流式细胞仪5-Simultest IMK 双色

Simultest IMK双色淋巴细胞亚群检测试剂盒
演示双色试验样本获取和分析：
㈠试验准备：
1、实验目的和原理：利用荧光技术在不同的鼠抗人抗体上标记荧光素，该荧光抗体就同人
外周血中淋巴细胞表面的CD分子特异性结合，然后用流式细胞仪检测，计算各淋巴细胞亚群的百分比，了解人的免疫状态，从而指导临床诊断和治疗。

2、血样采集：用EDTA真空采血管采集静脉血2ml，反复颠倒8-10次，充分混匀；血样采
集后6小时内处理、检测。

3、主要试剂：
a：Simultest IMK Lymphocytes Kit检测试剂盒：
①Isotype Control（MouseIgG1/IgG2a）④CD3 FITC /CD8-PE
②CD3-FITC /CD19-PE ⑤CD3-FITC /CD16+CD56-PE
③CD3-FITC /CD4-PE
b：FACS Lysing Solution溶血素（10×，使用前用蒸馏水稀释成1×）。

c：PBS溶液。

4、样本制备：
①取5支流式上样管，编号为1、2、3、4、5，分别取100µl充分混匀的抗凝全血加入
每支管管底，注意不要碰到管壁。

②依次加入20µl双标Isotype Control（MouseIgG1/IgG2a）、CD3/CD19、CD3/CD4、
CD3/CD8、CD3/CD16+CD56荧光抗体，涡旋混匀。

室温避光孵育15-30分钟。

③取出试管，每管加入10倍稀释的1×FACS Lysing Solution 2ml，涡旋混匀，室温避
光10 2分钟。

300g（约1200rpm）离心5min，弃去上清液。

④每管加入2ml的PBS，涡旋混匀，300g离心5min，弃去上清液。

⑤每管加入0.5ml PBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml 1-2%
的多聚甲醛，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。

5、注意事项：
①弃掉试管中上清液时，一定保证一次性垂直倒掉，不能反复倾倒，防止细胞丢失。

②2~8℃保存，抗体试剂在保质期内稳定，不能冻存。

抗体保存期间或与细胞孵育时注
意避光。

试剂瓶应保持干燥。

③任何试剂的外观改变，如沉淀、变色，都表明试剂已不稳定，这时试剂不能使用。

④为得到理想结果，血样应在静脉穿刺后6h内染色。

⑤操作时如未按指定的孵育时间、离心次数或温度进行，容易发生错误。

⑥抗体试剂虽含有叠氮钠保护剂，仍需注意微生物污染，以免导致错误结果。

6、中国人群淋巴细胞亚群正常参考值（采用此Kit检测，各实验室最好建立自己的参考值）
CD3（总T淋巴细胞）50-84%
CD3+CD4+(Th细胞) 27-51%
CD3+CD8+(Tc/Ts细胞) 15-44%
CD3-CD16+CD56+(NK细胞) 7-40%
CD3-CD19+（B细胞）5-18%
CD4/CD8（Th/Ts）0.71-2.78
㈡流式上机检测：
1、在“浏览框”建文件夹（2C）和实验组（L YM），样本（日期），5个采集管（Mouse IgG1/IgG2a、
CD3/19、CD3/4、CD3/8、CD3/16+56），并重命名。

2、将“浏览框”的采集箭头选中采集管，点击“仪器框”的参数parameter页面，删除不必
要的荧光参数，仅保留FITC和PE，散射光参数选择线性，荧光参数选择对数，FSC选择H高度信号，其余参数均选择A面积信号。

3、在“通用工作页面”上建获取模板：
一共画2个图。

①第一个图，横轴FSC-H，纵轴SSC-A，设圈定淋巴细胞的矩形门P1；
②第二个图，横轴FITC-A，纵轴PE-A，选中该图后：
∙单击右键，在“Show Population”下选中P1，即仅显示P1淋巴细胞门内的颗粒。

∙单击右键，选择“Show Population Hierarchy”。

∙单击右键，选择“Creat Statistics View”，右键单击统计图，选择“Edit Statistics View”。

③选中这两个图，单击“检查框”的“Title”页面，选中“Tube”和“Population”复
选框。

④定义每个样本管的参数标志，参数标志将显示在数据图的坐标轴上和统计表中。

∙选择Experiment>Experiment Layout路径
∙在出现的对话框中的“Label”一栏中，输入每管正确的荧光标志。

比如，在FITC 区域中输入CD3；用Tab键或鼠标转换输入区域。

∙在“Acquisition”一栏中，按住ctrl，选择或输入每管要获取的微粒总数10000个。

4、手动脱机补偿及上机检测：
①放第一管同型对照管在流式细胞仪上：
⑴确认绿色的数据采集箭头指向该管，点击“Acquire”，看通用工作页面的散射光
点图，调节FSC和SSC电压，使LWB样品在散射光点图上分群明显。

⑵如果有必要，调整FSC阈值，以尽可能减少碎片，但又保证淋巴细胞群的完整
为限。

⑶调整P1“门”使其只圈中淋巴细胞。

⑷在荧光点图中，调整FITC、PE电压，尽量使阴性细胞位于左下角荧光表达阴性
区域内。

沿阴性细胞群的上方、右侧边缘0.1～0.2Log单位，画象限门（Quadrant Gate），Q1、Q2、Q3、Q4四个象限出现在“细胞级别图”的P1下。

⑸记录第一管数据。

②依次记录包括补偿管在内的剩余管的所有数据。

③脱机手动补偿：
将绿色的数据采集箭头指向第二管补偿管，在通用工作页面上显示其数据，调节补偿，使荧光点图单阳区域内的细胞位于合适位置。

补偿过量可以从阳性细胞十分贴近坐标轴这一现象观察出来。

而补偿不足可以从单阳性细胞落入双阳性检测区域这一现象观察出来。

一个恰当的补偿应该是Q1-PE单阳性细胞荧光强度与落在Q3中的阴性细胞的X轴（即FITC）荧光强度一致，而Q4-FITC单阳性细胞荧光强度与落在Q3中的阴性细胞的Y轴（即PE）荧光强度一致（看统计图中显示）。

本实验较特殊，CD3、CD19均为荧光单阳表达的抗原标记，因此可以用带有不同荧光素的抗体同时标记这两种抗原，在荧光双参数散点图上直接调节这两种荧光素间的补偿。

否则，需取两份样本，分别加入不同荧光素标记的抗体，分两次分别调节补偿。

④将补偿应用到检测样品上：
⑴选中第二管补偿管，单击右键选择“Copy Spectral Overlap (复制光谱重叠)”命令；
⑵按住ctrl，选中其余样本管，单击右键选择“Paste Spectral Overlap (粘贴光谱重
叠)”命令。

⑤在工作页面的工具栏中，点击（）按扭从通用工作页面转换至各样本单独的工作页面，查看各管的统计结果。