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肠道病毒（CA16）核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）说明书【产品名称】通用名称：肠道病毒(CA16) 核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）说明书英文名称：CA16 Real Time RT-PCR Kit【包装规格】48人份/盒【用途】本试剂由国家疾病预防控制中心病毒病预防控制所脊灰实验室、浙江省疾病预防控制中心病毒所共同研发，杭州博日科技有限公司生产。
试剂通过对样本中肠道病毒（CA16）的特异性RNA 核酸片段进行定性检测，可用于临床对可疑感染患者的病原学鉴别的辅助诊断。
【检验原理】本试剂盒采用Thermus thermophilus HB8 株来源的rTth DNA 聚合酶，该酶在二价锰离子（Mn2+）存在下具有很强的逆转录活性，利用该特性，结合荧光探针技术，一步法逆转录扩增样本中肠道病毒（CA16）的特异性RNA 。
可用于临床及科研对CA16的辅助诊断和抗病毒药物的疗效观察。
【主要组成成份】 试剂盒组成数量 组份 A 液600ul×1 含有rTth DNA 聚合酶和dNTP 等的溶液 CA16引物探针 72ul×1 含有引物、探针的溶合液 核酸扩增试剂 B 液60ul×1 阴性对照200ul×1 CA16 RNA 阴性的ddH 2O 临界阳性对照 200ul×1 CA16 RNA 阳性的低浓度灭活病毒 对照品 强阳性对照200ul×1 CA16 RNA 阳性的高浓度灭活病毒 其他DEPC 水 1.0ml×1【储存条件及有效期】1） 试剂盒必须在冷冻条件下运输。
2） 试剂盒保存：请在-20℃保存，融解后须上下颠倒混匀方可使用。
使用后重新-20℃保存，通常冻融10 以内不会影响实验，但也请尽量避免反复冻融。
如果一次使用量较少，可以在融解后分装成几管，每次取一管使用。
如果短期内需多次使用，可在4℃保存，但须在2 个月内用完。
注意必须避光保存。
微生物技术在城市污水处理中的应用分析张晓丹摘要：水的致病污染可给人体健康带来显着风险，细菌、病毒、原生动物和蠕虫可以通过人体直接接触水或饮用来感染，纵观历史进程在全球范围内曾发生多起微生物污染直接引发疾病暴发事件，因此对水体中多种类型的潜在传染性病原体进行监测和控制具有重大意义。
本文根据笔者工作实践，对微生物技术在城市污水处理中的应用进行了分析和探讨。
关键词：微生物；技术；城市；污水；处理；应用1 微生物学技术在供水工程中的应用1.1 水中致病菌与指标菌的快速测定水中存在的多种致病菌对人体健康造成威胁，传统方法是采用分离培养来鉴定其种类和数量，但是费时较长且无法检测一些难以人工培养的细菌，从而低估了细菌种类和数量的实际值。
研究表明PCR技术测定大肠杆菌灵敏性佳，以大肠杆菌细胞计，检测限可达到每100 m L水中可检测到1个。
通过PCR技术快速检测3种消毒方式水样中的大肠杆菌，并且与滤膜培养法的结果进行分析对比，研究显示PCR技术适合在臭氧和氯剂消毒的水样中应用，其测定效果一致性良好，但是对紫外线消毒的水样易检出假阳性。
采用基因芯片法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、霍乱弧菌、军团菌、肠炎沙门菌等多种水体中可能存在的致病菌进行检测，研究结果显示该法能够同时特异性地对多种细菌进行快速检测，且灵敏度高、操作简单、稳定性和重复性较好。
1.2 水中病毒的快速测定水体中病毒具有不易检测、感染性强且致病剂量小的特点，这使其成为最为危险的威胁人体健康的一种病原体。
常规检测技术是先富集培养然后用电镜观察等，周期长、耗资大且精度较差，当前基因探针与扩增技术给快速检测病毒提供了重要方式。
采用PCR技术检测水样中的肠道病毒与甲肝病毒，其耗时与传统细胞培养相较缩短了50%。
