辣根过氧化物酶

神经生物学形态学方法（总结）一、束路追踪法（神经形态示踪方法）1. 辣根过氧化物酶示踪技术1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技术，即HRP法。

HRP法的基础是轴浆运输。

轴浆运输是神经元的一项基本活动，即沿其轴突有从胞体向末梢（顺向）及从末梢向胞体（逆向）的物质转运。

且不同的物质有不同的运输速度。

轴浆运输的特性为HRP在轴浆运输及其跨神经元的示踪技术奠定了基础。

该法为研究神经元之间的联系提供了一种简便可行的方法。

HRP是从辣根中提取出来的过氧化物酶，为一种结合酶，由一分子无色的酶蛋白与一分子棕色的铁卟啉辅基结合而成。

HRP比较稳定，63℃加热15min不失活。

其分子量约为40000，直径3.0nm，在水化情况下直径为5.34nm。

1966年，Shannom等曾将HRP分出A1、A2、A3 、B、C、D和E七种同工酶。

1976年，Bunt等曾试验了中枢神经系统对不同的HRP同工酶的摄取及运输能力，发现A同工酶几乎无逆行运输现象，而B、C同工酶的逆行运输效果较好，由此可见，HRP的选择是HRP追踪法成败与否的一个关键因素。

HRP法建立的早期，仅用于逆行追踪，即将HRP注入神经的末梢部位，经逆行轴浆运输至胞体，再通过酶组化染色显示。

以后的实验证明，HRP也可用于顺行运输，即将HRP注入神经元胞体所在部位，HRP可顺向运送至末梢部位。

近年来也发现，HRP注射于感觉神经末梢周围不仅可逆向标记背根节细胞，还可进一步沿背根节细胞顺向标记其所在脊髓的中枢投射，称为跨节标记（transganglionic labeling）。

与过去用于显示由损伤而引起纤维溃变的银染法相比，HRP法可更精确地研究神经纤维的联系。

辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性李忠琴1 许小平2 杨海麟1 王武#11（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036） 2（福州大学化学化工学院，福州350002）摘 要 研究了以辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色新体系，检测黄嘌呤氧化酶（XOD ）活力的新方法。

确定该酶活性测定的最佳条件为：辣根过氧化物酶（HRP ）7000U /L ，4-氨基安替比林（AAP ）1mmol /L ，苯酚（PA ）6mmol /L ，黄嘌呤（XAN ）1mmol /L 溶于50mmol /L Tris-CL 缓冲液（pH 8.4）；反应温度为37℃，保温时间为20min ；检测波长为508nm 。

本方法测定XOD 酶活的线性范围为5.0～100.0U /L ，线性关系良好（r =0.9992），检出限为1.3U /L 。

该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。

可有效应用于普通实验室和临床常规生化检测。

关键词 黄嘌呤氧化酶，辣根过氧化物酶，酶的活力测定，分光光度法2005-08-30收稿；2005-12-05接受本文系福建省自然科学基金（No.C0410006）和工业生物技术教育部重点实验室基金（No.KLIB-KF200502）资助项目1 引 言黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase ，XOD ，EC 1. 2. 3.22）是一种钼羟类胞质缀合酶。

主要用于痛风、心肌梗塞和细胞损伤后次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测［1～3］。

目前测定黄嘌呤氧化酶活力主要采用NBT /MTS-PMS 比色法、紫外分光光度法、电化学法及放射化学法［4～8］等方法。

但比色法形成的显色物溶解度低，PMS 对XOD 活性有一定的抑制，且NBT 、MTS 和PMS 试剂昂贵。

紫外分光光度法中黄嘌呤和尿酸的紫外吸收波长较接近，直接进行紫外检测，干扰严重。

其余两种方法操作繁琐，仪器设备要求高而难于推广。

本实验根据辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）［9］和黄嘌呤氧化酶的反应特性，提出了用XOD 偶联辣根过氧化物酶，直接测定黄嘌呤氧化酶活力的新方法。

酶联免疫吸附试验常用的酶和底物
酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种常用的免疫学检测方法，其中常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。

辣根过氧化物酶在底物存在下可以将无色的供氢体转化成有色产物，而碱性磷酸酶可以将底物转化成有色产物。

此外，根据实验需求，还可以选择其他种类的酶，如β-半乳糖苷酶等。

在选择酶时，需要考虑其底物类型、反应速度、稳定性以及成本等因素。

同时，还需要选择合适的底物，以与酶结合并产生颜色反应。

常用的底物包括酚类、硝基苯磷酸盐等，这些底物可以在酶的作用下产生颜色变化，从而用于检测抗原或抗体。

总之，在选择酶和底物时，需要综合考虑实验需求、反应速度、稳定性以及成本等因素。

hrp标记二抗的显色原理
HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记二抗是一种被广泛用于免疫
染色的技术。

该技术是一种非常敏感的技术，能够快速准确的检测和定位细胞的特定抗原。

它的基本原理是利用多氧化物酶HRP的特定特性配合荧光物质和碘醛来染色检测抗原，具
体的检测过程如下：
首先，把HRP标记的抗体和抗原结合在一起，结合相应的抗原，无论是单链抗体还是
双链抗体，它们都能够与抗原结合形成特异性抗原抗体复合物，HRP标记抗体在此过程中
就充当特异性抗原抗体的角色。

