乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达

乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响张毅;屈贤铭;杨胜利【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2000(016)004【摘要】将重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3(GM-CSF/IL-3)融合蛋白表达菌BL21(DE3)(pFu)作为研究对象,对于以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律进行了深入的研究.分析比较了不同培养基中,不同生长阶段进行诱导对于产物表达的影响.对诱导所需的乳糖浓度、诱导持续时间长短等因素亦进行了研究.实验结果表明,在对诱导条件进行优化控制的前提下,利用乳糖作为诱导剂可以达到与IPTG类似的诱导效果.随后的研究中,将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程.这些研究结果为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴.【总页数】5页(P464-468)【作者】张毅;屈贤铭;杨胜利【作者单位】中国科学院上海生物工程研究中心,上海,200233;中国科学院上海生物工程研究中心,上海,200233;中国科学院上海生物工程研究中心,上海,200233【正文语种】中文【中图分类】Q816【相关文献】1.乳糖诱导对幽门螺杆菌UreB、HpaA和大肠杆菌LTKA63、LTB重组蛋白表达的影响 [J], 钊守凤;严杰;胡爱萍2.乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响 [J], 李春丽;席燕燕;陈正华;何国庆3.乳糖作为棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白表达诱导剂的可行性研究 [J], 董琳茜;张克勤;邱并生4.用乳糖作为诱导剂进行重组蛋白的表达 [J], 郝淑美;王宣军;张秀霞;方勇;关晓峰;盛军5.不同诱导剂对工程菌发酵及重组蛋白表达的影响 [J], 卫红飞;万敏;杨世杰;王燕媚;李大鹏;王爱丽;于永利;王丽颖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大肠杆菌中重组酶的特征和功能研究大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于人和动物的肠道中。

