高效液相色谱_串联质谱测定水产品中残留的喹乙醇代谢物

高效液相色谱󰀁串联质谱测定水产品中残留的喹乙醇代谢物赵东豪,黎智广,杨金兰,黄󰀁珂,陈培基,林󰀁钦*(中国水产科学研究院南海水产研究所,广州510300)摘󰀁要:建立了高效液相色谱󰀁质谱(LC󰀁MS/MS)检测水产品中喹乙醇代谢物3󰀁甲基󰀁喹恶啉󰀁2󰀁羧酸(MQCA)的残留分析方法。样品先用Protease蛋白酶酶解,然后用乙酸乙酯萃取目标物,氮气吹干后用流动相溶解残渣,以甲醇、乙腈和0󰀂1%甲酸溶液作为流动相,液相色谱串联电喷雾质谱在正离子模式下测定。MQCA在1~100󰀁g/kg范围内线性关系良好(r>0󰀂999)。在2、4、8󰀁g/kg3个添加水平上,回收率在82󰀂5%~87󰀂5%,相对标准偏差为4󰀂5%~5󰀂1%(n=6),定量限为1󰀁g/kg。方法已用于水产品中喹乙醇代谢物的残留分析。关键词:高效液相色谱󰀁串联质谱;喹乙醇代谢物;3󰀁甲基󰀁喹恶啉󰀁2󰀁羧酸;残留;水产品中图分类号:O657󰀂63󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁文章编号:1000󰀁0720(2010)09󰀁019󰀁04󰀁󰀁喹乙醇(olaquindox)又名奥喹多司,是一种合成的喹恶啉类药物,在动物生产上常作为抗菌促生长剂使用,能提高饲料转化率[1]。其在动物体内吸收迅速,生物利用度高,原药排除速度快,但代谢产物3󰀁甲基󰀁喹恶啉󰀁2󰀁羧酸(MQCA)在组织内残留时间比较长[2],被人食用后具有潜在的危害性。农业部规定了喹乙醇在猪肉和肝脏的最高残留限量[3],标志残留物即为MQCA,但其它畜禽类及水产品暂时没有明确的规定。研究MQCA的检测方法,可以有效地监控喹乙醇在动物生产中的应用,对保障食品安全具有重要意义。当前检测喹乙醇的方法主要有酶联免疫法[4]、高效液相色谱法[5-9]、液相色谱串联质谱法等[10,11],但直接检测喹乙醇标志残留物MQCA的方法比较少,难以对喹乙醇在动物生产方面的使用做到比较全面的监控。该研究在参考前人研究工作的基础上,主要改进和优化了前处理方法,建立了水产品中喹乙醇代谢物的HPLC󰀁MS/MS检测方法。1󰀁实验部分1󰀂1󰀁试剂与材料3󰀁甲基󰀁喹恶啉󰀁2󰀁羧酸和喹恶啉󰀁2󰀁羧酸󰀁d4(QCA󰀁d4)标准品(美国Sigma公司);Protease蛋白酶及Tris碱均购自美国Sigma公司;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯等均为色谱纯或分析纯;水为超纯水;罗非鱼、对虾等从农贸市场或超市购买。分别用甲醇溶解MQCA和QCA󰀁d4的对照品制成浓度为1mg/mL的标准储备液,储存于-20󰀂冰箱中。使用时配成不成浓度的标准工作溶液。1󰀂2󰀁仪器与设备液质联用仪由Agilent1200液相系统(配备自动进样器)和API3000三重四极杆质谱串联组成,氮气吹干仪、离心机、MilliQ器(美国Millipore公司)等。1󰀂3󰀁色谱󰀁质谱条件1󰀂3󰀂1󰀁色谱条件󰀁WatersC18色谱柱(100mm 2󰀂1mm,5󰀁m)。流动相为甲醇󰀁乙腈󰀁0󰀂1%甲酸水溶液(体积比为20!10!70),等度洗脱;流速:∀19∀第29卷第9期2010年9月󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁分析试验室ChineseJournalofAnalysisLaboratory󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁Vol󰀂29󰀂No󰀂92010-9

