pcr技术及其应用 ppt课件汇编

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PCR技术教程PPT课件

Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循环
56℃ 72℃
退火延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
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循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
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特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性，不
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原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析的方法。

PCR技术的基本原理及应用 ppt课件

11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
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B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
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2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel

PCR技术的原理与应用ppt课件

2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ：锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物，另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等。

PCR技术及其延伸与应用PPT课件

精选ppt课件2021
5
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
精选ppt课件2021
6
诊断遗传疾病
精选ppt课件2021
7
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的
Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸 • Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的，扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一
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8
• 高度敏感：
• dNTP贮备液 • DNA模板
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11
操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
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12
PCR反应基本条件及其对PCR的影响
• 100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳， • Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的
精选ppt课件2021
14
缓冲液
• 缓冲液的目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。
• 目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (Tris是一种双极性离子缓冲液，pH变化于6.8-7.8之间。将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。

PCR技术及其应用ppt课件

5’-primer: stem-loop structure with high melting temperature
最新版整理ppt
12
Primer Design: avoid failure of amplification High difference between product and primer melting temperatures.
最新版整理ppt
19
Frequently used PCR methods Real-Time PCR (quantitative PCR)
Detect fluorescence for each cycle Quantitaive by amplification curve Quanlity control
最新版整理pptmp; stages
Initialization step Denaturation step
20~40 Cycles
Annealing step
Elongation step
Final elongation
Final hold
最新版整理ppt
Exponential amplification Leveling off stage Plateau
医学分子细胞生物学研究方法
PCR技术在医学中的应用
最新版整理ppt
1
What is PCR Why do PCR How to PCR
最新版整理ppt
2
polymerase chain reaction (PCR)
Developed in 1983 by Kary Mullis
最新版整理19pp9t 3年的诺贝尔化学奖

PCR-技术及应用PPT课件

dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好，引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用临床医学法医学农业考古学人类学环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不对称 PCR 的目的是扩增产生特异长度的单链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。

PCR技术ppt课件

组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念：通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤：（1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA

PCR技术的应用ppt课件

PCR技术的应用
.
1、PCR技术在分子生物学中的应用
.
一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生物学研究中必不可少的手段。运用PCR技术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切步骤。
.
二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容易地实现这一目的。
.
三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定位于两个引物之间的序列。
●
由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
●
.
5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。

pcr技术ppt课件

在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的合作者Michael Smith在《科学》杂志上首次公开描述了PCR方法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后

PCR技术的原理及其应用 ppt课件

③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
7
模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
6
酶浓度：催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
12
反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

PCR临床应用ppt演示课件

一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
.
22
HBV
（二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。
四 TORCH感染特点与检测
TOX : Toxoplasma gondii
RV:
CMV:
Rubella virus
Human cytomegalovirus
HSV:
Herpes simplex virus
.
51
TORCH
TORCH感染特点
1. 母-胎传播的主要病原体 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因 3. 自然状态下呈隐性感染 4. 怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染 5. 可致多发性、全身性感染 6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防
3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展
4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持久，再感染和慢性患者普遍存在。
5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎
. 32
CT
沙眼衣原体感染与致病
1. 严格的细胞内寄生。 2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要病原体。 3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居STD之首。
TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia
MP：Mycoplasmal pneumonia

《PCR技术及应用》PPT课件

•引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
2021/6/10
46
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47
2021/6/10
48
2021/6/10
49
Excitation
SYBR-Green I
5’
SG SG
3’
Emission
SG
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3’
SG
5’
SG
50
SYBR-Green I
DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。
Taq 酶模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

PCR技术PPT课件

一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):

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第1轮结束第2轮开始
PCR的基本原理 • Ta•q
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增第2轮扩增
PCR的基本原理
•第3P轮CR反扩应增条件
• PCR过程 • PCR的特点
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性低温退火适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
形成 2 条变单性链
DNA
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段扩增100万倍以上
3’
5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记
PCR反应条件
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
• 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
DNA ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
• 对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA
引物设计：
（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源
序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
1.5mmol/L
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性低温退火适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
形成 2 条变单性链
DNA
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段扩增100万倍以上12 Nhomakorabea3
周俊宜基础医学院生化教研室
目录
PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
• PCR的特点
Taq酶引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
DNA ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
RNA引物
合成引物
RNA引物
5引‘A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
生物样品 DNA片段
基基基法人因因因医类诊治工学学断疗程检研
产测究品
……
基因组DNA
获取特定DNA片段扩增特定片段
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
• 简便、快速
DNA
DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的
测序技术
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活性 60
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
40
20
40 50 60 70 80 90
100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物引物模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u