Liposome脂质体表征
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中药脂质体摘要:药物治疗是肿瘤治疗的重要手段之一,但目前的一线化疗药物因为其毒性作用及多药耐药性限制了其临床应用。
而新型抗癌药物成本高昂、研发周期过长,无法满足临床需要。
因此利用新的剂型如脂质体,以提高药物疗效、降低毒性作用成为了研究的热点关键词:脂质体、肿瘤、靶向性、化疗脂质体(liposomes)是一种类似于生物膜结构的双分子层微小囊泡,可以包裹水溶性和脂溶性药物,主要材料是磷脂和胆固醇。
在给药系统研究领域中,脂质体非常引人瞩目,一是因为所用材料磷脂和胆固醇是生物细胞膜的主要成分,是机体内源性物质,具有良好的生物相容性和可降解性,无毒无免疫原性;二是脂质体的组成结构和生物细胞相似,易与细胞发生吸附、融合、脂交换、内吞而被细胞摄取;三是具有一定的弹性和变形性,比相同粒径的其他类型的纳米粒容易进入病灶组织,如透过肿瘤组织的毛细血管壁进入肿瘤组织[1]。
此外,脂质体表面还很容易进行修饰,如用聚乙二醇(PEG)修饰的长循环脂质体,用对特定组织或细胞有特异结合性的配基进行修饰的主动靶向脂质体,双层脂膜掺入胆酸盐之后形成的柔性脂质体,以及掺入带碱性脂质成分制备的用于基因转染的阳离子脂质体等[2]。
通过选用合适的磷脂成分以及调整磷脂成分、胆固醇的用量比例,还可以制备pH敏感、热敏感的脂质体,利用病变局部pH、温度等的改变而在该处选择性释放药物。
大量试验证据表明,脂质体作为药物载体,具有可以提高药物治疗指数、降低药物毒性、减少副作用、具有靶向性、可缓释长效以减少药物剂量、具脂质体细胞亲和性和组织相容性等特点。
中药脂质体的疗效是由脂质体所包裹的中药成分所决定的,目前脂质体主要用于包裹毒性大、不稳定或吸收效果差的中药,中药脂质体在抗癌、抗菌、免疫调节、酶系统疾病治疗、镇静方面以及肝炎治疗中都有所应用[3]。
脂质体具有的独特分子结构和理化性质使其具有如下特点:①靶向性。
脂质体能选择性地分布于人体内某些组织和器官,俗称药物导弹。
外源基因进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。
电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。
但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系,因为需要转染的细胞量大,所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天,以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时,细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1:240ul 无血清培养基+ 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)3、溶液2:X ul 无血清培养基+ 4 ug 质粒per well(总体积250 ul)4、将溶液1与溶液2混合,室温下置20min。
5、与此同时,将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后,加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中,摇动培养板,轻轻混匀。
药物制剂与药品质量控制虾青素脂质体的制备与表征∗杨安平ꎬ顾斯颖ꎬ梁一俊ꎬ杜卓(佛山科学技术学院医药工程学院ꎬ佛山㊀528000)摘㊀要㊀目的㊀探讨乙醇注入法制备虾青素脂质体的处方与工艺ꎮ方法㊀采用乙醇注入法制备虾青素脂质体ꎬ以脂质体包封率为考察指标ꎬ运用单因素实验与正交实验筛选虾青素脂质体的处方与工艺ꎬ并对按优选处方与工艺制备的虾青素脂质体进行表征ꎮ结果㊀虾青素脂质体最佳处方与工艺:脂药比为40 1㊁磷脂与胆固醇的质量比为20 1㊁水合介质pH值为7.0㊁温度为60ħꎬ平均包封率为(35.28ʃ0.93)%ꎬ平均粒径为143.2nmꎮ结论㊀乙醇注入法制备虾青素脂质体工艺简单ꎬ适合于工业化制备虾青素脂质体ꎮ关键词㊀虾青素ꎻ脂质体ꎻ乙醇注入法ꎻ包封率中图分类号㊀R944.9ꎻTQ460.6㊀㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀㊀文章编号㊀1004-0781(2020)09-1276-05DOI㊀10.3870/j.issn.1004 ̄0781.2020.09.018㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(OSID)PreparationandCharacterizationofAstaxanthinLiposomeYANGAnpingꎬGUSiyingꎬLIANGYijunꎬDUZhuo(SchoolofPharmaceuticalEngineeringꎬFoshanUniversityꎬFoshan528000ꎬChina)ABSTRACT㊀Objective㊀Toinvestigatetheprescriptionandprocessofastaxanthinliposomebyethanolinjectionmethod.㊀Methods㊀Astaxanthinliposomewaspreparedbyethanolinjection.Encapsulationefficiencywastakenasindextoscreentheprescriptionandprocessofastaxanthinliposomebysinglefactortestandorthogonaltest.Thecharacterizationofastaxanthinliposomewasmeasured.㊀Results㊀Theoptimalprescriptionandprocesswereasfollowed:theratiooflipidstoastaxanthinwas40 1ꎻtheratioofphospholipidtocholesterolwas20 1ꎻpHofhydrationmediumwere7.0.Thetemperaturewas60ħ.Averageencapsulationefficiencywas(35.28ʃ0.93)%andmeanparticlesizewasabout143.2nm.㊀Conclusion㊀Theprocessofastaxanthinliposomepreparedbyethanolinjectionmethodissimpleꎬandsuitableforindustrialmanufacture.KEYWORDS㊀AstaxanthinꎻLiposomeꎻEthanolinjectionmethodꎻEncapsulationefficiency㊀㊀虾青素(astaxanthin)为一种具有13个共轭双键的酮式脂溶性类胡萝卜素ꎬ主要存在于藻类㊁酵母㊁甲壳类动物和鱼类表皮中ꎬ具有较强的抗氧化能力[1 ̄2]ꎬ因结构不稳定㊁水溶性差及生物利用度低等特点影响其应用ꎮ有学者通过微囊化[3]㊁纳米乳液化[4]等方法来改善其缺点ꎬ但效果不明显ꎮ脂质体(liposome)是一种类似细胞膜结构的双分子层微小囊泡ꎬ药物被脂质体包裹后ꎬ可以提高药物稳定性ꎬ改善水溶性ꎬ增加生物利用度[5 ̄7]ꎮ有学者将番茄红素㊁β ̄胡萝卜素和叶黄素等类胡萝卜素成分通过收稿日期㊀2019-12-19㊀修回日期㊀2020-04-20基金项目㊀∗国家自然科学基金资助项目(81901881)ꎻ广东省社会发展领域科技计划项目(0903129)ꎮ作者简介㊀杨安平(1973-)ꎬ男ꎬ安徽和县人ꎬ副教授ꎬ硕士ꎬ研究方向:药物新制剂与新剂型ꎮORCID:0000 ̄0001 ̄8570 ̄8515ꎮ电话:0757-82815259ꎬE ̄mail:914559936@qq.comꎮ通信作者㊀杜卓(1977-)ꎬ男ꎬ湖南长沙人ꎬ副教授ꎬ博士ꎬ研究方向:天然药物新型制剂研发ꎮORCID:0000 ̄0001 ̄9978 ̄8739ꎮ电话:0757-82836985ꎬE ̄mail:duzhuo@mail3.sysu.edu.cnꎮ制成脂质体的方法[8 ̄10]来改善其溶解性㊁稳定性及生物利用度ꎮ刘媛等[11 ̄12]使用乳化蒸发 ̄低温固化法制备虾青素脂质体用于皮肤伤口愈合的治疗ꎬ但制备方法复杂ꎬ难以产业化ꎮ本研究拟采用乙醇注入法制备虾青素脂质体ꎬ探究其最佳处方与工艺并进行质量评价ꎬ具体研究结果报道如下ꎮ1㊀仪器与材料㊀1.1㊀仪器㊀手掌式医用离心机(江苏新康医疗器械有限公司ꎬ型号:XK ̄1200型)ꎬ超声波清洗机(深圳钰洁清洗设备有限公司ꎬ型号:F ̄060)ꎬ电子分析天平(常熟市双杰测试仪器厂ꎬ型号:JJ124BFꎬd=0.1mg)ꎬ高效液相色谱仪(北京钢臣科技有限公司ꎬUV3000型紫外可见光检测器ꎬ型号:LC3000)ꎬ柱温箱(大连日普利科技仪器有限公司ꎬ型号:RPL ̄D2000)ꎬ纳米粒度及ZETA电位仪(英国马尔文公司ꎬ型号:NANOZS90)ꎮ1.2㊀材料㊀虾青素对照品(上海麦克林有限公司ꎬ含量:96%ꎬ批号:201424)ꎬ胆固醇[艾伟拓(上海)医药科技有限公司ꎬ批号:B61251]ꎬ大豆磷脂[艾伟拓(上海)医药科技有限公司ꎬ批号:SY ̄SI ̄180101]ꎬ甲醇(西陇科学股份有限公司ꎬ色谱纯)ꎬ纯化水(实验室自制)ꎬ其余试剂均为分析纯ꎮ2㊀方法㊀2.1㊀虾青素脂质体的制备㊀称取处方量的磷脂㊁胆固醇㊁虾青素溶入10mL乙醇中ꎬ用注射器匀速缓慢注入水合介质(0.01mol mL-1磷酸盐缓冲液)中ꎬ恒温水浴加热ꎬ并搅拌至乙醇完全蒸发ꎬ超声10minꎬ用孔径0.45μm微孔滤膜滤过ꎬ即得橙红色澄清透明的虾青素脂质体液体ꎬ冰箱4ħ冷藏避光保存ꎮ2.2㊀处方设计与筛选㊀以脂质体包封率为评价指标ꎬ通过单因素实验ꎬ观察脂药比㊁磷脂与胆固醇的质量比㊁水合介质pH值㊁水合介质用量㊁温度5个因素对脂质体包封率的影响ꎬ选出影响脂质体包封率的最不明确4个因素㊁3个水平进行正交实验ꎬ优选最佳处方与工艺ꎬ并按最优处方与工艺制备虾青素脂质体5批ꎮ2.3㊀含量测定㊀2.3.1㊀色谱条件㊀参考文献[13]的方法ꎬ色谱柱为Kromasil(250mmˑ4.6mmꎬ5μm)ꎬ流动相为甲醇 ̄水(95 5)ꎬ流速为1.0mL min-1ꎬ柱温30ħꎬ检测波长为475nmꎬ进样量20μLꎮ2.3.2㊀标准曲线的制备㊀精密称取虾青素对照品5mgꎬ用甲醇溶解并定容在50mL棕色量瓶中ꎬ得0.1mg mL-1虾青素对照品母液ꎮ精密吸取不同量的虾青素对照品母液ꎬ制成0.001ꎬ0.002ꎬ0.003和0.004mg mL-1的虾青素溶液ꎬ按 2.3.1 项下色谱条件进行测定ꎬ以虾青素溶液浓度为横坐标ꎬ峰面积为纵坐标进行线性回归ꎬ得标准曲线方程:Y=228860150X+14761.2(R2=0.999)ꎮ2.3.3㊀包封率的测定㊀参考文献[14]介绍的方法ꎬ吸取制备好虾青素脂质体液体1mLꎬ用甲醇稀释至10mLꎬ按 2.3.1 项下色谱条件进行测定ꎬ计算虾青素的浓度(C0)ꎻ吸取制备好虾青素脂质体液体1mLꎬ用甲醇稀释至10mLꎬ超声破乳2minꎬ以10000r min-1离心10min(r=1.8cm)ꎬ取上清液按 2.3.1 项下色谱条件进行测定ꎬ计算虾青素的浓度(C1)ꎬ根据下式计算包封率(EE):EE(%)=(C1/C0)ˑ100%ꎮ式中ꎬC1为包封在脂质体中的虾青素质量浓度ꎬC0为脂质体中虾青素的总质量浓度ꎮ2.4㊀最优处方虾青素脂质体的表征检测㊀2.4.1㊀虾青素脂质体形态㊀取最优处方虾青素脂质体加水合介质稀释250倍ꎬ吸取适量样品至碳支持膜的铜网ꎬ滴加2%磷钨酸负染ꎬ晾干ꎬ透射电镜拍摄不同放大倍数下的虾青素脂质体ꎬ并观察虾青素脂质体的显微形态ꎮ2.4.2㊀虾青素脂质体粒径㊀取最优处方虾青素脂质体加水合介质稀释100倍ꎬ在室温25ħ下ꎬ使用NANOZS90纳米粒度仪测得虾青素脂质体的平均粒径和粒径分布ꎮ3㊀结果㊀3.1㊀单因素筛选实验㊀3.1.1㊀脂药比对包封率的影响㊀按 2.1 项的方法制备虾青素脂质体ꎬ其他条件不变ꎬ考察脂药比分别为10 1ꎬ20 1ꎬ30 1ꎬ40 1ꎬ50 1时对脂质体包封率的影响ꎮ结果显示ꎬ不同脂药比所得的脂质体包封率分别为11.24%ꎬ14.68%ꎬ18.01%ꎬ19.46%ꎬ19.01%ꎬ结果见图1ꎮ图1㊀脂药比对脂质体包封率的影响㊀Fig.1㊀Effectoftheratiooflipidstoastaxanthinontheencapsulationefficiencyoftheliposome㊀3.1.2㊀磷脂与胆固醇的质量比对包封率的影响㊀按 2.1 项的方法制备虾青素脂质体ꎬ其他条件不变ꎬ考察磷脂与胆固醇质量比分别为25 1ꎬ20 1ꎬ15 1ꎬ10 1ꎬ5 