PCR及其衍生技术

高或偏低），就会引起错配
– 高浓度的dNTP可与Mg2+结合，使游离的
Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性
4、模板DNA
模板DNA的来源： —微生物中提取DNA —从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛
发、精斑、口腔上皮细胞
—固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化
模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系
MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温
度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增
更特异；
⑧ 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高 扩增的பைடு நூலகம்异性。
PCR技术的主要类型
（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：
（2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：
1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶 应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩 增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。
1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项 发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。
PCR的基本原理
试管中进行的DNA复制反应，依据 ①DNA半保留复制的机理； ②体外DNA分子于不同温度下可变性和复性 的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 ①双链DNA变成单链， ②单链DNA与人工合成的引物退火， ③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双 链DNA。
① 变性温度与时间： • 一般93℃～94℃，1min足以使模板变性
– 若低于93℃则需延长时间 – 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。
② 退火(复性)温度与时间： • 退火温度是影响PCR特异性的重要因素 • 退火温度与时间，取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的 长度 • 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引 物，55℃作为选择最适退火温度的起点 较为理想
引物设计的原则
基本原则是最大限度地提高扩增效率和特
异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。
①引物长度： 15-30bp，常用20bp左右
— 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适 延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度 （74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：以500bp为宜
—PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 —模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加
5、Mg2+浓度
• Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响 • 在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 • Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现 非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少
（ 3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)： （ 4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)： （5）巢式PCR技术(NEST-PCR)： （6）多重PCR技术(multiplex PCR)：
（7）重组PCR技术：
（8）原位PCR技术： （9）荧光定量实时PCR技术ＰＣＲ 技术
引物的复性温度
通过以下公式帮助选择合适的温度：
• Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T) • 复性温度=Tm值－（5～10℃）
– 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提 高PCR反应的特异性
• 复性时间一般为30～60s，足以使引物与 模板之间完全结合
第十一章 聚合酶链反应 PCR及其衍生技术
PCR的用途
体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特
异地扩增目的DNA片段。
能通过试管内的数小时反应将特定的DNA 片段扩增数百万倍。 迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生 物学研究提供了强大的工具。
发展历程
1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋 结构及半保留复制模型。 1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA 半保留复制模型。 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建 立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技 术，二是体外扩增技术。
— 特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜
— G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非 特异条带
— ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或 嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3 个连续 的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区 引发错 误延伸
④避免引物内部出现二级结构和引物间互补
③ 延伸温度与时间： • Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行
③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间
– 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
如何提高PCR扩增的特异性？
•升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性； •缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的 DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会； •降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其 是能减少引物二聚体的引发； •改变Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性。
⑤ 引物设计的特异性； ⑥ 减少循环次数； ⑦ 热启动（Hot Start）。即首先将模板变性，然后 在 较 高 温 度 时 加 入 Taq DNA 聚 合 酶 、 引 物 及
二、PCR 的反应流程
1. 温度与时间的设臵
2. 循环次数 3. 常见问题
1、温度与时间的设臵 • 设臵变性-退火-延伸三个温度点 • 标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在90～95℃变性，再迅速冷却至40～ 60℃退火，然后快速升温至70～75℃延 伸， • 对于较短靶基因（长度100～300bp）可 采用二温度点法， 将退火与延伸温度合 二为一，一般采用94℃变性，65℃左右 退火与延伸。
（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：
反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一 种方法。 ①一种在已知序列中无 切点的限制性 内切酶消化基因组DNA。 ②酶切片段自身环化。 ③以环化的DNA作为模板，用一对与已 知序列两端特异性结合的引物，扩增夹 在中间的未知序列。 扩增产物是线性的DNA片段，大 小取决于上述限制性内切酶在已知基闲 侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。 用不同的限制性内切酶消化，可以得到 大小不同的模板DNA，再通过反向 PCR获得未知片段 。
待扩增片段
高温变性
低温退火
中温延伸
PCR每一步的转换通过温度的改变控制。 DNA模板解链（变性）、引物与模板结合 （退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合 成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个 循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速 扩增。
理论扩增率： 2n 递 增（n为循环次数 ）， 25～30循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩 增率，平均约为75%。
由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因 素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为 线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩 增倍数一般可达106～107。 以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR 一轮循环。
PCR扩增曲线
PCR 反应体系与流程
反应体系 模板（DNA或RNA） 引物 Taq DNA聚合酶 10×PCR缓冲液 1.5～4 mM Mg2+ 0.2 mM dNTP 反应流程
预变性
变性
退火
延伸
25～35 循环
延伸完全
终止
一、PCR 的反应体系
1. 引物（primer）
2. 酶 （Taq DNA polymerase）
3. dNTP
4. 模板 （template） 5. Mg2+ （magnesium）
1、引物
引物：决定PCR反应的特异性
PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序 列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做 引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大 量扩增
1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年 诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与 合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并 不断重复该过程便可克隆tRNA基因。” 核酸体外扩增最早设想被遗忘原因: （1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物； （2）1970年Smith等发现了II型限制性内切 酶，体外克隆基因已成为可能。
目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应
– 天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯
– 基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成 产物量减少
Taq 酶的保真性不高 • 5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，
– 主要取决于模板DNA的浓度
• 循环次数：选在30～40次之间
• 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之 增多
如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？
•在PCR反应体系中，除使用Taq DNA聚合酶，掺入 少量的具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶，如 Pfu，Vent，Pwo等，错配率可降为原来的 1/10； •Mg2+浓度尽可能低，但不影响DNA合成； •减少高温反应时间，这样DNA热损伤将减少； •减少循环数。
无3’→5’外切活性;
• 在PCR反应中如发生某些碱基的错配， 该酶是没有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。