动物消化率测定课件

动物性蛋白质饲料
胃蛋白酶消化率的测定过滤法参考标准：GB/T17811-2008
一、适用范围
三、实验内容
3每个试样胃蛋白酶消化率测定结果保留三位有效数字。

误差来源及分析
附录2：盐酸标准溶液的配制与标定
参考标准：GB/T601-2002 1.盐酸标准溶液的配制
按下表的规定量取盐酸，注人1000mL水中，摇匀。

注意事项：
1.灼烧温度不能超过300度，当温度超过300度时无水碳酸钠分解，可将马福炉的温度调至250，等升温稳定后再调至280，或者将马福炉事先升温至280度，待稳定后再放入无水碳酸钠
2.无水碳酸钠的称量质量小于0.2g时要用十万分子之一天平称量。

3.混合指示剂为0.1%甲基红，0.1%溴甲酚绿，1：1混合。

4.滴定一定要滴到暗红色再煮沸，可事先根据大体浓度计算大约的滴定体积。

5.滴定终点到达之后一定是再次去煮不会变回绿色。

实验一 鱼类饲料的总消化率及其蛋白质消化率的测定一、 实验目的掌握用外源指示剂Cr 2O 3间接测量鱼、虾饲料消化率的基本方法。

二、原 理与饲料均匀混合的外源指示剂Cr 2O 3，完全不被动物吸收而随粪便排出。

根据指示剂及蛋白质(或其他营养成分)在食物及粪便中的含量变化，饲料的总消化率和蛋白质的消化率由如下两式给出：饲料总消化率：D(％)=[1－'B B] ×100蛋白质消化率：D(％)=[1－ 'A A ×'B B] ×100A 、A’分别为饲料粪便中的粗蛋白含量；B 、B’分别为饲料和粪便中的Cr 2O 3 含量三、实验材料1．试验鱼 可根据实际情况选择实验鱼的种类。

但用易驯化、习惯实验环境的鱼类(如金鱼、锦鲤、罗非鱼等)较好。

体重20～25g ，每试验组10尾。

2．水族箱 每试验组配50～1001容积的水族箱2个，一个作投饲槽、一个作排泄槽。

3. 充氧设备 每水族箱配微型充气泵一台4. 集粪工具 每组配虹吸管1支、漏斗2个及玻璃纤维若干5. 小捞网1个6. 100目分样筛1个7. 100ml 凯式烧瓶2只8. 100ml 容量瓶1个，10ml 容量瓶10个9．刻度移液管l 套。