通过RT-PCR技术监测海水甲肝病毒的污染状况，该方法检测病毒的灵敏性和定量分析的准确性很高。
PCR法可以反映病毒污染水样的情况，但无法进一步辨别出病毒有无感染性，然而综合快速、敏感、特异、经济等因素，该技术在预防病毒传播疾病和评估水环境质量等方面工作中可发挥重要作用。
PCR技术在临床检验中的应用聚合酶链反应又叫DNA扩增技术。
进入到21世纪以来，在标本中，分析研究与鉴定检测特定的体外基因扩增技术重要方法就是PCR技術。
近些年以来，这项技术在许多研究领域以及临床的应用中都发挥着重要作用；同时PCR技术在遗传病诊断与传染病病原体鉴定以及癌基因治疗等众多方面均有十分重大的贡献。
本文主要是对PCR技术在临床检验中的应用进行分析和探讨。
标签：PCR技术；临床检验；应用1 PCR技术的概述PCR技术的基本原理是在扩增区域的两端，用两条互补的双链DNA模板引物，利用DNA聚合酶，引物会引发互补的DNA链。
在这个过程中，一条引物所引发的DNA链可以合成另外一条新的DNA链，循环反复多次以后，导致这两条引物之间的DNA大量复制[1]。
PCR技术的循环反应主要是由变性和退火以及延伸这三个基本步骤组成的循环。
PCR技术在基层疾病检测中的应用，是当今社会较为常见的。
对于肝炎病毒、肠道病毒、呼吸道系统感染、性病病原体等检测，PCR技术的敏感度精确度要比传统方法高。
2 PCR 技术在临床检验中的应用2.1PCR技术在传染性疾病检测中的应用目前我国典型的消化系统感染性疾病包括肝炎、胃炎等。
引发肝炎的病原体主要为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等。
使用PCR法对血清中的乙肝病毒进行检测的优势主要体现在早期诊断，并且在酶标试剂无法检测的情况下，PCR可以检出，大大缩短窗口前，使得患者能够得到早期诊断和治疗[2]。
2.2 PCR技术在肿瘤方面的应用现阶段，肿瘤的发病分子机制还不是完全的清楚。
PCR技术在肿瘤相关基因和肿瘤病毒病因以及肿瘤相关抑癌基因的研究方面，都已经得到了非常好的成果。
根据相关的资料表明，鼻咽癌与Burkitt 淋巴瘤以及EB病毒是有关系的；泌尿道肿瘤与食管肿瘤等以及人乳头瘤病毒是有关系的[3]；原发性肝癌和乙型肝炎病毒是有关联的。
通过癌基因或者基因变化的检测，人体癌的演变时，可以以肿瘤作为标志物直接应用在临床检测。
附件水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法NIEA E201.54B一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ±1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。
二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。
三、干扰(一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。
(二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。
四、设备(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。
(二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。
(三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。
(五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。
(六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。
(七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。