1时对脂质体包封率的影响ꎮ结果显示ꎬ不同磷脂与胆固醇质量比所得的脂质体包封率分别为14.95%ꎬ15.34%ꎬ20.38%ꎬ18.45%ꎬ18.30%ꎬ结果见图2ꎮ㊀㊀图2㊀磷脂与胆固醇的质量比对脂质体包封率的影响㊀Fig.2㊀Effectoftheratioofphospholipidtocholesterolontheencapsulationefficiencyoftheliposome㊀3.1.3㊀水合介质pH值对包封率的影响㊀按 2.1 项的方法制备虾青素脂质体ꎬ其他条件不变ꎬ考察水合介质pH值分别为6.0ꎬ6.5ꎬ7.0ꎬ7.4ꎬ8.0时对脂质体包封率的影响ꎮ结果显示ꎬ不同水合介质pH值所得的脂质体包封率分别为19.42%ꎬ19.86%ꎬ22.26%ꎬ20.87%ꎬ18.44%ꎬ结果见图3ꎮ图3㊀水合介质pH值对脂质体包封率的影响㊀Fig.3㊀EffectofpHvalueofhydrationmediumontheencapsulationefficiencyoftheliposome㊀3.1.4㊀水合介质用量对包封率的影响㊀按 2.1 项的方法制备虾青素脂质体ꎬ其他条件不变ꎬ考察水合介质用量分别为10ꎬ20ꎬ30ꎬ40ꎬ50mL时对脂质体包封率的影响ꎮ结果显示ꎬ不同水合介质用量所得的脂质体包封率分别为7.12%ꎬ19.13%ꎬ18.10%ꎬ16.56%ꎬ15.10%ꎬ结果见图4ꎮ图4㊀水合介质用量对脂质体包封率的影响㊀Fig.4㊀Effectoftheamountofhydrationmediumontheencapsulationefficiencyoftheliposome㊀3.1.5㊀温度对包封率的影响㊀按 2.1 项方法制备虾青素脂质体ꎬ其他条件不变ꎬ考察水浴温度分别为45ꎬ50ꎬ55ꎬ60ꎬ65ħ时对脂质体包封率的影响ꎮ结果显示ꎬ不同水合介质温度所得的脂质体包封率分别为15.62%ꎬ19.76%ꎬ22.46%ꎬ22.37%ꎬ15.58%ꎬ结果见图5ꎮ3.2㊀正交实验㊀根据单因素实验结果ꎬ选择脂药比(A)㊁磷脂与胆固醇的质量比(B)㊁水合介质pH值(C)㊁温度(D)4个因素ꎬ各选取3个水平进行L9(34)正交设计实验ꎬ结果见表1~3ꎮ图5㊀温度对脂质体包封率的影响㊀Fig.5㊀Effectoftemperatureontheencapsulationefficiencyoftheliposome㊀表1㊀正交实验因素水平㊀Tab.1㊀Levelsandfactorsoforthogonaltest㊀水平脂药比(A)磷脂与胆固醇质量比(B)水合介质pH值(C)温度(D)/ħ130 120 16.550240 115 17.055350 110 17.460表2㊀正交实验设计及结果㊀Tab.2㊀Designandresultsoforthogonaltest㊀编号脂药比(A)磷脂与胆固醇的质量比(B)水合介质pH值(C)温度(D)/ħ包封率/%1111125.282122219.293133330.044212335.595223122.846231221.197313220.538321320.939332126.48K124.87027.13322.46724.867K226.54021.02027.12020.337K322.64725.90324.47028.853R3.8936.1134.6538.516表3㊀正交实验方差分析㊀Tab.3㊀Varianceanalysisoforthogonaltest㊀因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性(P)脂药比(A)22.89021.00019.000磷脂与胆固醇质量比(B)62.73322.74119.000>0.05水合介质pH值(C)32.68921.42819.000>0.05温度(D)108.94824.76019.000>0.05误差22.8902由表2直观分析与表3方差分析可知ꎬ极差R的大小顺序为:D(温度)>B(磷脂与胆固醇的质量比)>C(水合介质pH值)>A(脂药比)ꎬ由于因素A的极差与离差平方和最小ꎬ作为误差项ꎬ经过方差分析ꎬ因素A(脂药比)㊁C(水合介质pH值)㊁D(温度)对实验结果影响差异无统计学意义(P>0.05)ꎮ综合直观分析和方差分析结果ꎬ确定虾青素脂质体制备处方与工艺为A2B1C2D3ꎬ即脂药比40 1ꎬ磷脂与胆固醇的质量比20 1ꎬ水合介质pH值为7.0ꎬ温度为60ħꎮ3.3㊀最佳工艺验证㊀精密称量磷脂80mg㊁胆固醇4mg㊁虾青素2mgꎬ溶入10mL乙醇中ꎬ用注射器匀速缓慢注入0.01mol