10．凯氏定氮装置1套。

11．分光光度计一台。

一、 试验饲料的制备试验饲料的组成可用第二章表2—7的典型配方。

但其中的酪蛋白和明胶用优质鱼粉代为简便起见，也可直接使用市售鱼用饲料，经重新粉碎后使用。

全部试验饲料要统—制作。

所有干性原料要经粉碎，并通过100目筛。

化学纯Cr 2O 3，也要经过100目筛。

按每千克干饲料的1％准确称取Cr 2O 3，与少量的干性原料混合，分四级逐步扩大到全部干性饲料组分，充分混合均匀，混合操作可在大白搪瓷盆进行。

因Cr 2O 3为绿色，所以从盆壁上是否留有团状绿色痕迹来判断混合的均匀程度，若有必要，可进行均匀度检查，变异系数要求小于5%。

动物蛋白质饲料消化率地测定适用范围本方法适用于所有动物性蛋白质饲料，不适用于植物性蛋白质或混合饲料消化率地胃蛋白酶测定方法.原理概要脱过脂地试样，用温热地胃蛋白酶溶液，在恒温、持续不断地搅拌下消化，过滤分离不溶性残渣，洗涤、干燥，测定残渣地粗蛋白含量.同时，测定空白和脱脂未酶解试样地粗蛋白含量..主要试剂和仪器主要试剂胃蛋白酶溶液(％)：将浓盐酸稀释至水中(溶液～)，加热至～℃，加入活性为∶生化级胃蛋白酶〔若活性不是∶，可使用活性∶生化级胃蛋白酶(不可使用非生化级胃蛋白酶)，应注意胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶浓度应为每毫升〕，并缓慢搅拌直至溶解.勿在加热板上加热胃蛋白酶溶液或配制时过热.临用前配制.乙醚；丙酮；定氮试剂：硫酸（含量，无氮）；混合催化剂：硫酸铜（个结晶水），硫酸钾()或硫酸钠()，磨碎混匀；氢氧化钠[水溶液（）]；硼酸[水溶液（）]；混合指示剂：甲基红乙醇溶液，溴甲酚绿乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月；盐酸标准溶液：（邻苯二甲酸氢钾法标定，）量取下述规定体积地盐酸，注入水中，摇匀.() 盐酸，盐酸标准溶液（）盐酸注入蒸馏水中；盐酸标准溶液（）：盐酸注入蒸馏水中；蔗糖；硫酸氨（干燥）；硼酸吸收液：硼酸水溶液（），加入溴甲酚绿乙醇溶液，甲基红乙醇溶液，氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序）. 仪器恒温式平转摇床：温控范围～℃，式或空气浴式均可，转速可调(水浴～) 实验室用样品粉碎机；分样筛：孔径（目）；分析天平：感量；消煮炉或电炉；滴定管：酸式，、；凯氏烧瓶；凯氏蒸馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；锥形瓶、；容量瓶；消煮管；定氮仪：以凯氏原理制造地各类型半自动，全自动蛋白质测定仪器、设备规定..试样制备取具有代表性试样，用四分法缩分至，然后粉碎至全部过孔筛(目)，混匀装于密封容器，保存备用..过程简述脱脂称取～试样用乙醚脱脂(含脂肪小于％可不脱脂，含脂肪％～％建议脱脂，含脂肪大于％则必须脱脂).脱脂方法可参照：将试样置于滤纸筒中，或用滤纸包好，放入°烘箱中，烘干分钟（或称侧水分后地干试样，折算成干样重），滤纸筒应高于提取器虹吸管地高度，滤纸包长度应以可全部浸泡于乙醚中为准.将滤纸筒或包放入提取管，在抽提瓶中加无水乙醚，在°地水浴（用蒸馏水）上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约次，共回流约次（含油高地试样约次）或检查抽提管流出地乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点.取出试样，仍用原提取器回收乙醚直至抽提瓶全部收完，胃蛋白酶消化称取脱脂烘干后样品若干克(精确至，含氮量约～)于带盖磨口瓶中，加新配制地并已预热至～℃地胃蛋白酶溶液，要确保样品完全被胃蛋白酶溶液浸湿，盖紧瓶盖，将瓶夹于恒温摇床上，于℃恒定搅动进行保温消化.消化残渣地处理从搅动器上取下磨口瓶，呈°角放置，让残渣沉淀以上，随后在铺有快速滤纸地布氏漏斗上抽滤，先用少量水将瓶盖上地残渣洗至滤纸上，再将磨口瓶保持沉淀时地角度移至布氏漏斗上，慢慢倾出内容物，使之通过滤纸后形成连续地细流，避免任何不必要地搅动.液体通过滤纸地速度应与倾入地速度相同.当上层液体通过滤纸后，于瓶中加入丙酮，用拇指盖住瓶口剧烈振摇，放开.再用拇指堵住瓶口，在滤纸上方将瓶倒置振摇，放开拇指让丙酮和残渣流到滤纸上.再用一份地丙酮进行洗涤，照上法振摇和倒出.检查瓶子，并用丙酮再次洗涤.当全部液体通过滤器后，用洗瓶以少量丙酮洗涤漏斗壁上残渣两次，并抽干.从布氏漏斗上小心取下载有残渣地滤纸，无损地移入凯氏烧瓶中，并将凯氏烧瓶置于℃烘箱内烘干..粗蛋白地测定.烘干残渣()粗蛋白含量地测定().仲裁法试样地消煮称取试样—(含氮量—)准确至，放入凯氏烧瓶中，加入混合催比剂，与试样混合均匀，再加入硫酸和粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(℃)直至呈透明地蓝绿色，然后再继续加热，至少.氨地蒸馏(蒸馏步骤地检验见附录)常量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入蒸馏水，摇匀，冷却.将蒸馏装置地冷凝管末端浸入装有硼酸吸收液和滴混合指示剂地锥形瓶内.然后小心地向凯氏烧瓶中加入氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体积为.降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏.半微量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入蒸馏水，转入容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液.将半微量蒸馏装置地冷凝管末端浸入装有硼酸吸收液和滴混合指示剂地锥形瓶内.蒸汽发生器地水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸.准确移取试样分解液注入蒸馏装置地反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气.