它是一种非常重要的实验生物，被广泛用于基因工程和分子生物学研究。

在这些研究中，重组酶是一个非常重要的工具。

重组酶可以将DNA分子切割、连接及重组，构建出新的DNA序列。

本文将介绍大肠杆菌中重组酶的特征和功能研究，从而加深对这一工具的认识。

一、DNA修复和重组DNA是生命的基础，因为它是遗传信息的载体。

在DNA复制和维护过程中，会出现不同类型的损伤，包括单链断裂、双链断裂、损伤碱基、异构化等。

这些损伤会影响DNA的合成和遗传信息的传递，进而导致细胞的死亡或肿瘤的形成。

因此，细胞需要有修复和重组机制来保护DNA的完整性。

DNA修复和重组的过程中，重组酶起到了非常重要的作用。

重组酶可以将某些DNA分子切割出片段，然后将其连接到另一DNA分子上，从而使两条DNA分子相互重组，形成新的DNA序列。

重组酶能够将DNA分子的两条链“切断并拼接”，从而形成一个交叉点。

在这个交叉点上，DNA分子可以进行重组交换，形成一个新的DNA序列。

这个过程被称为DNA重组。

DNA重组在细胞的遗传学中发挥着重要作用，它能够改变遗传信息的排列顺序，产生新的突变和表型。

二、重组酶的分类在大肠杆菌中，有复杂的重组系统。

其中，重组酶可以分为多个类别。

这些类别的酶可以分别实现不同类型的DNA修复和重组。

1、根据功能分类：• 聚合酶：负责DNA复制，并提供一个错误纠正功能。

• 回转酶：负责解旋DNA。

• 单链结合蛋白：结合和保护单链DNA。

• 贴合酶：将单链DNA重新贴到另一条DNA分子上。

• 重组酶：通过结合DNA和切割与重组的方式将两个DNA分子连接在一起。

2、根据实现重组的方式分类：• 扫描环状重组（SRS）酶：在DNA复制和重组过程中起到重要作用。

• 融合重组蛋白（FPR）：可以将同源或异源DNA分子连接在一起。

三、重组酶的特征重组酶是一种复杂的蛋白质，具有多种功能。

乳糖诱导木聚糖酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达周晨妍;符丹丹;王卫杰;曹利军;丰慧根【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2010(0)4【摘要】以构建好的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/xylanase为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组蛋白的表达规律.在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对目标蛋白表达的影响.实验结果表明,乳糖作为诱导剂时,重组菌产酶活力33.9 U/mg略高于IPTG作为诱导剂时重组菌产酶活力28.10 U/mg,这为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产木聚糖酶提供了参考依据.【总页数】5页(P8-12)【作者】周晨妍;符丹丹;王卫杰;曹利军;丰慧根【作者单位】新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡,453003;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳,471003;新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡,453003;新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡,453003;新乡医学院生命科学技术系,河南省医学遗传学与分子靶向药物高校重点实验室培育基地,河南新乡,453003【正文语种】中文【相关文献】1.乳糖诱导酸性木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达 [J], 周晨妍;符丹丹;曹利军;丰慧根2.咖啡豆α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌JM83中可溶性表达、纯化及活性检测 [J], 崔玉;杨军;詹林盛3.乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达 [J], 田文静;罗学刚;吕丽慧;倪萌;井晓兰;张同存4.乳糖诱导剂促进P450 BM-3在大肠杆菌中可溶性表达的研究 [J], 张彭湃;王松廷5.乳糖诱导重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达 [J], 余永恒;李清雄;王革非;邓远鹏;王贞慧;朱俊铭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

微生物学通报 APR 20, 2009, 36(4): 551~556 Microbiology © 2009 by Institute of Microbiology, CAStongbao@基金项目：国家863计划项目(No. 2006AA06Z322); 国家自然科学基金项目(No. 30800031); 广东省科技攻关项目(No. 2007A020300007);广东省科技计划项目(No. 2007A020903001); 广东省科学院人才基金项目(No. 200601)*通讯作者：Tel: 86-20-87684471; : rensz@ 收稿日期：2009-02-12; 接受日期：2009-02-16摘 要: 本文考察了乳糖代替IPTG 诱导三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性, 分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式进行优化并与IPTG 诱导的差异等方面进行了比较分析, 确定了乳糖诱导的最佳条件。

结果表明, 在工程菌对数生长中期(OD 600约为0.8)添加终浓度为0.4 mmol/L 的乳糖诱导6 h 的条件下能获得最大量的目的蛋白和菌体量。

由于乳糖可以作为碳源被菌体利用, 分批添加乳糖效果优于一次性添加。

乳糖诱导条件下目的蛋白表达量占总蛋白的35.62%, 与IPTG 诱导条件下的35.03%无明显差异。

乳糖诱导后外源蛋白的表达时间有所滞后, 但收获的菌体量高于IPTG 诱导, 显示出了乳糖同样是一种T7启动子的廉价高效诱导剂, 可以代替昂贵的IPTG 用于脱色酶TpmD 的规模化发酵, 同时也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考和借鉴。

关键词: 乳糖诱导, IPTG, TpmD, T7启动子Over-expression of Highly Active Triphenylmethane Dyes Decolorization Enzyme (TpmD) Induced by Lactose Instead of IPTG in Escherichia coli BL21 (DE3)CHEN Liang 1,2,3 REN Sui-Zhou 2,3* XU Mei-Ying 2,3 SUN Guo-Ping 2,3(1. Wuhan institute of Virology , Chinese Academy of Sciences , Wuhan , Hubei 430071, China )(2. Guangdong Institute of Microbiology , Guangzhou , Guangdong 510070, China )(3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application , Guangzhou , Guangdong 510070, China )Abstract: The feasibility of expression of TpmD in recombinant E .coli BL21(DE3) induced by lactose instead of IPTG was investigated. The factors affecting the induction of target gene expression such as the optimal time point for induction, the concentration and addition mode of the inducer (lactose) and the induction time were determined. It is established that the optimal induction method is to add 0.4 mmol/L (final concentration) lactose at the mid-log-phase of cell growth, (OD 600≈0.8) and incubate at552微生物学通报2009, Vol.36, No.4/wswxtbcn37°C for 6 h. It would be better to add the lactose in 4 batches (0.1 mmol/L per batch), because lactose can be used as a carbon source by E. coli BL21(DE3). The production of TpmD enzyme induced by lactose was about 35.62% of the bacterial total protein which was no significantly different from that induced by IPTG(≈35.03%), and the expression of TpmD was a little slower than that induced by IPTG. However, the final biomass induced by lactose was higher than that induced by IPTG. These results suggested that the lactose is as effective as IPTG for T7 promoter induction and should be easily scaled up for industrial production of recombinant protein with lower cost. Keywords: Lactose introduction, IPTG , TpmD, T7 promoter 三苯基甲烷类染料是用量最大的三大类染料之一, 被广泛应用在纺织、印刷、食品、化妆品、医药、皮革、涂料、油墨等多个行业。

