流式细胞术在临床应用中的影响因素

临床检验杂志２００２年第２０卷第６期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，Ｖｏ１．２０，Ｎｏ．６　３６５　文章编号：１００１—７６４Ｘ（２００２）０６—０３６５—０２　中图分类号：Ｒ４４６．１１３　文献标识码：Ｂ　流式细胞术在临床应用中的影响因素　

杜秀敏，孙晓明，尹格平，齐法莲（济南军区总医院实验诊断科，济南２５００３１）　关键词：流式细胞术；淋巴细胞免疫表型；影响因素　生产流式细胞仪（ＦＣＭ）的有关公司已推出多　种质控试剂盒用于光路与流路校正、线性度测试、荧　光强度标准化及颜色补偿等，以使某一实验室的批　问数据具重复性并与其他实验室的数据具可比性。　此外，样品细胞的分离与固定、抗体标记、上机测试　及数据分析是流式检测的一个连贯过程，此过程的　准确性与可靠性将直接影响检测结果，现就其中的　影响因素讨论如下。　１标本的采集及处理　１．１标本采集后放置时间的影响　流式细胞检测　是以某一群细胞为研究对象，因而在分离标本时，应　将所需的细胞从组织或血液中充分分离出来，及时　固定或深低温保存，以免组织发生自溶、ＤＮＡ降解　而造成测试结果的误差。血液标本采集后置室温，　不同时间对ＦＣＭ分析淋巴细胞免疫表型结果产生　显著影响。中性粒细胞、单核细胞共有的分化抗原　（ＣＤ４５）其表达水平随放置时间延长而显著增高，从　而影响Ｂａｃｋ—Ｇａｔｉｎｇ、ＣＤ４５一Ｐｅｒｃｐ／ＳＳＣ—Ｇａｔｉｎｇ淋巴　细胞门的准确设置。不同时间分析Ｔ淋巴细胞免　疫表型：１　ｈ和６　ｈ结果差异无显著意义（Ｐ＜　０．０５），１　ｈ和８　ｈ、６　ｈ和８　ｈ结果差异均有显著意义　（Ｐ＜０．０１）。６　ｈ内三色免疫荧光分析ＣＤ３　和　ＣＤ３　ＣＤ８　淋巴细胞的批内、批问和总重复性很　好…。故血液采集后应尽快进行免疫荧光染色和　固定，最迟不能超过６　ｈ。　１．２标本的准备　每一实验室都必须根据分析的　需要选用恰当的标本处理过程，并证实其有效。在　白血病（特别是急非淋）免疫分型时，若用淋巴细胞　分离液分离单个核细胞，因幼稚细胞体积大，离心后　有时会出现在血浆层中，若只吸取单核细胞层就会　造成异常细胞丢失，从而导致错误的结果＿２ｊ。为进　一步提高流式细胞仪对白血病的诊断率，操作中应　注意：（１）标本最好用ＥＤＴＡ抗凝，其次用肝素。标　本要求新鲜采集，不能发生凝血；（２）制备细胞悬液　时，使用红细胞裂解液使红细胞充分溶解【３１。有资　料表明＿４ｊ，分析ＣＤ３４　细胞最好采用全血一溶解一非　洗涤技术，因反复的离心与洗涤，可造成ＣＤ３４　细　胞的损失及细胞膜表面分子性质的改变，导致结果　不够稳定。美国临床实验室标准化委员会　（ＮＣＣＬＳ）建议根据外周血白细胞计数适当调整全　血用量及标准溶血剂的比例ｌ５１，以确保荧光标记抗　体与适当比例的细胞结合及精确的染色强度。　１．３固定剂的选择　固定时要根据所测物质在细　胞内还是胞膜表面选择合适的固定剂。在膜表面的　抗原物质，以醛类固定剂为宜，如１％～４％的多聚　甲醛缓冲液。若所测抗原物质在细胞内，可用醇类　固定剂，一般采用７０％的酒精。同一实验室最好采　用同一浓度、同一温度的乙醇固定细胞＿６ｊ。　２标本的免疫标记及上机测试　２．１实验对照的设立除单色、双色及三色免疫荧　光分析时要设立其相应的阴性对照外，在ＤＮＡ含　量分析时，还应将喜树碱（ＣＡＭ）２０　ｍｍｏｌ／Ｌ处理４　ｈ或用３０Ｇ７一射线照射３～６　ｈ的ＨＬ一６０细胞作为阳　性对照［　。　２．２免疫荧光标记的温度与时间　１００　ｌ细胞悬　液（１００）与适当的荧光标记抗体４～２０℃避光３０　ｍｉｎ。温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧　光染料分子的动力增大，使荧光淬灭的可能性增加。　样品免疫标记后要在２４　ｈ内完成其上机测试。用　荧光标记的Ａｎｎｅｘｉｎ—Ｖ与ＰＩ双染色检测细胞凋亡　时，应将细胞收集后在２０℃左右立刻标记，然后加　ＰＩ，立刻在ＦＣＭ上检测。ＰＳ的外翻不会因标记和　检测而终止，时间过长将会影响结果的准确性ｌ　。　２．３　ＦＣＭ的变异系数（ＣＶ）一般认为，实测结果　ＣＶ值包括两部分：即使用标准样品测得的仪器　ＣＶ值与实验样品所测得的ＣＶ值之和。仪器是否　准确校正，是通过一个非生物样品（荧光微球）或生　物样品（人淋巴细胞，鸡血细胞）的检测来验证，其　ＣＶ值应越小越好，一般小于２％。故上机前应以标　准荧光微球调整仪器的ＣＶ并稳定在２％以内。　２．４测试样品的数量与进样速度　金秀国＿８＿８等在　ＤＮＡ分析的影响因素研究中发现，测试５　０００细胞　／样品与１０　０００细胞／样品的ＣＶ值有明显差异，且　中、低速进样测得的ＣＶ值显著低于高速进样，因　此，除保证获取足够的样品细胞数外，要控制进样速　度。一般细胞数不小于１０　０００细胞／样品，进样速　

