规模猪场致病性大肠杆菌的药敏试验

Ｌ｜ＶＥｓＴＯＣＫＡＮｏ　ＰＯＵＬＴＲＹ｜ＮＤＵｓＴＲＹ　Ｎｏ　２９７　

仔猪大肠杆菌分离鉴定及药敏试验　

高玄涛（山西农业大学动物科技学院，山西　太谷０３０８０１）　中图分类号：￥８５８．２８　文献标志码：Ｂ　文章编号：１００８—０４１４（２０１４）０１—００４８—０２　

摘　要　采用病原分离的方法，从太谷地区几家养猪场采集病、死猪肝脏、脾　

脏、淋巴结，进行了细菌的分离培养、染色镜检、生化试验和致病性试验．结果表明．分　离获得的８株疑似大肠杆菌具有典型的生长特性、形态及染色特性；生化鉴定结果显　示，其中有６株为致病性大肠杆茵；通过纸片法．对分离的致病性大肠杆菌进行药敏试　验，试验结果显示，临床治疗大肠杆菌病的首选药物是丁胺卡那和先锋霉素Ｖ类．为　该地区的大肠杆菌病的预防提供依据。　关键词　仔猪腹泻　大肠杆菌　分离鉴定　药敏试验　

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆　

菌引起的猪的肠道传染病。根据发病　日龄和病原菌血清型的差异，猪大肠　

杆菌病可分为仔猪黄痢、仔猪白痢和　

仔猪水肿病３种。仔猪黄痢是出生后几　

小时到１周龄仔猪的一种急性高度致　

死性肠道传染病，以剧烈腹泻，排出黄　

色或黄白色水样粪便以及迅速脱水死　

亡为特征。仔猪白痢是由大肠杆菌引　

起的１０日龄左右仔猪发生的消化道　

传染病。临床上以排灰白色粥样稀便　

为主要特征，发病率高而致死率低。猪　

肠道菌群失调、大肠杆菌过量繁殖是　

本病的重要病因。猪水肿病是由溶血　性大肠杆菌毒索引起的以断奶仔猪眼　

睑或其它部位水肿、神经症状为主要　

特征的疾病。仔猪大肠杆菌病在集约　化猪场存在非常普遍。发生严重．造成　

了巨大的经济损失　

该病在我国许多地区的养猪场都　有发生，是危害仔猪的重要传染病之　

一。伴随着规模化、集约化养猪业的发　

展，仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率越　

来越高，危害也越来越严重。据资料统　计，腹泻造成仔猪死亡率在１５％　

２５％，０～２周龄仔猪的死亡率为２６％．　

２－４周龄仔猪的死亡率为ｌ６％，这其中　

农　林　论　坛　科　

仔猪腹泻症大肠杆菌耐药性的监测　

李梦潇　（黑龙江省依安县动物检疫站黑龙江依安１６１５０｛））　摘　要：大肠杆菌分离与鉴定最常规的方法是生化试验、动物接种、药敏试验、血清型鉴定等：现介绍应用这几种方法对规模化猪场大肠杆菌的诊断情　况关键词：仔猪腹泻；大肠杆菌；试验　猪大肠杆菌病是由致病性大肠　杆菌引起的一类传染病，由于致痫性大　肠仟菌血清型的不同以及猪年龄、个体　和生理机能的差异，因而发生　同的疚　病。目前，有不少兽医丁作者用耐热肠毒　素（ｓＴ）的测定结果来分析大肠杆菌的致　病力。大肠杆茼分离与鉴定最常规的方　法是生化试验、动物接种、药敏试验、　清型鉴定等。现介绍应用这几种方法对　规模化猪场大肠杆菌的诊断情况　１材料　１．１培养基　营养琼脂培养摹；半固体培养摹；　麦康凯培养基；伊红美　琼脂平板；■糖　铁琼脂培养荩；蛋白睬水；葡萄精蛋白晾　水　１＿２试剂的制备　欧立氏（Ｅｈｒｌｉｃｈ。ｓ）吲跺试剂　甲基红（１Ⅵ．Ｒ．试剂）　１３实验动物　实验动物为ｌ５～２０ｇ小ｒ１鼠　２力‘法　步骤（如图１所示）　３结果　设伫瘴　直袭划线分离壶豪觐或伊￡蓑兰琮睚丑扳、　，３　℃２４ｈ　理骞选定Ｅ＿旺菌藩侈到矗下两种培养基　