一、乳糖操纵子的调控模式大肠杆菌乳糖操纵子(lactose operon)包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。

转录时，RNA聚合酶首先与启动区(promoter,P)结合，通过操纵区(operator,O)向右转录。

转录从O区的中间开始，按Z→Y→A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。

转录的调控是启动区和操纵区进行的。

Z编码β-半乳糖苷酶；Y编码β-半乳糖苷透过酶；A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。

β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。

β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。

β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。

1．酶的诱导-lac体系受调控的证据在不含乳糖及β-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型每个大肠杆功细胞内大约只有1-2个酶分子。

如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。

科学家把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中，随着培养基中诱导物的加入，β-半乳糖苷酶便开始合成。

分离β-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记。

说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。

已经分离在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生lacmRNA的突变体，这种失去调节能力的突变体称为永久型突变体，为分两类：I型和O型。

I型：野生型为I+，突变型为I-O型：野生型为O+，突变型为O c。

I+→I-或O+→O c后，Z、Y、A结构基因均表现为永久表达，所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。

化学与分子生物学复习题库与答案1、下列关于酶的磷酸化叙述错误的是()。

A、磷酸化和去磷酸化都是酶促反应B、磷酸化和去磷酸化可伴有亚基的聚合和解聚C、磷酸化只能使酶变为有活性的形式D、磷酸化反应消耗ATP答案：C:在酶的共价修饰过程中,酶发生无活性(或低活性)与有活性(或高活性)两种形式的互变,磷酸化是共价修饰的一种,可以使酶无活性,也可以使酶有活性。

如磷酸化可使糖原磷酸化酶活性增高,但使糖原合酶活性降低。

2、嘌呤与嘧啶两类核苷酸合成中都需要的酶是()。

A、CTP合成酶B、TMP合成酶C、PRPP合成酶D、氨基甲酰磷酸合成酶答案：C:磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶)是两类核苷酸合成时都需要的。

3、氮杂丝氨酸干扰核苷酸合成是因为它的结构类似于()。

A、丝氨酸B、甘氨酸C、天冬氨酸D、天冬酰胺E、谷氨酰胺答案：E:氮杂丝氨酸属于氨基酸类似物,它的结构与谷氨酰胺相似。

谷氨酰胺是嘌呤核苷酸合成的原料之一,氮杂丝氨酸可干扰谷氨酰胺参与嘌呤核苷酸的合成反应。

4、生物体内氨基酸脱氨基作用的主要方式是()。

A、氧化脱氨基B、还原脱氨基C、直接脱氨基D、转氨基E、联合脱氨基答案：E:脱氨基作用是指氨基酸在酶的催化下脱去氨基生成α-酮酸的过程,是氨基酸在体内分解的主要方式。

参与人体蛋白质合成的氨基酸共有20种,它们的结构不同,脱氨基的方式也不同,主要有氧化脱氨、转氨、联合脱氨和非氧化脱氨等,其中联合脱氨基最为重要。

5、管家基因参与的基因表达方式为()。

A、非特异性表达B、阻遏性表达C、组成性表达D、诱导性表达E、不表达答案：C:管家基因指有些基因在生物个体的几乎所有细胞都持续表达,不易受环境条件的影响。

它们的表达称为组成性表达,又称基本表达。

6、DNA复制之初,参与从超螺旋结构解开双股链的酶或因子是()。

A、解链酶B、拓扑异构酶ⅠC、DNA结合蛋白D、引发前体E、拓扑异构酶Ⅱ答案：A:解链酶的功能是打开DNA的双股链;拓扑异构酶与打开DNA的超螺旋有关。

β-半乳糖苷酶重组大肠杆菌诱导表达条件的研究
陈卫; 张灏; 葛佳佳; 丁霄霖
【期刊名称】《《乳业科学与技术》》
【年(卷),期】2002(025)003
【摘要】β-半乳糖苷酶常用于牛奶中乳糖的水解。