维普资讯 http://www.cqvip.com ３６６　临床检验杂志２００２年第２０卷第６期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，Ｖｏ１．２０，Ｎｏ．６　度控制在１００－－４００细胞　。　３数据分析时的影响因素　３．１设门对分析结果的影响　（１）ＭＯｄ　Ｆｉｔ　ＬＴ是　专门用于流式细胞术中细胞周期分析的软件。用此　软件分析先要在前向角光散射（ＦＳＣ）对侧向角光散　射（ｓｓｃ）及荧光２宽度（ＦＬ２一Ｗ）对荧光２面积　（ＦＬ２一Ａ）二维点图上设“门”，以排除细胞聚集体及　细胞碎片的干扰。（２）Ｃｈｅｎ等证实，不同白细胞表　达ＨＬＡ—Ｂ２７强度不一致，并认为ＦＳＣ—ＳＳＣ设门法　很难保证所分析细胞的纯度。因为用ＦＳＣ—ＳＳＣ设　门淋巴细胞，可能会有其他细胞混入，导致检验结果　不准确，而用ＣＤ３设门分析Ｔ淋巴细胞ＨＬＡ—Ｂ２７　的表达，则完全避免了这一现象，应是最佳选择＿９ｊ。　（３）ＦＣＭ分析淋巴细胞免疫表型时，必须设置淋巴　细胞门（ＬＧ）去除其他细胞、细胞碎片及仪器噪声的　影响，从而保证所分析的细胞是淋巴细胞。研究表　明不同的门设置方法可导致淋巴细胞免疫表型分析　结果出现显著差别：ＦＳＣ／ＳＳＣ—Ｇａｔｉｎｇ误差较大，应　尽可能不用；Ｂａｃｋ—Ｇａｔｉｎｇ改进了淋巴细胞门设置的　主观性误差，但实质仍是光散射门，不可避免地受到　未溶血的红细胞、有核红细胞等的干扰，已被特异的　设门方法如ＣＤ４５一ＰｅｒＣＰ／ＳＳＣ—Ｇａｔｉｎｇ、Ｔ—Ｇａｔｉｎｇ所　取代＿ｌ　。实验结果也表明ＣＤ４５一ＰｅｒＣＰ／ＳＳＣ　Ｇａｔｉｎｇ和Ｔ—Ｇａｔｉｎｇ比Ｂａｃｋ—Ｇａｔｉｎｇ更优越，尤其是　分析Ｔ细胞亚群时，Ｔ－Ｇａｔｉｎｇ的特异性更高＿ｌ　Ｊ。　（４）在白血病免疫分型中，传统的ＦＳＣ／ＳＳＣ设门法　只能排除成熟粒细胞及单核细胞，却无法识别正常　淋巴细胞，常常干扰分析结果，只有当样本中原幼细　胞占７０％以上时较易准确判断，一定程度上限制了　免疫分型应用范围＿１　。利用ＣＤ４５／ＳＣＣ设门法，可　以首先排除正常淋巴细胞的干扰，再通过双色或三　色荧光标记技术，针对性地对未成熟的原始幼稚细　胞进一步检测和分析，提高流式细胞仪免疫分型的　准确性和敏感性，尤其是白血病细胞数较低时，　ＣＤ４５／ＳＳＣ设门更加重要【ｌ２　Ｊ。　３．２　ＤＮＡ含量分析　（１）人为因素造成的死细胞　都会影响荧光参数。死细胞会成为Ｇｏ／Ｇ　期前峰，　可误认为是亚二倍体峰或凋亡峰。死细胞超过　２０％，结果多不可靠【ｌ３］。（２）正常二倍体组方图的　ＣＶ值大于８％以上，应放弃细胞周期的分析，但肿　瘤细胞ＣＶ值大于８％，这与肿瘤细胞ＤＮＡ异质性　增大有关＿ｌ　。依据Ｋｌｅｉｎ等提出的ＦＣＭ诊断肿瘤　细胞的标准，冯萍等＿ｌ　Ｊ研究发现，用浆膜腔积液脱　落细胞ＤＮＡ倍体分析来判断肿瘤的良恶性存在一　

定的假阳性与假阴性。造成假阴性的主要原因是肿　瘤细胞未脱落至浆膜腔，另外也与高分化的二倍体　肿瘤有关；假阳性可能与浆膜腔积液中存在大量的　炎性细胞和多核细胞有关。（３）单纯ＰＩ染色，并不　能确定凋亡的周期，须与ＴＵＮＥＬ或溴脱氧尿密啶　（Ｂｒｄｕ）掺人结合ｌ　ｊ。（４）一般凋亡主要发生于Ｓ或　ＧＭ期，大量细胞凋亡后，ＦＣＭ分析图上往往只见　Ｇｎ／Ｇ１及Ａ峰，此时，ＤＮＡ拟和软件已不适用　。　参考文献：　［１］王建中．流式细胞术分析血淋巴细胞免疫表型方法学研究［Ｊ］．　中华检验医学杂志，２０００，２３（４）：２０３—２０６．　［２］黄健，沈永生，王秀英．流式细胞术中标本处理对结果的影响　［Ｊ］．徐州医学院学报，１９９７，１７（６）：６５０—６５１．　［３］邹典斌，郭荣，张秋堂．流式细胞术在人急性白血病免疫分型中　的应用［Ｊ］．河南医科大学学报，２００１，３６（１）：５６—５８．　［４　ＪＢａｅｃｈ　Ｊ，ＪｏｈｍｅａＨＥ．Ｔｍｈｎｉｃａｌ　ａｓｐｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｌ￣ｃｔ　ｏｆ　ｈｍ，．ａｔｏｐｏｉ—　ｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅ￣ｔｏｒ　ｓｕ［ｘｓｅｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ￣Ｊｊ．Ｓｔｅｎ　Ｃｅｕ，２０００，１８：７６．　