mL-1磷酸盐缓冲液20mL中ꎬ60ħ恒温水浴加热ꎬ搅拌至乙醇完全蒸发ꎬ超声10minꎬ用孔径0.45μm微孔滤膜过滤ꎬ即得橙红色澄清透明的虾青素脂质体液体ꎬ重复制备5批次ꎬ并测定脂质体批次包封率分别为33.68%ꎬ35.62%ꎬ35.74%ꎬ34.96%ꎬ36.42%ꎬ平均包封率为(35.28ʃ0.93)%ꎮ3.4㊀最优处方虾青素脂质体的表征检测㊀3.3.1㊀形态观察㊀按最优处方制备虾青素脂质体在1μm的标尺下可观察到许多类球形的物质ꎬ分布均匀ꎬ结果见图6ꎻ放大到200nm的标尺ꎬ可清晰观察到脂质体的形态ꎬ外层包裹内层ꎬ结果见图7ꎮ㊀㊀图6㊀虾青素脂质体透射电镜图(标尺:1μm)㊀Fig.6㊀Transmissionelectronmicroscopeimageofastaxanthinliposome(Scale:1μm)㊀㊀㊀图7㊀虾青素脂质体透射电镜图(标尺:200nm)㊀Fig.7㊀Transmissionelectronmicroscopeimageofastaxanthinliposome(Scale:200nm)㊀3.3.2㊀粒径检测㊀按最优处方与工艺制备虾青素脂质体的平均粒径为143.2nmꎬPDI值为0.199ꎬ粒径大小分布呈正态分布ꎬ见图8ꎮ图8㊀虾青素脂质体的粒径分布㊀Fig.8㊀Particlesizedistributionofofastaxanthinliposome4㊀讨论㊀虾青素的化学名称为3ꎬ3' ̄二羟基 ̄4ꎬ4 ̄二酮基 ̄βꎬβ' ̄胡萝卜素ꎬ由位于两侧的羟基和羰基取代的紫罗兰酮环和中间多聚烯链组成ꎬ具有多个共轭双键的萜烯基团化合物ꎬ对光㊁氧㊁温度等因素极易敏感ꎬ容易发生全反式虾青素向9 ̄顺式或13 ̄顺式异构体反应与环氧化㊁羟基化化学降解反应而出现褪色㊁生物活性降低㊁甚至失去生物活性等[15]ꎮ此外ꎬ虾青素不溶于水ꎬ也影响其生物利用度ꎮ为了提高稳定性㊁改善溶解性㊁提高生物利用度ꎬ已有研究将虾青素制成脂溶性制剂㊁包合物㊁微囊㊁纳米制剂等[16]ꎮ脂质体是一种将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体ꎮ药物被包裹后ꎬ与外界氧㊁光隔离ꎬ可增加药物的稳定性ꎬ同时ꎬ药物制成脂质体后ꎬ脂质体的粒径较小ꎬ特别是粒径小于100nm的纳米脂质体ꎬ易分散在水中ꎬ对药物起到增溶效果ꎮ因此ꎬ将虾青素制成脂质体ꎬ在稳定性㊁溶解度和生物利用度方面会有效改善ꎮ脂质体的制备方法主要有乙醇注入法㊁反向蒸发法㊁薄膜分散法㊁超声分散法㊁冷冻干燥法㊁超临界二氧化碳法㊁微乳法㊁薄膜挤压 ̄硫酸铵梯度法㊁薄膜分散 ̄机械振荡法等[17]ꎬ其中乙醇注入法操作简便ꎬ不使用毒性较大的有机试剂ꎬ可用于工业化生产ꎮ本实验研究采用乙醇注入法制备的虾青素制成脂质体平均粒径为143.2nmꎬ虽大于100nmꎬ但在水中也是易均匀分散ꎬ同时通过稳定性实验ꎬ虾青素制成脂质体后在50ħ水浴加热3h的降解率为3.36%ꎬ比游离虾青素在50ħ水浴加热3h的降解率33.82%提高近10倍ꎬ本实验研究制备的虾青素脂质体包封率仅约为35.28%ꎬ还有很大提升空间ꎮ下一步可继续研究ꎬ将虾青素脂质体制成冻干制剂ꎬ解决液态脂质体易发生聚集㊁融合㊁磷脂氧化ꎬ最终导致包裹的药物泄露的稳定性差问题[18]ꎬ增加虾青素脂质体的稳定性ꎬ结合超声制备出粒径更小㊁包封率更大的虾青素脂质体ꎬ推动其市场应用ꎮ参考文献[1]㊀姜燕蓉ꎬ刘锴锴ꎬ齐筱莹ꎬ等.虾青素的生物功效及其运载体系的研究现状[J].食品与发酵工业ꎬ2019ꎬ45(13):250-256.[2]㊀莫镜池ꎬ李晓芬ꎬ熊华斌ꎬ等.虾青素清除ABTS自由基的紫外 ̄可见吸收光谱研究[J].食品工业ꎬ2018ꎬ39(3):94-97.[3]㊀FENGZZꎬLIMYꎬWANGYTꎬetal.Astaxanthinfromphaffiarhodozyma:microencapsulationwithcarboxymethylcellulosesodiumandmicrocrystallinecelluloseandeffectsofmicroencapsulatedastaxanthinonyogurtproperties[J].LWT ̄FoodSciTechnolꎬ2018ꎬ96:152-160. [4]㊀周庆新ꎬ杨鲁ꎬ徐杰ꎬ等.虾青素运载体系设计的研究进展与思考[J].