(八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。
(九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。
(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
(十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。
(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测一般采用以下方法：
1. 高级培养基方法：将取样的水样加入适当的营养培养基中，培养出细菌，并计数大肠菌群的数量。
常用的培养基有大肠杆菌培养基、MacConkey培养基等。
2. 荧光定量PCR方法：通过PCR技术检测水中大肠菌群的DNA，使用荧光探针结构标记大肠杆菌特异性基因，通过测定荧光信号进行定量分析。
3. 流式细胞仪方法：将水样进行染色，然后通过流式细胞仪分析计数大肠菌群的数量。
常用的染色方法有DAPI染色法、荧光活菌染色法等。
4. 基于微生物生物传感器的方法：利用微生物细胞对特定细菌的识别和响应能力，设计合成生物传感器来监测水中大肠菌群的存在和数量。
以上方法可根据实际需要选择使用，各自具有不同的优缺点。
在进行水环境监测时，可以结合多种方法进行检测，以获得准确和可靠的结果。
水中耐热大肠菌群检测方法水中耐热大肠菌群检测是一种用于评估水质和判断水域环境卫生安全的重要方法。
下面是关于水中耐热大肠菌群检测的10条基本信息以及详细描述：1. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过将水样中的细菌标记并通过流式细胞仪进行检测和计数的方法。
适用于快速分析水样中的大肠菌群含量。
2. 膜过滤法：膜过滤法通过将水样通过膜滤器，筛选并集落大肠菌群，并在适当的培养基上进行培养，可用于定量检测水样中的大肠杆菌。
3. PCR技术：PCR技术通过引物对大肠菌群的DNA进行扩增，从而快速检测水样中的大肠菌群的数量和种类。
可以利用PCR技术进行快速筛选和检测水质。
4. 培养方法：传统的培养方法通过将水样中的细菌在适当的培养基上进行培养，进行形态和生理特性的观察，并通过计数菌落形成单位(CFU)来评估水样中大肠菌群的含量。
5. 颜色指示法：这种方法通过将水样与专门的指示剂配合使用，观察颜色变化以识别大肠菌群污染。
可以通过比较颜色的深浅程度来估计水样中大肠菌群的含量。
6. 微生物生化方法：利用大肠菌群的特定生化反应，如气体产生、酶反应等来判断水样中是否存在大肠菌群污染。
适合用于水样中大肠菌群含量的快速筛查。
7. 荧光显微镜技术：荧光显微镜技术利用特定的荧光探针标记细菌，通过显微镜观察细菌的形态和分布情况，可以用来定性检测大肠菌群。
8. 免疫学检测方法：免疫学检测方法通过检测水样中的大肠菌群特异性抗原或抗体来判断细菌的存在与否。
可以利用快速免疫层析法或ELISA法进行大肠菌群的快速检测。
9. 流动细胞技术：流动细胞技术将水样通过流动细胞仪，利用荧光标记的细胞特异性探针检测水中的大肠菌群。
可用于快速检测水质中大肠菌群的含量和分布。
10. 分子生物学方法：分子生物学方法可以通过分析水样中的DNA或RNA序列，利用特定的引物对大肠菌群进行特异性检测。
使用16S rRNA基因扩增子测序技术可以鉴定水样中的大肠菌群种类和丰度。
肠道病毒的PCR检测方法评价与改进肠道病毒是一类病毒，可以引起婴儿、儿童和成人的肠胃炎症，也会出现其他症状，例如发烧、头痛和呕吐等。
这种病毒主要通过粪口途径传播，因此其检测方法十分关键。
本文将就当前肠道病毒PCR检测方法进行评价，并对其改进做出探讨。
肠道病毒PCR检测方法评价PCR方法是一种高效、快速、特异性、灵敏度高的检测技术，近年来被广泛应用于肠道病毒的检测。
