反义RNA逆转耐药肝癌基因工程细胞株多药耐药性的实验研究

摘要：目的 通过重组腺病毒表达出 mdr1 基因的反义 R NA，观察反义 R NA 对人肝癌基因工程细胞株
HepG2/ R 多药耐药性的逆转效应。方法 利用真核表达载体构建可以稳定表达 mdr1 基因和 P 糖蛋白的肝癌
基因工程细胞株 HepG2/ R ，通过腺病毒载体 AdEasy 系统生成重组腺病毒 pAdEasy- GFP- ASmdr1，将此病毒感
4.Department of Hepatobiliary Surgery, Youan Hospital of Capital University of Medical Sciences, Beijing 100069, P.R.China)
Abstract【: Objective】To investigate the reversal effect of multidrug resistance with antisense RNA of mdr1 gene delivered by recombinant adenoviruses in human engineering HCC cell line HepG2/R.【Methods】The recombinant adenoviruse was transfected into the engineering cell line HepG2/R. In order to investgate the reversal of the mul－ tidrug resistance phenotype, the expression of mdr1 mRNA was measured by RT-PCR, the production of P-glyco－ protein and the accumulation of the daunorubicin (DNR) was determinated by flow cytometry. The sensitivitie of adri－ amycin (ADM) for HepG2/R cells was examined by MTT analysis. 【Results】Compared with the parental HepG2 cells expressing low-level mdr1 mRNA and P-glycoprotein, engineering cell line HepG2/R was only stably express－ ing mdr1 gene and P-glycoprotion. The transfection of antisence RNA into HepG2/R cells resulted in decreases of mdr1 mRNA and P -glycoprotein levels. The sensitivity of transfected HepG2/R cells to ADM was reduced from
LI Bo1, YE Tian2, LI Dehua3, CHEN Yongbing4, ZHANG Mengyu1, HE Kai1, FENG Chunhong1, CHEN Xing1, XU Songbo1, NI Jianbin1, LUO Liang1, XIA Xianming1
(1.Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital of Luzhou Medical college, Luzhou, Sichuan 646000, P.R.China; 2.Department of Traditional Chinese Surgery, the Second affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan 646000, P.R.China; 3.Genetic Engineering Laboratory, Chengdu Diao Group Co. Ltd, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China;
用腺病毒 pAdEasy- GFP- ASmdr1（MOI=100）感 染 HepG2/R 细胞，72 h 后收集细胞分成两组，一组 PBS 缓冲液洗两次后调整其细胞密度为 1×107 个 /mL。取 100μL 细胞悬液 PBS 缓冲液重悬，加入 mdr 兔多克隆抗体 sc8313，再加入 FITC 标记的羊抗 兔二抗，用 FCM 测定 P- gp 的表达强度。另一组于培 养基中加入浓度为 0.2μg/mL 的柔红霉素（daunorubicin，DNR） 培养 45 min，收集细胞 PBS 缓冲液重 悬，用流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测细胞内 荧光强度。 1.5 统计学处理
Key words: multidrug resistance; multidrug resistance gene; hepatocellular carcinoma cell line; engineering cell line
多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是影响 肝癌患者化疗疗效的主要原因，其主要原因是包括 多药耐药蛋白（P- glycoprotion，P- gp）和多药耐药相 关蛋白（multidrug resistance- associated protein，Mrp） 在内的多种转运蛋白过度表达，通过消耗 ATP 将化 疗药物泵出胞外，降低抗肿瘤药物的细胞内浓度和 效果[1]。逆转 MDR 是肝癌研究中的亟待解决的难题 和肝癌化疗取得重大进展的关键。反义技术提供了 抑制特异基因表达的途径，包括反义寡核苷酸和反 义 RNA。本研究中，笔者用表达 mdr1 基因反义 RNA 的重组腺病毒，感染表达 mdr1 基因单一因素 的肝癌耐药细胞株 HepG2/R，试图抑制肝癌细胞的 MDR。
取生长状态良好的 HepG2/R 细胞，按 5×104 个 细 胞 / 孔 ， 接 种 于 96 孔 板 上 ， 用 重 组 腺 病 毒 pAdEasy- GFP- ASmdr1（MOI=100）感染细胞，48 h 后 更换新鲜培养基并加入浓度依次倍增的化疗药物， 分别为 ADM 0.032～500.000μg/mL，每组设 3 个复 孔。连续培养 48 h，加入 MMT 50μL/ 孔，于二氧化
收稿日期：2009- 03- 21 *基金项目：泸州医学院和四川省科技厅科研资助项目（No：05JY029- 146）
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中国现代医学杂志
第 19 卷
25μg/mL to 3μg/mL in IC50 level. The DNR accumulation was increased in transfected HepG2/R cells.【Conclu－ sion】This study demonstrates that mdr1 antisense RNA can increase the sensitivities of HepG2/R cells to anticancer drug by decreasing the expression of the mdr1 gene and inhibiting P-glycoprotein expression.
第 19 卷第 19 期 2009 年 10 月
中国现代医学杂志 China Journal of Modern Medicine
Vol. 19 No. 19 Oct. 2009
文章编号： 1005- 8982（2009）因工程 细胞株多药耐药性的实验研究*
李 波 1，叶 田 2，李德华 3，陈永兵 4，张孟瑜 1，贺 凯 1，冯春红 1， 陈 星 1，徐松波 1，倪建彬 1，罗 亮 1，夏先明 1
（泸州医学院 1 .附属第一医院 肝胆外科；2.附属第二医院 中医外科，四川 泸州 646000； 3.成都地奥制药集团有限公司基因工程药物研究室，四川 成都 61 0041 ； 4.首都医科大学附属佑安医院 肝胆外科，北京 1 00069）
HepG2/R 细胞分组，每组 1×107 个细胞，用重 组腺病毒 pAdEasy- GFP- ASmdr1（MOI=100）感染 72 h，提取其总 RNA，溶于 50μL 双蒸水。以 HepG2/R 细胞总 RNA 为模板合成 cDNA，β- actin 的引物上 游为 5'- ATGGATGATGATATCGCCGCG- 3'，下游为 5'- TGAAGGTAGTTTCGTGGATGC- 3'，分别扩增 出 609 bp 和 800 bp 的片段。RT- PCR 反应条件：50℃ 预变性 30 min，扩增 30 个循环，每一循环包括 94℃ 变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，最后 72℃补平 5 min。PCR 扩增产物在 1%琼脂糖凝胶检 查和照相。 1.4 流式细胞仪检测 P- gp 的表达和对柔红霉素 的摄取率
MTT 法表明 HepG2/ R 细胞对阿霉素的 IC50 从 25μg/ mL 下降到 3μg/ mL。结论 反义 R NA 通过抑制
mdr1 mR NA 和 P- gp 的表达。
关键词： 多药耐药性；多药耐药基因；肝癌细胞株；工程细胞株
中图分类号：R 735.7
文献标识码：A
Reversing effect of multidrug resistance in hepatocellular carcinoma engineering cell line with antisence RNA*
染 HepG2/ R ，用 R T- PCR 检测 mdr1 mR NA 的表达强度，流式细胞仪检测细胞膜 P- 糖蛋白的表达和柔红霉
素的蓄积率，HepG2/ R 细胞对阿霉素的耐药性用 MTT 法检测。结果 HepG2/ R 细胞感染重组腺病毒后，