包装与食品机械ꎬ2017ꎬ35(4):55-61. [5]㊀徐勇军ꎬ马波ꎬ乔建斌ꎬ等.脂质体结构的影响因素[J].昆明医学院学报ꎬ2012ꎬ33(S1):209-213. [6]㊀孙欣欣ꎬ金楠.脂质体研究进展[J].医学研究杂志ꎬ2009ꎬ38(12):20-21ꎬ136.[7]㊀张志勤ꎬ郭珉ꎬ王栋.茶多酚脂质体研究进展[J].辽宁中医药大学学报ꎬ2012ꎬ14(2):215-217.[8]㊀焦岩ꎬ李大婧ꎬ刘春泉ꎬ等.叶黄素纳米脂质体的制备工艺优化及其氧化稳定性[J].食品科学ꎬ2017ꎬ38(18):259-265.[9]㊀陶姝颖ꎬ明建.虾青素的功能特性及其在功能食品中的应用研究进展[J].食品工业ꎬ2012ꎬ33(8):110-115. [10]㊀孔祥辉.番茄红素脂质体的制备及其生物利用率的研究[D].无锡:江南大学ꎬ2009:8-12.[11]㊀李福民ꎬ刘媛ꎬ廖金凤ꎬ等.虾青素脂质体对小鼠皮肤紫外线损伤干预机制的初步研究[J].四川大学学报(医学版)ꎬ2018ꎬ49(5):712-715.[12]㊀刘媛.虾青素脂质体对UVB致小鼠皮肤光损伤保护作用的初步研究[D].泸州:西南医科大学ꎬ2016:12-13. [13]㊀饶毅ꎬ曾恋情ꎬ魏惠珍ꎬ等.高效液相法测定虾青素的含量[J].江西中医药大学学报ꎬ2014ꎬ26(5):79-81. [14]㊀陈春亮ꎬ匡长春ꎬ陈志龙ꎬ等.NGR肽修饰的声敏脂质体制备与表征[J].医药导报ꎬ2020ꎬ39(2):208-211. [15]㊀彭宇ꎬ任晓丽ꎬ陈林ꎬ等.虾青素制剂技术及其对虾青素稳定性影响的研究进展[J].中国油脂ꎬ2019ꎬ44(4):115-121.[16]㊀潘丽ꎬ常振刚ꎬ陈娟ꎬ等.虾青素的生理功能及其制剂技术的研究进展[J].河南工业大学学报(自然科学版)ꎬ2019ꎬ40(6):123-129.[17]㊀侯丽芬ꎬ谷克仁ꎬ吴永辉.不同制剂脂质体制备方法的研究进展[J].河南工业大学学报(自然科学版)ꎬ2016ꎬ37(5):118-124.[18]㊀邓振雪ꎬ张石ꎬ解雨婷ꎬ等.16 ̄妊娠双烯醇酮脂质体冻干制剂的制备与质量评价[J].医药导报2015ꎬ34(3):365-370.。
脂质体的组成和结构磷脂类:包括天然磷脂和合成磷脂二类。
磷脂的结构特点为一个磷酸基和一个季铵盐基组成的亲水性基团,以及由两个较长的烃基组成的亲脂性基团脂质体(liposome)是一种人工膜。
在水中磷脂分子亲水头部插入水中,脂质体疏水尾部伸向空气,搅动后形成双层脂分子的球形脂质体,直径25~1000nm不等。
脂质体可用于转基因,或制备的药物,利用脂质体可以和细胞膜融合的特点,将药物送入细胞内部生物学定义:当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时,分子的疏水尾部倾向于聚集在一起,避开水相,而亲水头部暴露在水相,形成具有双分子层结构的的封闭囊泡,称为脂质体。
药剂学定义脂质体 (liposome): 系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。
磷脂是构成脂质体的主要化学成分,其中最具有代表性的是卵磷脂。
卵磷脂主要来自蛋黄和大豆,制备成本低,性质稳定,属于中性磷脂。
磷脂酰胆碱是形成许多细胞膜的主要成分,也是制备脂质体的主要原料。
胆固醇也是脂质体另一个重要组成成分,它是许多天然生物膜的重要成分,本身并不形成膜结构,但是能够以1:1甚至2:1的摩尔比插入磷脂膜中。
加入胆固醇可以改变脂膜的相变温度,从而影响膜的通透性和流动性。
因此胆固醇具有稳定磷脂双分子膜的作用。
脂质体的分类按脂质体的结构和粒径分类o单室脂质体: 药物溶液仅仅被一层类脂双分子层膜包裹。
根据直径大小,单室脂质体又可以分为小单室脂质体和大单室脂质体。
o多室脂质体:又称多层脂质体是药物溶液被几层脂质双分子层所隔开形成的不均匀聚集体。
o多相脂质体:指的是以单室或者多室脂质体为主,包含少量油包水或水包油型乳剂的多相分散体系。
∙按脂质体性能分类o一般脂质体o特殊性能脂质体:包括热敏脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体、磁性脂质体等∙按脂质体电荷性分类o中性脂质体:脂材为卵磷脂等中性磷脂,表面不带电荷的脂质体。
o负电性脂质体:在脂材中掺入磷脂酰丝氨酸等酸性磷脂,脂膜带负电荷的脂质体。