但是，PCR方法本身也存在一些问题。
1. 受污染样本引起的假阳性PCR方法是一种类似放大镜的技术，可以多次扩增样本中的DNA或RNA。
但是，污染样本中的DNA或RNA也会被不小心扩增，从而导致假阳性结果。
这一问题可以通过采取防止交叉污染的措施来避免，例如在每次PCR操作之前对材料进行清洁和消毒。
2. PCR抑制如果PCR反应体系中存在抑制PCR反应的物质，例如某些胆固醇、脂肪酸、血红素和酶等，将导致PCR反应不稳定，或者根本无法进行。
因此，在进行PCR反应时，需要保证反应体系的纯净，以便避免这种情况的发生。
3. 杂交交叉在PCR反应中，如果引物或探针与某些非目标序列杂交，将产生杂交交叉的问题。
这种问题通常可以通过优化PCR反应条件，例如缩短PCR扩增时间、调整PCR反应体系中的引物和探针浓度、调整PCR反应体系中的MgCl2浓度等方法来解决。
4. 稳定性PCR方法产生的结果通常具有很高的可重复性和再现性。
然而，由于样品的因素，例如样品稀释度、样品质量等，PCR方法在不同的实验条件下也会引起结果的差异。
因此，在进行PCR反应时应该控制好实验条件，确保实验环境的一致性。
PCR检测方法改进通过对当前PCR检测方法进行分析，得知当前PCR检测方法在杂交交叉和PCR抑制的问题上存在一定的局限性。
为了改进当前PCR检测方法的问题，建议采用以下措施。
1. 引物合成设计引物是PCR检测的一个关键步骤。
对于某些极为多样性的病毒，设计引物是一件十分困难的事情。
水中耐热大肠菌群检测方法水中耐热大肠菌群是指在水体中生存繁殖的耐热性强的大肠杆菌及其近缘菌种。
这些菌群可以引起水污染，可能对人类健康造成潜在风险。
因此，水中耐热大肠菌群的检测对于水质评估和公众健康至关重要。
本文将介绍一种常用的水中耐热大肠菌群检测方法。
传统方法：1.涂标法：将水样涂于大肠杆菌选择性琼脂培养基的表面，培养并检测菌落形成。
2.溶解法：将水样固体沉淀后，培养在大肠杆菌选择性琼脂培养基中，培养并检测菌落形成。
这些传统方法的主要优点在于简单易行，但也存在着一些缺点，如操作时间长，对菌种的选择性不够明确，容易产生假阳性和假阴性结果等。
随着生物技术的不断发展，现代分子生物学技术的应用广泛，水中耐热大肠菌群的检测方法也得到了很大的改进和完善。
现代方法：1.PCR法：PCR（聚合酶链式反应）是一种高灵敏度的核酸检测方法，可以直接从水样中检测到耐热大肠菌的DNA。
通过PCR扩增特定的基因序列，如16SrRNA基因序列，来进行耐热大肠菌的检测。
这种方法具有高度的特异性和灵敏度，可以快速准确地检测到耐热大肠菌的存在。
2.荧光原位杂交法：荧光原位杂交（FISH）是一种直接在原位上检测特定细菌群落的方法。
通过标记具有亲缘关系的细菌的特定DNA序列，然后在水样中进行原位杂交，通过荧光显微镜观察，并计数特定菌群的数量。
这种方法不仅可以定量，还可以确定细菌群落的分布情况。
3.基于纳米技术的检测方法：近年来，基于纳米技术的检测方法也得到了广泛的应用。
例如，通过使用有特定响应于耐热大肠菌存在的纳米材料，如金纳米颗粒，可以实现对耐热大肠菌的快速检测和定量，并且具有高灵敏度和良好的选择性。
综上所述，水中耐热大肠菌群的检测是十分重要的，可以通过传统方法如涂标法和溶解法，也可以通过现代方法如PCR法、荧光原位杂交法和基于纳米技术的检测方法来进行。
这些方法各有优缺点，需要根据实际需要来选择合适的检测方法。
随着技术的发展和进步，相信将会有更多更高效的水中耐热大肠菌群检测方法被开发出来，为水质监测和公众健康保护提供更好的支持。
市售瓶装矿泉水微生物的检测与分析自然界的水中含有细菌、淡水藻类、原生动物、病毒等多种类型的微生物，其中有一些微生物可直接或间接导致人类患病。
虽然市售瓶装矿泉水在装瓶前一般会对水源进行过滤灭菌处理，但是并不排除部分厂家因考虑成本的因素而未进行严格操作，因而目前市场上的瓶装矿泉水仍存在安全隐患。
标签：瓶装;矿泉水;微生物;检测;防治水是生命之源，人類的生产活动离不开水，水质安全是人类健康的第一要素。