．３　Ｃ　Ｓ４Ｅ　理蘩萎景，　芎　董兰置染色　筏抱薹　寿与楚薯　一台悟者姿生釜巨　鲁悟者磊管营静　

３．１细菌分离、培养　纯化结果　分离的６４株大肠杆菌在普通营养培养基上　形成隆起、光滑湿润、边缘蒂齐、半透明、大小不一　的近似灰白色的菌落；在麦康凯培养基卜形成粉　红色扁平菌落；在伊红荚兰培养基上形成黑色带　金属光泽的菌落；能使＝　糖铁琼脂培养基变红色，　产气。涂片，川革兰氏染色法染色，镜检见Ｇ，两端　钝　的杆菌。没自‘其他杂菌　３．２生化试验结果　分离的６４株人肠杆菌的牛化试验结果基本　符合大肠朴菌的特征：发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、　露醇，不分解尿素、不还原硝酸盐，吲哚试验和　ＭＲ试验均为阳性，ＶＰ试验阴性。其余生化试验结　果详见表１。　３．３致疴陛试ｇ　吉果　从Ａ、Ｂ两场随机戢各８株细菌分别按照实　验分组接种小白鼠　、共仃１７组，Ａ场８组，Ｂ场８　组．划照１组。ｌ５个小时即有小Ｉ　Ｉ鼠死亡，２４小时　后。Ａ场剩下２组小　鼠术死亡，Ｂ场剩下３组小　白鼠未死亡。对照组小白鼠饲喂７天仍能健康存　活。剖检死　的小白鼠的痫变与死亡腹泻仔锗的　病变相似，并采取攻毒　Ｅ亡小白鼠的心、肝病料触　片染色镜检并同时进行细菌分离培养，在镜下可　见Ｇ－，两端钝　的朴菌。分离后的细菌存麦　Ｌ培　养基上可见到典型粉红色扁平菌落　３４药敏试验结果（见表２）　４｝４论　本实验通过仔猪黄、白痢致病性大肠杆菌的　病原分离、生化鉴定、药敏试验及毒力试验，提出　表１　６４株分离茵的生化特性　

李迎晓，焦凤超，易本驰，等．猪源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验［J］．江苏农业科学，2013，41（1）：217－218．

猪源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

李迎晓，焦凤超，易本驰，何敏，陈敏（信阳农业高等专科学校动物科学系，河南信阳464000）摘要：从河南省信阳市规模化猪场腹泻仔猪病例中分离到4株革兰氏阴性杆菌，通过细菌培养特性、细菌形态和生化试验，确定为大肠杆菌。经O血清型鉴定，分离株为O8、O157、O117、O38。动物试验结果显示，4个分离菌株对小鼠有较强的致死性，为致病性大肠杆菌。药敏试验结果显示，分离菌株对头孢曲松、头孢噻呋、头孢噻肟和丁胺卡那等药物高度敏感，对四环素、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星等药物产生耐药性。关键词：大肠杆菌；血清型；药敏试验中图分类号：S855．1+2文献标志码：A文章编号：1002－1302（2013）01－0217－02

