5)%的硒为硒蛋氨酸｡Zoyne等[28]用 1 mg/L的Na2SeO3溶液培养富硒花椰菜,阴离子交换柱(PRP-X100)和体积排阻/离子交换色谱柱对花椰菜的酶提取液进行分析,发现硒蛋氨酸是根中主要氨基酸,而硒甲基硒半胱氨酸是花椰菜果实的主要氨基酸｡Tyre 等[29]以硒蛋氨酸为硒源培养印度芥菜,用液相色谱法(反相离子对色谱,用七氟丁酸作反离子;阳离子交换色谱,用pH为3的吡啶甲酸盐淋洗)分离植物提取液中的物质,ICP-MS法检测,用电喷雾四极时间飞行质谱对合成的标准物质和根部提取物中的硒甲基硒蛋氨酸进行定性｡分析结果认为硒甲基硒蛋氨酸为其重要的硒化合物,也可能含有少量的二甲基硒丙酸盐｡2.4其他联用技术原子荧光分光光度法和原子吸收分光光度法比较成熟､简单易行､使用普遍,所以在很多联用技术中多有使用｡Amit等[30]用直接氢化物发生原子吸收方法检测人尿中的硒蛋氨酸,检测限是1.08 μg/L,校准曲线在0~30 μg/L范围内呈线性相关｡3展望从目前的研究情况可以看出,色谱分离法与光谱类分析法如ICP-MS､AES､AAS 及AFS等的联用是今后硒形态分析的主要方法｡从检测结果来看,为了了解有机硒的形态,需要分析科学和其他学科的交叉渗透､各种分离方法和检测技术的有机结合｡从目前的研究情况可以看出,以色谱分离法为主体的分离技术,以其高效的分离能力将在硒形态分析方面成为主流;光谱类的检测技术,如AFS､AAS､AES 以其检测限比较低､成本比较小等优点,将在硒的检测领域得到更加广泛的应用｡在检测结果方面,无机硒的形态分析方法较为成熟,已经能够有效地分离各种无机硒;但是有机硒化合物的检测结果相差比较大,这是因为有机硒具有多种形态,有些已经确认种类,但是也有一部分由于缺乏标准物质而无法确认｡要进一步准确地定性､定量测定多种硒化合物,有赖于多种分析技术的联合使用｡这方面的工作还大有可为｡可以预期,硒的形态分析将随着科学技术的发展取得更大的进展,从而为功能性食品的检测和人类的健康做出更大的贡献｡参考文献:[1] YASUMITSU O, KAZUYA I , HIROMITSU T ,et al.Identification of a novel selenium metabolite,Se-methyl-N-acetyl-selenohexosamine,in raturine by high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasma massspectrometry and electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B, 2002,87:301-312.[2] EMESE K, PETER R,HILLESTR,et al.Effect of foliar application of selenium on its uptake and speciation in carrot[J].Food Chemistry, 2009,115:1357-1363.[3] SASI S,KANNAMKU M, KATARZYNA W,et al. 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