随着生活水平的不断提高，人们对饮用水的安全问题日益重视，而瓶装矿泉水饮用方便、易于携带，因此已成为人们日常生活中不可或缺的饮品。
1 细菌菌落总数的测定1.1 平皿计数法平皿计数法所用的培养基为营养琼脂培养基，将1mL的水样与冷却至45℃以下的未凝固的营养琼脂混匀于培养皿中，待凝固后翻转培养皿，放进36℃的恒温培养箱中培养48h后取出计数。
营养琼脂的浇灌量需一致，菌落总数不在30～300CFU/mL范围的样品要重新制作（增加水样或稀释水样）。
1.2 涂布平板法涂布平板法所用的培养基可以为营养琼脂培养基，也可以为牛肉膏蛋白胨培养基。
将配制好且灭菌后的培养基趁热倒入无菌平板中，待凝固后再吸取0.1mL 水样滴于培养皿上，用涂布棒涂均匀，平放在桌上静置20～30min，使菌液完全渗入，然后将平板倒转，于37℃下恒温培养48h计数。
2 大肠菌群数的测定2.1 多管发酵法多管发酵法是根据大肠菌群的发酵乳糖产酸产气的特征来检测水样中大肠菌群的方法。
多管发酵法包括乳糖蛋白胨发酵法和乳糖胆盐发酵法[9]。
乳糖蛋白胨发酵法所用的培养基有乳糖蛋白胨液体培养基和伊红美蓝平板培养基。
取1mL水样接种于乳糖蛋白胨发酵管中，放置一杜氏小管，于36.5℃条件下培养24～48h。
变黄且产气的再接种于伊红美蓝平板培养基上于36.5℃条件下培养24h，对可疑菌落进行革兰氏染色镜检，挑取符合特征的菌落用乳糖蛋白胨液体培养基进行确证试验。
2.2 滤膜法滤膜法分为国标滤膜法和酶底物滤膜法[10]。
基于PCR技术定量的实时测定意大利污水处理厂流入和流出样中肠道病毒Giuseppina La Rosa, Manoochehr Pourshaban, Marcello Iaconelli and Michele Muscillo总结：肠道病毒广泛存在于污水中，研究消除污水中这种病毒的处理效果和他们释放到环境中或通过回收的废水带来的潜在的健康风险，都是环境微生物学中非常重要的课题。
利用PCR（聚合酶链式反应）技术对罗马周边5个污水处理厂流入和流出水样中肠道病毒进行实时定量测定，发现三种流行病学的重要水性肠病毒：腺病毒、肠道病毒和诺沃克病毒（GⅠ和 GⅡ），并且和排泄物污染中的古菌指标进行了比较。
其中，腺病毒在处理前后的废水中浓度是最高的，进水中的平均浓度大小为：腺病毒＞诺沃克病毒GⅠ＞诺沃克病毒GⅡ＞肠道病毒，出水中的平均浓度大小为：腺病毒＞肠道病毒GⅠ＞肠道病毒＞诺沃克病毒GⅡ。
去除率分别为：肠道病毒35%，诺沃克病毒GⅠ78%，细菌99%。
由于分子量化不能有效的表明它们对人体健康的实际威胁，因此通过完全细胞培养和PCR技术对已处理的出水中的肠病毒微粒的传染性进行评估。
由传染性试验发现经过处理的水中活的细菌体通过排放进入环境会对公共健康带来潜在的威胁。
由此对病毒的存在和抗污水净化流程对有效的管理回收处理的废水有关的风险的潜在影响，以及它们进入环境的影响有一个更好的了解。
关键词：诺沃克病毒，腺病毒，肠道病毒，污水，实时定量PCR试验引言肠病毒主要是通过粪便排出，而当前的污水处理通常不能有效地去除这些生物体。
大量的经处理和未处理的污水排入水体中，会对农业、娱乐以及饮用水有潜在的影响。
当前，诸如粪大肠杆菌和肠球菌等细菌指标经常用于水质评价。
这些细菌很常见，并且测量费用便宜，但是作为粪便污染的指标不是很理想。
实际上，用当前的污水处理方法去除致病性肠道病毒比去除肠原杆菌更难。
不同的研究发现，不论哪种处理方法肠道病毒在污水中都保持一个较高的数量，由此提出用一种病毒指示器反应废水污染。
肠道病毒（EVs）和腺病毒（ADVs）就被建议用来作为监测水中人类粪便污染和确定消毒效果的指示。
对污水处理站的监测，为研究病毒在各自的生活区域中的循环和这些病毒在已处理出水中存留率提供了一个合适的途径。
目前研究的目标是评价废水处理前后三种流行病学的重要水性肠病毒：腺病毒、肠道病毒和诺沃克病毒（诺沃克病毒GⅠ和诺沃克病毒GⅡ）的浓度，得到对已处理污水的病毒污染的潜在传染性的观察，并获得消毒效果的初略估计。