Fluorescentliposomes(荧光标记脂质体)的合成及介绍Fluorescentliposomes(荧光标记脂质体)的合成及介绍荧光脂质体是一种新型的荧光标记物,通过包裹单层脂质体和表面固定荧光团来成像微加工结构中的流动剖面。
脂质体由磷脂和胆固醇通过聚碳酸酯膜挤压而成。
水核中的羧基荧光素和双分子层中荧光素标记的脂质赋予它们表面和体积荧光,以最大限度地提高其荧光强度。
选择脂质体的组成以使脂质体带净负电荷,以使自聚集和与带负电荷的通道玻璃表面的相互作用最小化。
这些脂质体是单分散的、中性浮力的和亲水的,并且在玻璃表面上没有表现出吸附。
随着脂质体修饰技术及荧光技术的发展,人们开始在制备脂质体的原料磷脂或胆固醇上修饰荧光染料,用它示踪脂质体的走向,并综合脂质体内所包染料的荧光情况来分析脂质体载药体系与细胞的相互作用情况,从而获取更多更全面的信息。
我们的荧光脂质体可用于研究压力驱动的流动并提供具有出色信噪比的图像。
荧光脂质体也可以针对各种应用进行定制,以提供广泛的表面和体积特性,例如电荷、大小和表面化学。
荧光标记的脂质体,包括常规荧光脂质体、生物素化的荧光脂质体以及Avdinized化的荧光脂质体,另外还提供定制的荧光脂质体(脂类及染料可选)。
用途分类及介绍1.荧光脂质体-用于追踪和检测含有亲脂示踪剂的脂质体含有亲脂示踪剂的负电荷荧光脂质体含有亲脂示踪剂的中性荧光脂质体用于追踪和检测的中性荧光脂质体含有亲脂示踪剂的带正电荷的荧光脂质体基于DOTAP的荧光脂质体用于跟踪和检测基于DOTAP的Fluoroliposome-DBCO用于跟踪和检测基于DOTAP的Fluoroliposome-Azide用于跟踪和检测基于PS的荧光脂质体用于跟踪和检测表面活性脂质体用于活性染料的共轭负电荷荧光脂质体用于活性染料的共轭中性荧光脂质体用于活性染料的共轭用于追踪和检测的中性荧光脂质体-叠氮化物中性Fluorolipos ome?-DBCO用于跟踪和检测带正电荷的荧光脂质体用于活性染料的共轭2.荧光脂质体-用于融合实验脂质体共包封NBD/罗丹明负电荷荧光脂质体共包封NBD/罗丹明DOPC:DOPG脂质体共包封NBD/罗丹明POPC:Chol:POPG脂质体共包封NBD /罗丹明POPE:POPG脂质体共包封NBD/罗丹明DOPC:DOPS 脂质体共包封NBD/罗丹明POPE:POPS:POPC脂质体共包封NBD/罗丹明中性荧光脂质体共包封NBD/罗丹明DOPC脂质体共包封NBD/罗丹明带正电荷的荧光脂质体共包封NB D/罗丹明DOTAP脂质体共包封NBD/罗丹明包封十八烷基罗丹明B的脂质体含有十八烷基罗丹明B的负电荷荧光脂质体POPC:Ch ol:含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的POPG脂质体DOPC:含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的DOPG脂质体POPE:含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的POPG脂质体DOPC:含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的DOPS脂质体POPE:POPS:含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的POPC脂质体包封十八烷基罗丹明B的中性荧光脂质体含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的DOPC脂质体包封十八烷基罗丹明B的带正电荷的荧光脂质体DOTAP脂质体含有十八烷基罗丹明B的自猝灭浓度3.荧光脂质体-用于孔形成实验含有各种大小的葡聚糖-FIT C染料的脂质体含有不同大小的葡聚糖-FITC染料的负电荷荧光脂质体POPE:含有葡聚糖-FITC染料的POPG脂质体POPC:Ch ol:含有葡聚糖-FITC染料的POPG脂质体DOPC:含有葡聚糖-FITC染料的DOPG脂质体POPE:POPS:含有葡聚糖-F ITC染料的POPC脂质体DOPC:含有葡聚糖-FITC染料的DOPS脂质体含有不同大小的葡聚糖-FITC染料的中性荧光脂质体含有葡聚糖-FITC染料的DOPC脂质体含有不同大小的葡聚糖-FITC的带正电荷的荧光脂质体含有葡聚糖-FITC染料的DOTAP脂质体4.荧光脂质体-用于巨噬细胞摄取标准荧光控制甘露糖化荧光控制5.?荧光脂质体-表面反应性脂质体胺反应性荧光脂质体生物素化的荧光脂质体羧酸反应荧光脂质体DBCO或叠氮化物反应荧光脂质体(点击化学)叶酸荧光脂质体巯基反应性荧光脂质体?。