［５］Ｍａｒｉｌｙｎ　Ａ，Ｏｗｅｎｓ，Ｈｏｒａｃｉｏ　Ｇ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｉｍ—　ｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｉｎ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｊ　ｌｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ—　ｏｄｓ，２０００，２４３：３３—５０．　［６］贺兰湘，周济兰，杨峰．流式细胞术ＤＮＡ含量分析的影响因素探　讨［Ｊ］．陕西医学检验杂志，２０００，１５（４）：１７－１９．　［７］李莉，　Ｌ宪涛．细胞凋亡检验方法评价［Ｊ］．上海医学检验杂志，　２０００，１５（１）：５７—５９．　［８］金秀国，方国安，刘波．流式细胞术ＤＮＡ分析影响因素探讨［Ｊ］．　上海医学检验杂志，２０００，１５（３）：１５１．　［９］Ｃｈｅｎ　Ｊ　Ｃ，Ｄａｖｉｓ　Ｂ　Ｈ，Ｂｉｇｅｌｗ　Ｎ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｒｉｃ　ＨＬＡ－Ｂ２７　ｔｙｐｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ＣＤ３　ｇａｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｏｆ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｌｕｏ—　ｒｏｃｈｒｏｍｅ（ＭＥＳＦ）ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ［Ｊｊ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９６，２６（４）：２８６—　２９２．　［１０］１ＣＳＨ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｚｅｒｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｈｏｓｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｄ　ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｍａｋｅｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｕｎｃｉｌ　ｆｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　１ＣＳＨ　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｐａｎｅｌ　ｏｎ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．　Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ　Ｈａｅｍａｔ，１９９４，１６：１５７—１７４．　［１１］ＪｅｎｎｉｎｇｓＣＤ，ＦｏｏｎＫＡ．Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａｐｐｌｉ—　ｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　ｍａｌｉｇｎａｎｃｅ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９９７，９０　：２８６３．　［１２］翟志敏，何晓东，戴海明．ＣＩＮ５设门在流式细胞术检测急性白　血病中的应用［Ｊ］．中国实验诊断学，２００１，１０（５）：２４８—２４９．　［１３］陈姗姗．流式细胞术用于临床检验中的一些问题［Ｊ］．中华检　验医学杂志，２０００，２３（４）：１９７．１９８．　［１４］左连富．流式细胞术与生物医学［Ｍ］．沈阳：辽宁科学技术出　版社，１９９６．２０７．　［１５］冯萍，单卫民，俞秋兴．浆膜腔积液脱落细胞ＤＮＡ倍体分析在肿　瘤良恶性判断中的应用［Ｊ］．苏州医学院学报，２００１，１２（１）：４５．４６．　［１６］Ｇｏｄａｒｄ　Ｔ，Ｄｅｓｌａｈｄｅｓ　Ｅ，Ｌｅｂａｉｌｙ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｅｔ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅｑｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｙ—　ｔｏｍｅｔｒｙ，１９９９，３６（２）：１１７—１２２．　（收稿日期：２００２　０５—１０。修回日期：２００２—０６—３０　Ｊ　（本文编辑：陈军）