作为对比，也对作为粪便污染指示的大肠杆菌和肠球菌两种肠原杆菌进行测量和量化。
肠道病毒只有单链RNA，是非包膜病毒。
肠道病毒感染的症状包括轻度上呼吸道疾病、发热性皮疹、无菌性脑膜炎、胸膜痛、脑炎、急性弛缓性麻、麻痹脊髓灰质炎、肠胃炎、心肌炎、心包炎和糖尿病。
腺病毒有双链DNA，是非包膜病毒，有52个血清型，分成A、B、C、D、E、F六个亚种。
感染症状包括肠胃炎、咽炎、肺炎、结膜炎,脑膜脑炎诺沃克病毒是鉴定急性非细菌性肠胃炎最常见的病毒，它有一单链RNA，这些病毒属于环状病毒科，分为GⅠ—GⅤ五个群。
各组病毒通过适当的实时定量PCR（或RT-PCR）实现量化。
实时定量PCR在水环境中是核酸量化的一种重要工具，该法灵敏，且有特异性，与其他方法相比更快，更简单。
定量分子试验不能区分活的和灭活的病毒颗粒，因此大量病毒颗粒存在并不能表明对人体健康的现实影响。
因此，评估已处理废水中肠道病毒感染性，可通过综合培养和实时定量PCR（ICC-RT–PRC），这是一种将灵敏的传统定量PCR与一个传染性试验相结合的方法。
方法样品采集选择意大利中部的五个不同城市的污水处理厂，每个厂之间相距30km。
这几个所选的污水处理厂都是用传统的活性污泥法处理城市污水。
废水在排入水体前，处理过程主要包括格栅分离，初级沉淀，二级生物处理和最终的氯消毒。
每天进入这些工厂的废水量从4800到750000m3不等，设计处理能力从60000到1100000人口当量，并且这些厂不处理工业废水。
总共采集50个样品（25个进水，25个出水，每个样品50mL）。
从2007年5月到9月，每月采样一次。
每次采样时间为一个星期天早上，用50mL无菌的离心管储存置于4℃恒温袋中，在24小时内送回实验室。
病毒浓缩和RNA提取病毒的浓缩如前所述，简单地说，4℃下以3000×g样品离心分离10min，再取上清液以200000×g离心分离2h。
在悬浮液中加入1mL磷酸盐缓冲液使悬浮颗粒溶解，在-80℃下保存到提取出基因组。
为评估病毒复活率，在50mL蒸馏水中加入1.91×108个艾柯病毒2（康纳利斯菌株，美式培养，ATCC，VR-32）的基因组拷贝（GC），计算用实时定量PCR浓缩后与浓缩前基因拷贝数的比率。
用NucliSens miniMAG核酸分离装置从100μL病毒颗粒中分离出RNA和DNA，该装置是基于大量核酸提取方法和磁硅珠的结合，用于收集和洗涤磁硅颗粒，并从磁珠上复原核酸。
病毒从100μL的脱洗缓冲液中的硅颗粒上脱离，在-80℃下储存。
Italia, Florence, Italy)细菌学试验试验前，保证样品的完整性和可分析性。
对大肠埃希氏菌，使用微量滴定板，按照制作流程“用微型方法计算表面大肠埃希氏菌数目和废水的MUG/EC”。
相似的，对肠球菌，使用微量滴定板按照制作流程“用微型方法计算表面大肠球菌数目和废水的MUG/EC”。
所有这些流程都是根据ISO程序（ISO 9308-3,1998，ISO-7899-1，1998）。
在这两种情况下，细菌数与荧光多少一致，用最可能数字表示，与ISO 8199一致。
定量标准用绝对量化确定样品中病毒基因拷贝数量，通过连续的10倍稀释（108-101）腺病毒的线性质粒DNA，肠道病毒和诺沃克病毒GⅠ和诺沃克病毒GⅡ的ssRNA溶液，制作外部校准曲线。
标准液是无核酸酶但含有tRNA的稀释液（100ng/μL）。
诺沃克病毒GⅠ和诺沃克病毒GⅡ的定量标准，先前设定为ssRNA链的762核苷酸和591核苷酸，分别包含RNA聚合酶部分密码组序列。
对诺沃克病毒的定量分析是在ORF1和ORF2两个区域，使用特定基因族群集团试验，对基因组片段Ⅰ和Ⅱ分别用改良的TaqMan试验，能够扩大到96bp和98bp。
腺病毒量化的校准曲线是从重组pCR4TOPO所含蛋白质基因部分在一个线性Hind Ⅲ质粒上测得。
TaqMan定时定量PCR是用Hernroth及其合作者的试验，并作细微的修改，放大了hexon基因保守区域到69-bp。