药学与临床研究Pharmaceutical and Clinical Research 2010多柔比星(Doxorubicin )是1969年从松链丝菌浅灰色变株(Str.peucetius var.caesius )中提取分离到的蒽环类抗生素,具有很强的抗癌活性,化疗指数较高,临床上单独使用或与其他抗癌药物联合使用可有效治疗各种恶性肿瘤。
多柔比星属于细胞周期非特异性药物,它主要通过嵌入DNA 碱基对之间并与DNA 紧密结合,从而阻止DNA 的复制,抑制DNA 依赖性多聚酶的作用,干扰RNA 转录过程。
这种阻止细胞分裂的作用,并不能选择性地区分肿瘤细胞和正常细胞,因此与大多数化疗药物一样,多柔比星的不良反应很多。
除呕吐、恶心、脱发等常见副作用外,还由于阿霉素类化合物与心肌的亲和力明显高于其他组织,并能通过半醌代谢物损害心肌细胞,从而带来严重的剂量依赖性心脏毒性,使其临床应用受到极大限制[1]。
虽然通过减少累积给药剂量可以一定程度上缓解阿霉素类抗肿瘤药物的心脏毒性,但同时会降低对肿瘤的控制效果。
近年来,脂质体作为一种新型的靶向药物载体,可以增加药物疗效,减少毒副作用,在肿瘤药物开发中备受重视[2]。
大量研究表明,脂质体技术对克服阿霉素心脏毒性尤为有效,阿霉素脂质体因此迅速成为各大制药公司开发的热点,先后有多个药物上市,进入临床应用,其中以多柔比星脂质体为最多。
1脂质体制剂脂质体(liposome)是一种具有类似生物膜结构的磷脂双分子层小囊泡。
最初是在1965年由英国科学家Bangham 和Standish 等发现的。
他们用电镜观察到磷脂分散在水中自然形成多层囊泡,每层由厚度约为4纳米的双分子层组成,囊泡中央和各层之间被水相隔开[3]。
1971年Ryman 等人提出将脂质体用于药物载体,以提高药物靶向性和降低药物的副作用,此后对其研究日益深入,并逐渐在临床上得到广泛应用。
脂质体作为药物载体,与传统剂型相比,具有许多独特的优点[4]。
脂质体(Liposomes)是由磷脂胆固醇等为膜材包合而成。
磷脂分散在水中时能形成多层微囊,且每层均为脂质双分子层,各层之间被水相隔开,这种微囊就是脂质体。
脂质体可分为单室脂质体、多室脂质体,含有表面活性剂的脂质体。
按性能脂质体可分为一般质体(包括上述单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等)特殊性能脂质体、热敏脂质体、PH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。
按电荷性,脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。
脂质体作为药物载体在恶性肿瘤的靶向给药治疗方面极具潜力。
为克服脂质体作为载体的靶向分布不理想、稳定性较差的缺点,近年来开发了一些新型脂质体,如温度敏感型、PL敏感型、免疫、聚合膜脂质体。
前体脂质体概念的提出和研究,提供了克服脂质体不稳定的较好思路。
脂质体作为目前最先进的,被喻为"生物导弹"的第四代给药系统成为靶向给药系统的新剂型。
脂质体的靶向性通过改变脂质体的给药方式、给药部位和粒径来调整其靶向,另外,还可在脂质体上连接某种识别分子,通过其与靶细胞的特异性结合来实现专一靶向性。
靶向性是脂质体作为药物载体最突出的优点,脂质体进入体内后,主要被网状内皮系统吞噬,从而使所携带的药物,在肝、脾、肺和骨髓等富含吞噬细胞的组织器官内蓄积。
1.天然靶向性是脂质体静脉给药时的基本特征,这是由于脂质体进入体内即被巨噬细胞作为外界异物吞噬的天然倾向产生的。
脂质体不仅是肿瘤化疗药物的理想载体,也是免疫激活剂的理想载体。
2. 隔室靶向性是指脂质体通过不同的给药方式进入体内后,可以对不同部位具有靶向性,可以通过各种给药方式进入体内不同的隔室位置产生靶向性。
在组织间或腹膜内给予脂质体时,由于隔室的特点,可增加对淋巴结的靶向性。
3. 物理靶向性这种靶向性是在脂质体的设计中,应用某种物理因素的改变,例如用药局部的pH、病变部位的温度等的改变而明显改变脂质体膜的通透性,引起脂质体选择性地在该部位释放药物。