收稿日期：2012－06－07基金项目：河南省科技攻关项目（编号：072102130026）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（编号：12B230012）。作者简介：李迎晓（1981—），女，河南洛阳人，硕士，讲师，从事病原微生物与免疫学研究。E－mail：liyingxiao81@163．com。通信作者：易本驰，副教授。Tel：（0376）6687605；E－mail：xy6226@foxmail．com。仔猪大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌引起的养猪场常见的细菌性传染病，根据猪的发病年龄和临床表现不同可分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病。不同地区流行的优势血清型有差异，即使在同一地区不同饲养场的大肠杆菌分离株的血清型也有差别［1－2］。因此，对当地流行的大肠杆菌进行血清型和耐药性试验等相关研究，对大肠杆菌病的有效防治具有重要的理论和实践意义。1材料与方法1．1试验材料1．1．1试验材料病料来源于河南省某猪场的病死仔猪肝脏、直肠棉拭等病料。1．1．2培养基、菌株和试剂营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂、细菌生化微量鉴定管、药敏纸片和大肠杆菌（ATCC25922），购自杭州天和微生物试剂有限公司；大肠杆菌标准抗O血清，购自中国兽药监察所。1．1．3试验动物小白鼠，由信阳卫校实验动物中心提供。1．2试验方法1．2．1细菌的分离培养无菌采集病料划线接种于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板，在37℃培养24h后，挑取可疑菌落进行细菌形态染色特性鉴定，并挑取可疑菌落分别接种于三糖铁琼脂斜面、伊红美兰琼脂和营养肉汤，37℃条件下培养24h后，观察细菌的培养特性。1．2．2生化试验按文献报道方法对分离株进行10项生化指标的测定［3］。1．2．3药敏试验采用K－B法进行。取适量被检细菌的培养物，均匀涂布于营养琼脂表面，待菌液吸收后，贴上药敏纸片（购自杭州天和微生物试剂有限公司），37℃培养18h，观察结果，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小判定细菌对药物的敏感性。1．2．4O血清型鉴定从麦康凯琼脂上挑取各株菌落1～2个，分别接种于营养琼脂斜面和营养肉汤中，37℃培养24h后，用2mL0．5%的石炭酸生理盐水洗下琼脂斜面上的培养物制成菌悬液，并与普通肉汤培养物同时置于121℃下高压2h，制成高压抗原；然后用O单因子血清进行玻板凝集试验，鉴定分离株的O血清型［4］。1．2．5致病力试验取经营养肉汤37℃培养16～18h后的4个纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重20g左右的小白鼠，每组接种6只，每只注射0．3mL，同时用6只小白鼠接种无菌肉汤作对照。注射后观察小白鼠发病、死亡情况，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。2结果与分析2．1细菌的分离培养结果经37℃培养24h，4个分离菌株在普通营养琼脂平板上形成白色圆形隆起、中等大小的菌落；在麦康凯琼脂上形成红色、圆形、隆起、光滑湿润、边缘整齐的中等大小菌落；三糖铁琼脂斜面培养基底层变黄，斜面变黄，同时产酸产气；在伊红美蓝琼脂上形成黑色、具有金属光泽的菌落；挑取单个菌落进行革兰氏染色后，在显微镜下可见革兰氏阴性、散在或成对排列、两端钝圆的短杆菌。以上均符合大肠杆菌的培养特性。2．