蒸馏降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏.注：上述两种蒸馏法测定结果相近，可任选一种.蒸馏步骤地检验精确称取硫酸铵，代替试样，按或步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为土％，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确.滴定用上述两种蒸馏法蒸馏后地吸收液立即用.或.盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点.推荐法试样地消煮称取试样(含氮量)准确至，放入消化管中，加片消化片(仪器自备)或混合催化剂，硫酸，于℃下在消煮炉上消化.取出放凉后加入蒸馏水.氨地蒸馏采用全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定.采用半自动定氮仪时，将带消化液地管子插在蒸馏装置上，以硼酸.为吸收液，加入滴混合指示剂，蒸馏装置地冷凝管末端要浸入装有吸收液地锥形瓶内，然后向消煮管中加入氢氧化钠溶液进行蒸馏.蒸馏时间以吸收液体积达到时为宜.降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内.滴定用标准盐酸溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点..空白测定称取蔗糖，代替试样，按第七章进行空白测定，消耗盐酸标准溶液地体积不得超过.消耗盐酸标准溶液体积不得超过..分析结果地表述计算见下式：式中: ——滴定试样时所需标准酸溶液体积，;——滴定空白时所需标准酸溶液体积，；——盐酸标准溶液浓度，;——试样质量，;——试样分解液总体积，;'——试样分解液蒸馏用体积，;——每毫克当量氮地克数;——氮换算成蛋白质地平均系数.重复性每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果.当粗蛋白质含量在％以上时，允许相对偏差为％.当粗蛋白质含量在％一％之间时，允许相对偏差为％.当粗蛋白质含量在％以下时，允许相对偏差为％..脱脂未酶解样品（）中粗蛋白含量地测定().仲裁法试样地消煮称取试样—(含氮量—)准确至，放入凯氏烧瓶中，加入混合催比剂，与试样混合均匀，再加入硫酸和粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(℃)直至呈透明地蓝绿色，然后再继续加热，至少.氨地蒸馏(蒸馏步骤地检验见附录)常量蒸馏法将试样消煮液()冷却，加入蒸馏水，摇匀，冷却.将蒸馏装置地冷凝管末端浸入装有硼酸吸收液和滴混合指示剂地锥形瓶内.然后小心地向凯氏烧瓶中加入氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体积为.降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏.半微量蒸馏法将试样消煮液()冷却，加入蒸馏水，转入容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液.将半微量蒸馏装置地冷凝管末端浸入装有硼酸吸收液和滴混合指示剂地锥形瓶内.蒸汽发生器地水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸.准确移取试样分解液注入蒸馏装置地反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气.蒸馏降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏.注：上述两种蒸馏法测定结果相近，可任选一种.蒸馏步骤地检验精确称取硫酸铵，代替试样，按或步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为土％，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确.滴定用上述两种蒸馏法蒸馏后地吸收液立即用.或.盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点..推荐法试样地消煮称取试样(含氮量)准确至，放入消化管中，加片消化片(仪器自备)或混合催化剂，硫酸，于℃下在消煮炉上消化.取出放凉后加入蒸馏水.氨地蒸馏采用全自动定氮仪.时，按仪器本身常量程序进行测定.采用半自动定氮仪.时，将带消化液地管子插在蒸馏装置上，以硼酸.为吸收液，加入滴混合指示剂，蒸馏装置地冷凝管末端要浸入装有吸收液地锥形瓶内，然后向消煮管中加入氢氧化钠溶液进行蒸馏.蒸馏时间以吸收液体积达到时为宜.降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内.滴定用标准盐酸溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点..空白测定称取蔗糖，代替试样，按第七章进行空白测定，消耗盐酸标准溶液地体积不得超过.消耗盐酸标准溶液体积不得超过..分析结果地表述计算见下式：式中: ——滴定试样时所需标准酸溶液体积，;——滴定空白时所需标准酸溶液体积，；——盐酸标准溶液浓度，;——试样质量，;——试样分解液总体积，;——试样分解液蒸馏用体积，;——每毫克当量氮地克数;——氮换算成蛋白质地平均系数..结果计算结果按式()计算(％)＝－×……………………()式中：——试样地胃蛋白酶消化率，％；——脱脂未酶解地原样品中粗蛋白地平均含量，％；——脱脂酶解后残渣中粗蛋白地平均含量，％.所得结果表示到小数点后一位..允许差每个试样脱脂后取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果. 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果.当粗蛋白质含量在％以上时，允许相对偏差为％.当粗蛋白质含量在％一％之间时，允许相对偏差为％.当粗蛋白质含量在％以下时，允许相对偏差为％..来源中国国家标准：—。

