细菌内毒素检测方法验证方案
起草人：
审核人：
批准人：
生效日期：
文件分发范围：QA、QC
1.验证目的：
为确保细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，
特制定此验证方案。
2.验证范围：
适用于注射液细菌内毒素检测方法验证。
3.验证小组成员及职责：
组长：，QC经理，负责协调小组的行动，跟进验证方案的审批流程，协调与其他部门及小组成员内的交流，组织验证数据并文件化。
组员：，QC人员，负责起草方案并按照确认方案进行验证，起草验证报告。
组员：QC微生物主管，负责验证方案与报告的审核，验证过程的复核。
4.验证依据：
4.1《药品生产质量管理规范》（2010年修订）
4.2《药品生产验证指南》(2003年版)
4.4《细菌内毒素检验操作规程》（SN-O08-F0061-02）
4.5《中国药典2010版二部》附录
5.验证前准备：
5.1人员培训确认：
检查人：日期：复核人：日期：
5.2仪器设备
5.3检验材料、试剂及标准品
6. 鲎试剂灵敏度复核：
以上该批鲎试剂按《细菌内毒素检查法操作规程》（SN-O08-F0061-02）检查法的要求复核标示灵敏度，应符合规定。
《鲎试剂灵敏度复核记录》（SN-O08-F0061-R02-01）编号：。
灵敏度复核结果： EU/ml
7.验证方法：
通过比较内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对细菌内毒素（BET）检查有干扰，至少对3批样品进行干扰试验。
7.1供试品细菌内毒素限值和最大稀释倍数的确定（L）：
7.1.1限值：每1mg中含细菌内毒素的量应小于30EU
7.1.2供试品的最大有效稀释倍数（MVD）公式：
MVD＝C*L/λ
式中：C为供试品溶液的浓度（为2.5mg/ml），其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位为mg/ml或U/ml，λ为鲎试剂的灵敏度。
7.1.3最大有效稀释倍数（MVD）计算结果：
MVD＝CL/λ
＝（2.5mg/ml*30EU/mg）/0.25 EU/ ml
＝ 300倍
7.2干扰试验
7.2.1细菌内毒素标准溶液制备：
取细菌内毒素工作标准品（160EU/ml）一支，开启，加入1ml 细菌内毒素检查用用水溶解，置旋涡混合器上混合15分钟，得到160EU/ml的内毒素标准溶液（以E
160
表示），用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ。具体稀释过程如下:（选用灵敏度λ=0.25的鲎试剂进行实验）
1mlBET 0.2mlE
160 0.2mlE
16
1.0ml E
8
1.0mlE
1
1.0mlE
0.5
E
160/支 E
160
E
16
E
1.6
E
1
E
0.5
1.8mlBET 1.8mlBET 0.6mlBET 1.0mlBET 1.0mlBET
1.0mlE
0.25 1.0mlE
0.125
E
0.25 E
0.125
E
0.0625
1.0mlBET 1.0mlBET
7.2.2供试品溶液的制备
直接将供试品按最大稀释倍数稀释，即稀释300倍,供试液浓度为S
300
。稀释步骤如
下：
0.2ml 0.5ml 5.0ml
S 原液 S
10
S
150
S
300
1.8ml 7.0ml 5.0ml 7.
2.3含内毒素的供试品溶液的制备
用供试品溶液将7.2.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度2λ（E
0.5）、λ（E
0.5
）、
0.5λ（E0.5）、0.25λ（E0.5）的含内毒素的供试品溶液。
1mlBET 0.2mlE
160 0.2mlE
16
1.0ml E
8
1.0mlE
1
1.0mlE
0.5
E
160/支 E
160
E
16
E
1.6
E
1
E
0.5
1.8ml S
300 1.8ml S
300
0.6ml S
300
1.0ml S
300
1.0ml S
300
1.0mlE
0.25 1.0E
0.125
E
0.25 E
0.125
E
0.0625
1.0ml S
3001.0ml S
300
注：每步稀释前被稀释液应置于旋涡混合仪上混合至少30秒。
7.2.4鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，70%异丙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
7.2.5加样
（1）将准备好的规格为0.1ml/支鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ（E0.5）、1.0λ（E0.25）、0.5λ（E0.125）、0.25λ（E0.0625）的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
（2）将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）分别加入0.1ml S
300
供试品溶液作为供试品对照。
7.2.6加样结束后，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37±1.0℃试管恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。
7.2.7试验结果记录（阳性表示为“+”；阴性表示为“-”）：
见附件《干扰试验记录》。
7.2.8试验结果计算
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性