2生化试验结果4个分离菌株能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇，产酸产气；发酵蔗糖，产酸不产气；吲哚试验和MR试验阳性；VP试验、柠檬酸盐利用试验和硫化氢试验阴性。2．3药敏试验结果采用K－B法进行，具体结果见表1。2．4O血清型鉴定结果将待检菌抗原分别与O8、O157、O117、O38单因子血清混合后浑浊，有白色颗粒出现；而待检菌抗原与石炭酸生理盐水混合无凝集现象出现，说明该分离菌血清型为O8、O157、O117、O38。2．5致病力试验结果试验组小鼠在注射抗原10h后开始出现死亡，并于72h—712—江苏农业科学2013年第41卷第1期表1药敏试验结果药物抑菌圈直径（mm）O8菌株O157菌株O117菌株O38菌株药敏试验结果庆大霉素5364耐药丁胺卡那霉素12101411中敏粘杆菌素17222018高敏四环素0000耐药强力霉素2578耐药诺氟沙星0134耐药环丙沙星4279耐药恩诺沙星6375耐药头孢曲松20282225高敏头孢噻呋19241826高敏头孢噻肟20261823高敏注：根据《纸片法抗菌药物敏感试验标准》［5］，抑菌圈直径大于15mm为高敏；直径10～15mm为中敏；直径10mm以下者为耐药。内全部死亡，将死亡小鼠肝、脾划线接种于麦康凯琼脂平板上，37℃条件下培养18h，有红色菌落生长，挑取单菌落染色镜检，其形态特性符合大肠杆菌的特征。对照组6只小鼠在隔离饲养1周内全部存活，说明该分离菌株为致病性大肠杆菌。3讨论大肠杆菌血清型众多，且具有较强的地域性分布，弄清各地致病性大肠杆菌的优势血清型以及敏感药物，对于该病的区域性防治具有重要的指导意义。大肠杆菌是一种在人和温血动物肠道内常见的细菌。大多数大肠杆菌菌株无害。然而一些菌株，如肠出血性大肠杆菌（EHEC）可引起严重的食源性疾病，出现包括腹部绞痛、腹泻、血性腹泻、发烧、呕吐以及溶血尿毒综合症等临床症状。其代表株O157∶H7大肠杆菌是与公共卫生有关的最重要的出血性大肠杆菌的血清类型。羊、猪、鸡、马、鹿、鸽、海鸥等动物均可能成为EHEC的携带者。因此弄清肠出血性大肠杆菌（EHEC）在动物中的携带情况及其传播模式，具有极其重要的公共卫生意义。大肠杆菌很容易产生耐药性，它可以通过菌毛将耐药质粒传递给其他大肠杆菌［6］，再加上临床上盲目用药致使大肠杆菌的耐药性日益严重，有些甚至出现多重耐药的现象，给猪大肠杆菌的及时治疗增添了一定的难度。最好的措施是建立长期的耐药性和病原血清型分布监测机制，在临床实践中根据药敏试验结果，选择有效抗生素，并注意交叉用药，用量适当，尽可能控制和减少耐药性的产生，提高抗生素对猪大肠杆菌病的防治效果；同时能够根据当地所流行的优势血清型进行相关的疫苗研究和防控工作。试验中的4株大肠杆菌分离自同一区域邻近的几家猪场，由于存在相同的用药习惯，因此表现出了类似的药敏试验结果参考文献：［1］房海．大肠埃希氏菌［M］．石家庄：河北科学出版社，1997：392－393．［2］刘书亮，王红宁，陶勇，等．四川规模化猪场仔猪黄、白痢E．coli的分离鉴定［J］．中国预防兽医学报，2001，23（5）：367－371．［3］曹澍泽，郭玉璞，董国雄，等．兽医微生物学及免疫学技术［M］．北京：北京农业大学出版社，1992：34－95．［4］赵坤，王三虎，刘诗柱，等．豫北地区猪源致病性大肠杆菌分离与鉴定［J］．河南科技学院学报：自然科学版，2007，35（3）：25－27．［5］张正，高屹，叶应妩．纸片法抗菌药物敏感试验标准［S］．北京：中国标准出版社，2000：4－15．［6］胡功政，张春辉，梁军，等．猪鸡致病菌β－内酰胺酶、超广谱β－内酰胺酶检测与药敏试验［J］．中国农业科学，2005，38（2）：399－404．—812—江苏农业科学2013年第41卷第1期