动物蛋白消化率动物性饲料体外蛋白质消化率测定——胃蛋白酶法1 范围该方法仅适用于动物性蛋白质饲料，如鱼粉、肉骨粉、酵母粉、血粉等体外消化率测定。

该方法不适用于植物蛋白质饲料原料（如豆粕、菜籽粕、棉籽粕及其他杂粕）或配合饲料，因为它们中存在的复杂碳水化合物如纤维性物质及淀粉等会干扰胃蛋白酶对蛋白质的消化。

2方法原理脱过脂的试样，用温热的胃蛋白酶溶液，在恒温、持续不断的搅拌下消化16小时，离心分离不溶性残渣，洗涤，干燥，测定残渣的粗蛋白量。

同时测定空白和未酶解试样的粗蛋白含量。

3试剂2g/L胃蛋白酶溶液2g/L胃蛋白酶溶液的配制①移取6.1ml浓盐酸，加水稀释至1000ml;②将上述稀盐酸加热升温至42~45℃，取下，然后加入2g活性为1：10000生化级胃蛋白酶，轻轻地搅动，使其溶解。

注意：我们使用的为生化级胃蛋白酶1：10000（北京鼎国生物技术有限责任公司）。

注意事项①所用的胃蛋白酶必须为生化级，如果有条件的，最好对其活性进行实测。

如果其活性为1：3000或其他规格，应按照活性比例，相应增加或减少酶的用量，使胃蛋白酶溶液中酶的活性为20IU/ml。

因为胃蛋白酶溶液中酶活性的高低直接影响消化率的高低。

如果与标准偏离，测定结果将无可比性，失去参考价值。

②溶液一定要现用现配，避免配制时过热，注意勿在加热板或电炉上直接加热胃蛋白酶溶液，否则会使沉于烧杯底部的酶直接局部过热而失活。

乙醚定氮试剂：按GB/T6432中试剂及配制方法规定。

4仪器、设备恒温式平转摇床：温控范围20~50℃，转速可调（15~300r/min）。

实验用样品粉碎机。

索氏提取器、设备：按GB/T6344中仪器、设备规定。

定氮仪器、设备：GB/T6432中仪器、设备规定。

实验室常用仪器设备。

5试样制备取具有代表性试样，用四分法缩分至200g,然后粉碎至全部过40目筛，混匀装于密封容器，保存备用。

6测定步骤6.1 脱脂称取1~2g试样用乙醚（3.2）脱脂（含脂肪小于1%可不脱脂，含脂肪大于1%~10%建议脱脂，含脂肪大于10%则必须脱脂）。