肠道病毒量化的标准RNA是由一个从包含整个脊髓灰质炎病毒1基因组克隆成的pGEM-4Z载体的pVRB106上获得amHI220-670片段（451-bp）。
重组质粒用Qiagen制备。
获得DNA模板后，用RiboMAX大型RNA生产系统T7制作RNA模板。
由T7仪器转录513核苷酸ssRNA，并用ND-100仪器量化。
ssRNAme复制体的聚合浓度用下式计算：GC/mL=C/MW*6.02×1023，其中C是RNA浓度（C=g/mL），MW是分子量。
根据Donalson及其合作者的试验量化PCR，该试验是基于对5号区（192bp）的TaqMan探针水解。
表2表示引物和PCR的使用。
定时定量PCR定时定量PCR是用ABI－PRISM 7000连续检测仪测定10μL提取出的基因复制品。
反应在一次性96孔光学平板上进行，加入25μL腺病毒SensimiｘDNA和肠道病毒及诺沃克病毒的单段Sens miｘRNA的混合物。
对腺病毒，反应混合物在50℃下加热2min然后在95℃下加热10min；保持40个周期的活性，每个周期包括在95℃变性15s，在60℃退火1min。
对肠道病毒及诺沃克病毒的反应混合物先在42℃培育45min转录RNA。
这是因为量化PCR非常灵敏，要防止样品受污染就需在准备，试剂混合，抽样及凝胶电泳阶段单独进行；试剂和样品储存在不同房间中，并且各个房间使用的仪器不能在其他的房使用。
PCR混合控制和提取控制系统结合使用。
标准曲线用Sequence Detection System软件制作，绘制周期阈值（Ct）与病毒复制体数量的曲线。
运行的可接受性被定义为一个相关系数（R2）＞0.98，斜率在-3.6到-3.1之间，对应反应效率在90到110%之间，由方程Efficiency=10（-1/slope）—1。
为验证样品实用性，重复测试负样，在实时混合样中加入RNA或DNA标准样。
数据分析定时定量PCR的再现性通过内部和外部试验的可变性（同一天的复制品和其他时间在完全相同试验条件之下的变化）评估。
用变异系数（%CV）来量化标准曲线在不同稀释值下的Ct值变化。
量化数据用Excel软件导出做统计分析。
去除计算方程如下：R（%）=（MPCout—MPCin）/MPCｘ100，其中，MPCout 是指出水样品中病原体浓度，MPCin是指进水样品中病原体浓度。
这意味着细菌平均值比病毒削减20%。
此外还能计算最大值和最小值。
细胞培养分析和预测人类肠道病毒处理水样中类肠道病毒传染性分析使用人类横纹肌肉瘤（RD）细胞。
浓缩和超速离心分离后，用氯仿提取物净化200μL病毒悬液，并接种到25cm2的组织培养瓶中。
被丢弃的培养液和细胞用4mL维护媒介（Dullbecco修改过的媒介DMEM）覆盖。
一般培养液在5%的CO2中与37℃下培养5天每天用光学显微镜观察。
一个艾柯病毒2菌株（VR-32，ATCC，USA）做一个正控制；未感染细胞做负控制。
细胞培养应在PCR上设物理隔绝。
5天后，培养瓶中有CPE出现，然后冷冻和解冻三次。
取200μL上清液用NucliSens miniMAG法从中提取病毒核酸，RNA存在于最终的100μL的上清液中。
在定时定量PCR扩大培养中用10μL纯化病毒核酸，测量细胞培养后病毒复制数。
通过ICC-RT-PCR获得的产品对其进行分析，确认肠道病毒的存在，还可能获得更多肠道病毒类型的信息。
这是通过在2%琼脂糖凝胶喊溴化乙锭（0.5mg/mL）中运行PCR（预期达192bp），并用紫外线照透器观察。
在毛细管自动序列发生器（ABI棱镜310基因分析仪））中一些正样品被净化。
结果浓缩效率该方法的浓缩效率是用定时定量PCR测定，使用参入艾柯病毒2（一式三份）的蒸馏水，并计算病毒拷贝数在浓缩前后的比率。
超过5.4×10８/标准病毒反应，1.98×10８GC/恢复反应（SD=7. 3×10７），收益率为35.4%±3.3%。
细菌学结果定量细菌学数据如表一所示。