试验研究　

仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验　廖娟，任小春，唐萌，伍超，王钢★　（四川乐山师范学院化学与生命科学学院，乐山６１４０００）　ＤＯ１：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－６０２７．２０１２．０７。０１３　仔猪大肠杆菌病俗称白痢、黄痢，是由致病性大肠杆菌　引起的急性肠道传染病。该疾病是常见且危害性极大的传染　病之一。目前，各养猪场防治仔猪大肠杆菌病常用的方法仍　然是用抗生素类的药物，但由于仔猪服用大量的抗菌药物，　易造成细菌耐药性的的产生，因此需对分离出的细菌进行药　敏性试验，进而为临床用药提供理论依据。针对乐山某种猪　场提供的腹泻严重的仔猪白痢病料，我们进行了细菌分离鉴　定和药敏试验，以期为仔猪大肠杆菌病的有效防治提供一些　技术参考资料。　１材料与方法　１．１材料　１．１．ｔ病料的采集从乐山某养猪场采集患白痢的猪仔肛　门拭子病料１２份。　１．１．２主要试剂培养基及细菌鉴定用的生化试剂等由乐　山师范学院化学与生命科学学院实验室提供。　１．１＿３供试药片头孢氨噻肟、氟苯尼考、左氟沙星、庆大霉　素等含药纸片，购自杭州微生物试剂责任有限公司。　１．１．４试验动物清洁级昆明系小白鼠雌雄各半，共１０只，　购自乐山长征制药厂。　１．２试验方法　１．２．１病原菌的分离培养从乐山裕龙养猪场采集患有白　痢猪仔的肛门拭子病料，将其浸入到灭菌生理盐水中，充分　洗脱，将其悬浮液分别划线接种于麦康凯琼脂培养基上，　３７％培养２４ｈ，然后挑取麦康凯琼脂培养基上的粉红色、表面　光滑的单个菌落接种到营养琼脂斜面上，３７％培养２４ｈ后，　置冰箱保存备用。　１．２．２菌体形态观察将上述培养基上所得的菌落进行涂　片，革兰氏染色，镜检，观察细菌形态以及染色特征，将符合　大肠杆菌形态特征的进行生化试验，否则弃之。　１．２＿３生化试验将上述分离出的纯培养物进行糖发酵试　验、吲哚试验、ＭＲ试验、ＶＰ试验、枸橼酸盐试验，观察其变化　并记录结果。　１．２．４致病性试验将符合生化反应符合大肠杆菌特性的　菌株接种营养琼脂平板，３７％培养］８ｈ后，用生理盐水洗下　菌落制成菌悬液。将小自鼠随机分为两组，其中一组每只皮　下注射０．２ｍ￣菌悬液，另一组注射相同剂量的无菌生理盐水。　将２４　４８ｈ左右死亡的小鼠立即解剖，并且用接种环取其心　血接种于营养琼脂培养基上，并对分离出的菌株进行进一步　鉴定。　★通讯作者　２０１２年第７期　１．２．５药敏性试验将稀释好的菌液每个平板接种０．１ｍＬ，　使菌液铺满整个平板，待平板干后，用无菌镊子取各种药片　贴于平板上，每个平板５张药片，每个药片之间的距离不小　于３ｃｍ，将贴好药片的平板置于３７℃的恒温箱中培养２４ｈ后　观察实验结果并测出个药片的抑菌圈直径，并按照标准判定　敏感，中度敏感和耐药情况。　２结果　２．１分离培养特性在麦康凯琼脂培养基上均呈粉红色、光　滑湿润、边缘整齐的菌落；在普通琼脂培养基上呈灰白色、圆　形、整齐、隆起、光滑湿润的菌落，与大肠杆菌的形态特征相　符。　２．２染色镜检分离菌株革兰氏染色为阴性小杆菌，两端钝　圆，多单个存在，与大肠杆菌染色特性相符。　２．３生化鉴定分离出的菌株均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽　糖、甘露醇，均能产酸产气，大多数菌株不利用蔗糖，少数缓　慢发酵，ＶＰ实验、枸橼酸盐试验均为阴性，吲哚试验、ＭＲ试　表１　分离菌株的药物敏感性试验结果