*收稿日期:2010󰀁01󰀁08;修订日期:2010󰀁03󰀁10基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2009TS10)资助作者简介:赵东豪(1981-),男,硕士;E󰀁mai:ldonghaozhao@126󰀂com0󰀂25mL/min。柱温:30󰀂。进样量:10󰀁L。1󰀂3󰀂2󰀁质谱条件󰀁电喷雾离子源(ESI),正离子检测模式,多反应监测(MRM),电喷雾电压(IS)为4500V,雾化气压力(NEB)为34kPa,气帘气压力(CUR)为55kPa,离子源温度(TEM)为500󰀂,碰撞室压力(CAD)为48kPa。1󰀂4󰀁样品处理1󰀂4󰀂1󰀁酶解󰀁将水产品的可食部分用绞肉机绞成肉泥状,准确称取2g(#0󰀂02g)于50mL聚丙烯离心管中,加入质量浓度为0󰀂1󰀁g/mL的QCA󰀁d4内标溶液100󰀁L,静置30min。加入0󰀂6%的甲酸溶液5mL,旋涡30s后置于47󰀂水浴中振摇1h,取出依次加入1󰀂5mL浓度为1mol/L的Tris缓冲溶液和0󰀂15mL质量浓度为0󰀂01g/mL的Protease蛋白酶水溶液,充分混合均匀后再在47󰀂水浴中振摇16h。1󰀂4󰀂2󰀁提取󰀁加入10mL0󰀂3mol/LHCl溶液,振荡5min以灭活蛋白酶。然后加入5mL乙酸乙酯,旋涡振荡1min,以4200r/min的速度离心10min,吸取上清液于10mL玻璃管,再加入5mL乙酸乙酯重复提取一次,合并上清液于45󰀂下氮气吹干。准确加入1mL流动相溶解残渣,过0󰀂22󰀁m的滤膜后上机检测。1󰀂5󰀁标准曲线分别精密量取20、40、100、200、400、2000󰀁g/L的标准溶液100󰀁L,置于不同的离心管中,每只离心管中都加入质量浓度为100󰀁g/L的内标溶液100󰀁L,按1󰀂4所述方法处理,内标法定量,制作1、2、5、10、20、100󰀁g/kg添加水平标准曲线。1󰀂6󰀁回收率与定量限按照上述方法,分别制得2、4、8󰀁g/kg添加水平样品,每个添加水平做6个平行,测定本方法的回收率。按前述方法处理,制得0󰀂1、0󰀂2、0󰀂5、1、2󰀁g/kg添加水平样品,供高效液相色谱󰀁串联质谱法测定,以最低检出浓度计算,10倍信噪比定为定量限。2󰀁结果与讨论2󰀂1󰀁前处理方法的确定残留于水产品中的喹乙醇使用乙腈即可有效提取,但其代谢产物MQCA在体内与蛋白质以结合状态存在,直接用乙腈提取效率很低。该研究的前处理借鉴Joe[9]处理猪肉等组织样品的方法,先用0󰀂6%的甲酸溶液灭活组织中自然存在的酶,然后加入protease蛋白酶分解蛋白质,以游离出目标物MQCA。protease蛋白酶在47󰀂的碱性条件下活性最强,加入Tris缓冲溶液调节pH值,16~18h即可酶解完成。再用0󰀂3mol/L的HCl灭活蛋白酶,以完成后续流程操作。与Joe不同的是,省略了固相萃取步骤,直接用乙酸乙酯萃取出目标物后浓缩,残渣再用流动相溶解后即可上机检测。在检测鳗鲡等脂肪含量比较高的水产品时,浓缩之后需用正己烷或石油醚脱脂。Joe的固相萃取法比较繁琐,完成整个操作流程需时较长,还要耗费大量的有机溶液,将其应用于水产品的检测时,回收率都在20%以下,难以进行准确地定性和定量分析,不利于实际应用时水产品中MQCA残留的批量检测。2󰀂2󰀁液相色谱分析条件的确定液相色谱串联质谱仪不宜使用非挥发性盐类作为流动相[12],故其选择范围就比较狭窄。在检测MQCA时,单独的甲醇或者乙腈与0󰀂1%的甲酸溶液组成流动相,信噪比低、峰形较差。采用甲醇、乙腈和0󰀂1%甲酸溶液以2!1!7的比例组成流动相,响应值比较高,且能有效改善峰形拖尾现象。不同规格的色谱柱,进样量的多少对分析结果的影响比较大。该研究采用100mm

图1󰀁空白罗非鱼样品(a)及添加8󰀁g/kg水平MQCA(b)的MRM离子流图Fig󰀂1󰀁Ioncurentchromatogaramsofablanktilapiasam󰀁ple(a)spikedwithMQCAstandardsolutionof8󰀁g/kg(b)∀20∀第29卷第9期2010年9月󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁分析试验室ChineseJournalofAnalysisLaboratory󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁Vol󰀂29󰀂No󰀂92010-92󰀂1mm,5󰀁m的柱子,在2~10󰀁L的范围内,进样量与响应值成正相关,且峰形良好。