微生物-生长

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连续培养技术——恒浊培养
概念：通过调节培养基流速， 使培养液浊度保持恒定的连续 培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流 入的速度和培养物流出的速度 来维持菌浓度不变,即浊度不变。 主要采用恒浊器，当浊度高 时，使新鲜培养基的流速加 快，浊度降低，则减慢培养基 的流速。 特点：基质过量，微生物始终 以最高速率进行生长，并可在 允许范围内控制不同的菌体密 度；但工艺复杂，烦琐。
微好氧菌（microaerophilic bacteria）
只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以 氧为最终氢受体而产能。
兼性好氧菌（facultative aerobe）
在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得 更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产 能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。
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②.对数期（logarithmic phase）
其他名称：指数期 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈 直线关系。 特点： 生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等 比较一致 代谢最旺盛 细胞对理化因素较敏感
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影响指数期微生物 增代时间的因素:
①菌种：不同菌 种的代时差别极 大 ②营养成分：同 一种细菌，在营 养物丰富的培养 基中生长，其代 时较短，反之则 长。
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连续培养原理
原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后 期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另 一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平 衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态 和稳定的生长速率。
连续流入 新鲜培养液 单批培养 恒浊法 最高速率 恒化法 连续培养
lg细胞数（个/ml）
生物体中超氧阴离子的形成与去除 O2 + e
Ø Ø
O2· ( ·O2 )
Ø
超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。 超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我 保护方式。 兼性厌氧菌E.coli在发生SOD缺失突变后，就会变成一种 “严格厌氧菌”。
过氧化氢酶 好氧生物
H2 O + 2H2O
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认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：
◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： ①增加接种量； （群体优势----适应性增强） ②采用对数生长期的健壮菌种； ③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养 基的某些成分。 ④选用繁殖快的菌种 ◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌
第七章 微生物的生长与控制
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第一节 生长测定方法
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况， 需选用不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）
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★影响延迟期长短的因素：
◆菌种： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； ◆接种物菌龄： 用对数生长期的菌种接种时，其延 迟期较短，甚至检查不到延迟期； ◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延 迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）； ◆培养基成分： ◇在营养成分丰富的天然培养基上 生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；◇接种后 培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发 酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。
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应用意义：
1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上 应尽量延长此期，提高产量，措施如下： • • 补充营养物质（补料） 调pH
• 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。
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④. 衰亡期（decline phase）
特点：①细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞 数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。 ②细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽 孢开始释放。 ③因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自 溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条 件有关。 产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大 大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡
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2.单细胞微生物的群体生长曲线
生长曲线：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定 细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得 到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程 却有着共同的规律性。根据微生物每小时的分裂代数（R） 不同，一般可把生长曲线分成迟缓期（延滞期）、对数生 长期、稳定期、衰亡期。
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第二节
微生物的生长规律
一、微生物的个体生长和同步生长
由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的 困难。 •同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进 行分裂的状态，称为同步生长（synchronous growth） ，进 行同步分裂的细胞称为同步细胞。
•同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此 间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物 化学等研究的良好材料。
8.0mg/ml 6.0mg/ml 4.0mg/ml 2.0mg/ml 1.0mg/ml 0.5mg/ml 0.2mg/ml 0.1mg/ml
时间
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影响指数期微生物增代时间的因素: ④培养温度：
温度对微生物的生长速率有极其明显的影响
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应用意义：
①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最 适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； ②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体 密度 ③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 ④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察 等的良好材料。
Ø严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能 解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。 Ø在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例 如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（ O2· ）等。超氧阴 离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极 不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害 或致死。 Ø好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧 化物酶、超氧化物歧化酶（SOD）等， Ø而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧 29 阴离子自由基毒害致死。
•微生物不同生理活动要求不同温度，所以， • 最适生长温度 ≠ 发酵速度快、积累代谢产物多。
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二、氧气对微生物生长的影响
微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根 据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:
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氧浓度对不同微生物生长的影响
氧气如何“施毒”？
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厌氧菌的氧毒害机制—— SOD学说：
使用范围：用于生产大量 菌体、生产与菌体生长相 平行的某些代谢产物，如 22 乳酸、乙醇等。
恒浊器与恒化器的比较
装置 控制对象 培养基 培养基 流速 生长 速率 最高 产物 大量菌体 或与菌体 形成相平 行的产物 不同生长 速率的菌 体 应用 范围 生产 为主
恒浊器 菌体密度 无限制 不恒定 （内控制） 生长因 子 恒化器 培养基流 有限制 速（外控 生长因 子 制） 恒定
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③. 稳定期（stationary phase）
又称：恒定期或最高生长期 特点：①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的 生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。 ②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽 孢。 ③此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说， 一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。 产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;
2 O2 +
·
2H+
SOD 好氧生物 和耐氧细菌
1 O 2 2
O2 + H2 O2
过氧化物酶 NADH2 耐氧菌
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NAD
专性好氧菌（strict aerobe）
必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸 链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶 （SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。
低于 最高
实验 室为 主
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第三节 环境因素对微生物的影响
一、温度对微生物生长的影响
温度对微生物的影响具体表现在： §影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细 胞合成。 §影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质 的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输 §影响物质的溶解度，对生长有影响。
可分为三个阶段： 1、生长停滞期 2、迅速生长期 3、衰退期
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三、微生物的连续培养
分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容 积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不 再补充和更换，最后一次性收获。(典型生长曲线) 连续培养（continuous culture） ：指在微生物的整 个培养期间，通过一定处理使其能以恒定比生长速 率生长并持续生长下去的培养方法 连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期 到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临， 从而发展出现在的连续培养技术。
低于其最高 生长速率
单批培养 连续培养 时间
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连续培养技术——恒化连续培养
概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌 生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、 生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达 到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低 于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速 率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产 量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究，esp与生长速率相关 的各种理论研究