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的高温β-半乳糖苷酶基因经克隆后转入大肠杆菌T7表达系统得到成功表达。

在SOB 培养基上分别以IPTG和乳糖为诱导剂,对重组菌的诱导时机、诱导浓度和诱导长度进行研究,β-半乳糖苷酶比酶活分别达到11.5 U/mg和7.7 U/mg,比酶源菌提高90和60倍。

【总页数】4页(P1-4)
【作者】陈卫; 张灏; 葛佳佳; 丁霄霖
【作者单位】江南大学食品学院江苏无锡 214036
【正文语种】中文
【中图分类】Q556.2;Q786
【相关文献】
1.EGCG-O-甲基转移酶(EOMT)在重组大肠杆菌中的表达条件研究 [J], 费冬梅;林智;吕海鹏;张悦;谭俊峰;郭丽
2.青霉α-半乳糖苷酶基因工程菌表达条件优化 [J], 张波;萧培珍;张宝彤
3.重组大肠杆菌生产硫磺矿硫化叶菌β-半乳糖苷酶发酵条件初步研究 [J], 吴玉飞;钱磊;张帆;陈晟;吴敬
4.β—半乳糖苷酶重组大肠杆菌诱导表达条件的研究 [J], 陈卫; 张灏; 等
5.重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用 [J], 雷清;黄思扬;应莲芳;梁凌宇;马亚茹;蒋琳
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910274647.6(22)申请日 2019.04.08(71)申请人 天津大学地址 300350 天津市津南区海河教育园雅观路135号天津大学北洋园校区(72)发明人 齐崴　尤生萍　苏荣欣　(74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201代理人 李素兰(51)Int.Cl.C12N 1/21(2006.01)C12N 1/38(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 9/02(2006.01)C12N 9/10(2006.01)C12N 9/12(2006.01)C12N 9/48(2006.01)C12N 9/88(2006.01)C12N 9/90(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(54)发明名称富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法(57)摘要本发明公开了富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法。

包括选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌宿主细胞，也包括制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌种子液，还包括接种所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的生物质的培养基，以富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备。

本发明公开的方法是一种富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂制备各类高附加值产品的普适方法，包括蛋白类高附加值产品和代谢类高附加值产品，应用广泛，可操作性强，而且节省了昂贵的诱导剂的添加，可大幅降低生物发酵制备高附加值产品的成本，适于推广应用。

权利要求书2页 说明书7页序列表21页 附图4页CN 110079491 A 2019.08.02C N 110079491A权　利　要　求　书1/2页CN 110079491 A1.富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法，包括下述步骤：1)选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌；2)制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌种子液；3)接种步骤2)中所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的生物质的培养基，以富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备。

重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的摇瓶发酵条件概述：
谷胱甘肽合成酶是一种重要的酶类蛋白，广泛应用于医学、食品、化工等领域。

本文将针对大肠杆菌的摇瓶发酵条件进行重新的优化，以提高谷胱甘肽合成酶的产量。

一、菌株选择及预处理
1.选用具有谷胱甘肽合成能力的大肠杆菌作为研究对象。

2.将菌株预处理后接种到摇瓶中。

二、培养基配制
1.基础培养基的配制：5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、
10g/L葡萄糖、pH=7.2。

2.添加谷氨酰胺、L-半胱氨酸、硫酸镁等微量元素物质以提高谷胱甘肽合成功能。

三、发酵条件
1.发酵时间：选用24h、36h、48h等不同时间段进行观察和分析。

2.发酵温度：30℃、37℃、40℃等不同温度对菌株的产量影响。

3.振荡频率：发酵过程中的振荡频率可以促进氧气的输送，增加菌体的代谢效率。

四、收获和分析
1.收集并离心菌体，进行酶与蛋白质的提取。

2.利用SDS-PAGE对蛋白质进行检测，观察酶蛋白的表达情况。

3.利用UV-Vis光谱对酶活性进行检测，分析不同条件下产量的影响。

五、总结
上述方法有效地优化了大肠杆菌合成谷胱甘肽酶的生产条件，提高了酶的产量和活性，为谷胱甘肽合成酶的实际应用提供了有力保证。

此方法对于其他生物酶的生产也有一定的参考价值。