典型总离子流图如图1所示。2󰀂3󰀁质谱条件的优化将质量浓度为1󰀁g/mL的MQCA和QCA󰀁d4标准溶液分别以5󰀁L/min的速度用针泵连续进样做一级质谱全扫描,均可得到[M+H]+的准分子离子峰。以其作为母离子进行二级质谱扫描,选取信号相对较强的两个特征碎片离子,与其母离子组成多反应监测(MRM)离子对,以QCA󰀁d4作为内标物,即可对MQCA进行定性和定量分析。QCA󰀁d4只需选取一个特征离子与母离子组成离子对即可。具体检测条件见表1。表1󰀁MQCA的质谱条件Tab󰀂1󰀁MassspectrometricconditionsofMQCA化合物母离子m/z子离子m/z去簇电压E/V碰撞能量E/V聚焦电压E/V射入电压E/V碰撞室射出电压E/VMQCA188󰀂7143󰀂0*272510079145󰀂0552110079QCA󰀁d4179󰀂0133󰀂23028140710󰀁󰀁*离子对为定量离子对2󰀂4󰀁线性范围、回收率与定量限在1~100󰀁g/kg的范围内,按照上述条件分析,以MQCA的峰面积(y)为纵坐标、浓度(x,󰀁g/kg)为横坐标,计算得到的线性回归方程为y=4󰀂61x-0󰀂174,相关系数(r)大于0󰀂999。参照农业部规定的喹乙醇在猪肉中的最高残留限量4󰀁g/kg,该研究在空白罗非鱼样品基质中添加2、4、8󰀁g/kg的MQCA。在此三个水平上,回收率在82󰀂5%~87󰀂5%之间,相对标准偏差(RSD)为4󰀂5%~5󰀂1%(n=6)。以10倍信噪比计算定量限,MQCA的定量限为1󰀁g/kg,可以满足残留检测的需要。2󰀂5󰀁方法应用采用所建立的方法对采自浙江、福建、广东、广西及海南5省区的罗非鱼、南美白对虾等5个批次共40个样品进行了测定,均未检出喹乙醇的代谢物3󰀁甲基󰀁喹恶啉󰀁2󰀁羧酸。参考文献[1]󰀁曹香林,李学梅,陈建军,等󰀂河南农业科学,2006,(4):108[2]󰀁陈杖榴󰀂兽医药理学(第二版)󰀂北京:中国农业出版社,2002󰀂240[3]󰀁中华人民共和国农业部公告第235号󰀂2002[4]󰀁赵春保,彭大鹏,陶燕飞󰀂中国农业科技导报,2008,10(S2):69[5]󰀁WuYJ,YuH,WangYL,etal󰀂JChromatogrA,2007,1146:1[6]󰀁殷居易,倪梅林,寿成杰,等󰀂中国兽药杂志,2006,40(1):11[7]󰀁艾晓辉,刘长征,文󰀁华󰀂湖北农学院学报,2003,23(4):266[8]󰀁SC/T3019-2004水产品中喹乙醇残留量的测定液相色谱法[9]󰀁GB/T20797-2006肉与肉制品中喹乙醇残留量的测定[10]󰀁HutchinsonMJ,YoungPB,KennedyDG󰀂JChrom󰀁atogrB,2005,816:15[11]󰀁JoeOB,StephenCL,RonGG,etal󰀂AnalChimActa,2009,637:128[12]󰀁盛龙生,汤坚󰀂液相色谱质谱联用技术在食品和药品分析中的应用󰀂北京:化学工业出版社,2008󰀂18Determinationofolaquindometaboliteresidueinaquaticproductsbyliquidchromatography󰀁tandemmassspectrometryZHAODong󰀁hao,LIZhi󰀁guang,YANGJin󰀁lan,HUANGKe,CHENPei󰀁jiandLINQin*(SouthChinaSeaFish󰀁∀21∀第29卷第9期2010年9月󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁分析试验室ChineseJournalofAnalysisLaboratory󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁Vol󰀂29󰀂No󰀂92010-9