细菌内毒素检测技术

BET水复溶
操 作
混匀
旋涡混合器混合15min
混匀
步 骤
轻轻转动瓶壁摇匀
示 意 图
稀释为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒 素标准溶液(C溶液)
单次管：原安瓿 多次管：反应试管
每步稀释于旋涡混合器混合30秒
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0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管 NC：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管
安福隆成品内毒素限值为10EU/5MIU，原液内毒素限值为 20EU/mg。
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❖ 最大有效稀释倍数
▪ 指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1MVD），在不超过此稀释倍数的浓度按下进行内毒素限 值的检测。用以下公式计算：
MVD=cL/λ
C为供试品溶液的浓度， λ为鲎试剂的灵敏度。
主要的外源性热原,在GMP条件下控制内毒素污染就等于控制 热原污染。
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❖ 特性
致热性 耐热性 分子极性 酸碱性 鲎反应性
内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原刺激 下丘脑体温调节中枢，使人体发热升温 需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活
多糖链端有亲水性，脂肪链端具有疏水性，在水中呈不均匀分布 与强酸强碱水解反应，可灭活内毒素
3）最大有效稀释倍数的计算
MVD=cL/λ=40（倍）
4）各反应溶液的制备
溶液编号
B
A
溶液内容
S40E0.5
S40E0.25 S40E0.125 S40E0.06
S40
Байду номын сангаас平 行 管
溶液编号
C
D
溶液内容
E0.5
E0.25
混匀（水浴恒温需封口）
37℃±1℃，孵育60min±2min
翻转180度，观察凝胶状况
8、干扰试验
▪ 通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应 的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查 有干扰。
▪ 至少对3批样品进行干扰试验。
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试验步骤
• 供试品限值的确定 • 鲎试剂的选择 • 最大有效稀释倍数的确定 • 反应溶液的制备 • 加样及反应 • 结果判断
天津华立达生物工程有限公司
细菌内毒素检查法 (凝胶法)
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天津华立达生物工程有限公司 2010年9月
细菌内毒素检查法(凝胶法)
❖1、热原 ❖2、细菌内毒素 ❖3、鲎试剂 ❖4、细菌内毒素检查用水 ❖5、细菌内毒素检查的程序 ❖6、相关参数的计算 ❖7、鲎试剂标示灵敏度的复核试验 ❖8、干扰试验 ❖9、检查法
❖ 2010年版药典要求，细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 0.015EU/ml （用于凝胶法）或0.005EU/ml （用于光度测定法）且对 内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
❖ 美国药典要求的BET水是指与所使用的鲎 ❖ 试剂不发生反应的灭菌注射用水或其它水。
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5、细菌内毒素检查的程序
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7、鲎试剂标示灵敏度的复核试验
❖ 实验目的 ▪ 验证实验室的条件是否满足BET实验的要求 ▪ 验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求 ▪ 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET水等） 是否满足BET实验的要求
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内毒素RSE或CSE
鲎试剂TAL
BET水复溶
能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶
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❖ 标准内毒素与环境内毒素 ▪ 标准内毒素
• 经人工精制并经生物效价测定的细菌内毒素,作为BET的参考标准品或对照 品
• 标准内毒素分内毒素标准参考品(RSE)和内毒素工作标准品(CSE)两种 • CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效
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1）供试品限值
▪ 安福隆水针，1ml：5MIU；药典要求内毒素限值
L=10EU/5MIU
2）试剂的选择
试剂名称
规格
标示效价
数量
TAL
0.1ml/支
0.25EU/ml
36
内毒素标准品（CSE）
10ng/瓶
10EU/ng（CoA）
1
BET（水）
50ml/瓶
<0.003EU/ml
1
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– 内毒素热原
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2、细菌内毒素
❖定义
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微 量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产 物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒 素生物活性的物质。
❖毒性反应
发热反应、白细胞反应、内毒素休克
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❖ 细菌内毒素与热原的关系
▪ 细菌内毒素是热原之一种 ▪ 医药工业接受的观点是,内毒素是目前医药工业中最普遍和最
❖ 验证实验
• 灵敏度复核试验 • 干扰试验
❖ 检查法
• 凝胶限量试验 • 凝胶半定量试验
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6、相关参数的计算
❖ 内毒素限值 ▪ 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M
L为供试品的细菌内毒素限值； K为人每千克体重每小时可接受的最大内毒素剂量； M为人每千克体重每小时的最大供试品剂量。
价法（中国）及浮动效价法（国际）
▪ 环境内毒素
• 环境内毒素是天然的内毒素普遍存在于水、空气及各种原料中,成份除了脂 多糖外还含有蛋白质、多糖和其它杂质,其两极活性不明显,致热性较弱。 BET的对象是环境内毒素。
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❖细菌内毒素检查
通常称使用鲎试剂来检测细菌内毒素的方法为 细菌内毒素检查法。 其中包括两种方法：凝胶法和光度测定法。
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3、鲎试剂
❖ 鲎试剂的分类
▪ 根据鲎的种类分类：
• 美洲鲎试剂（LAL） • 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）
▪ 根据检查方法分类：
• 凝胶法鲎试剂 • 光度法鲎试剂
▪ 根据鲎试剂的特异性分类：
• 普通鲎试剂 • 特异性鲎试剂
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4、细菌内毒素检查用水（BET水）
❖ 2005年版药典要求，凝胶法BET水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的 灭菌注射用水；光度测定法用的BET水内毒素含量应少于0.005EU/ml。
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1、热原
❖热原 热原是指临床上能引起哺乳动物发热反
应的物质。 ❖热原反应
医院临床在使用药品注射剂时，常有发 生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、 肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种 症状称为热原反应。
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❖热原分类
– 外毒素热原
外毒素是指某些病原菌生长繁殖过程中分泌到菌 体外的一种代谢产物。产生外毒素的细菌主要是 革兰氏阳性菌。