接着，在抗原抗体复合物的反应中添加一种叫做TMB的化学物质，此时HRP标记的抗
体就会利用原子氧做过氧化反应，产生了装着三价碘原子的化合物，即碘醛。

碘醛与TMB
发生反应，溶解发生发蓝色，最终形成显色物质，就可以对抗原进行检测出来。

HRP标记二抗的显色原理是基于HRP标记抗体发挥结合特异性反应，以及HRP多氧化
活性，HRP标记抗体结合到目标抗原所产生的特异性抗原抗体复合物中，利用HRP的多氧
化特性加氧反应，将氧化现象应用到与其体外透明的TMB的溶液系统中，TMB与碘醛发生
反应，并生成特征的蓝色，形成蓝色沉淀，而这种蓝色沉积的大小就代表了物体存在的抗
原抗体的数量，因此我们就可以用这种来方法判断抗原的存在数量。

辣根过氧化物酶催化降解间苯二酚的研究王亚丽;魏娟娟【摘要】研究了不同反应条件对辣根过氧化物酶催化H2O2氧化降解间苯二酚的影响,主要包括溶液pH值、反应温度、反应时间、H2O2用量、间苯二酚初始浓度等.结果表明:间苯二酚在辣根过氧化物酶催化、H2 O2氧化的反应体系中性质不稳定,且易被降解,在合理的反应条件下,间苯二酚的降解率达到了96.1％.【期刊名称】《宁夏师范学院学报》【年(卷),期】2015(036)006【总页数】8页(P47-54)【关键词】辣根过氧化物酶;间苯二酚;降解【作者】王亚丽;魏娟娟【作者单位】宁夏师范学院化学化工学院,固原756000;宁夏师范学院化学化工学院,固原756000【正文语种】中文【中图分类】O643.3间苯二酚废水具有色度高、有机物含量高、成分复杂、难降解等特点，是典型的毒性有机工业废水，环境危害极大[1].目前，国内外常用的处理降解废水的方法分为三大类：物理法、化学法和生物法[2].通常物理法和化学法处理效率较高，但是处理量较小，费用高，难操作，投加的化学药品易引起二次污染等[3].相比之下，生物法处理费用较低，简单易行[4]，而且可以大规模化应用.在废水处理的研究中，辣根过氧化物酶得到了广泛应用.辣根是一种常年生长的香草，它的根有一种含量丰富的过氧化物酶，被称为“辣根过氧化物酶”，而“辣根过氧化物酶”因其具有高效的催化性能[5]，成为很多废水处理中首选的生物高效催化剂.同时辣根过氧化物酶可应用于有机合成、相关酶检测、生物转化、发光检测、临床化学、免疫检测、环境化学等领域[6-9]，它能够催化过氧化氢氧化一系列有机物和无机物，如苯酚、间苯二酚、联苯胺及其取代物，其在环境降解方面日益受到人们的青睐[10].基于生物降解的环保性，本实验采用绿色氧化剂H2O2氧化、辣根过氧化物酶(HRP)催化降解间苯二酚，以此探究该方法针对间苯二酚的降解效果.间苯二酚的结构如图1所示.辣根过氧化物酶(RZ=1.5，阿拉丁化学试剂有限公司)；盐酸(GR，西安化学试剂厂)；间苯二酚(阿拉丁化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(AR，西安化学试剂厂)；磷酸氢二钾(AR，西安化学试剂厂)；30%的H2O2 (国药集团化学试剂有限公司). 分析天平(BS 124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；pH酸度计(pH S-25，上海精密科学仪器有限公司)；移液枪(100 μL～1000 μL，20 μL ～200 μL，百得实验仪器有限公司)；微量进样器(10 μL，上海安亭微量进样器厂)；紫外-可见分光光度计(UV，TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司)；傅立叶变换红外光谱仪(WQF-510，北京瑞利分析仪器公司)；高效液相色谱仪(G1314B，安捷伦科技有限公司).磷酸缓冲溶液的配制：取一定体积的0.1 mol·L-1的 KH2PO4 溶液，加入少量的0.1 mol·L-1K2HPO4 溶液，用1∶1的盐酸溶液调节成 pH值为1～4的磷酸溶液. 取一定体积的0.1 mol·L-1的K2HPO4溶液，用0.1 mol·L-1KH2PO4 溶液互调成pH为5～8的磷酸缓冲溶液.间苯二酚溶液配制：称取0.1376 g间苯二酚于250 mL容量瓶中定容，用超纯水配制成浓度为5 mmol·L-1的储备液.用移液管移去不同体积的储备液于50 mL的容量瓶中定容，配制成所需不同浓度的间苯二酚溶液，溶液均保存于阴暗干燥处. 称取0.0145 g的辣根过氧化物酶用 pH 为7 的磷酸缓冲溶液定容在1.5 mL的离心管中，配制成浓度为0.0097 g/mL的辣根过氧化物酶溶液.在紫外-可见分光光度计上，以pH为7的磷酸缓冲溶液为参比，在200 nm～700 nm的波长范围内对所配酶溶液扫谱，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线如图2所示，计算HRP 的纯度RZ=A380/A280，为1.09.间苯二酚特征吸收波长的确定及标准曲线的绘制：在紫外-可见分光光度计上，以超纯水为参比，在200 nm～400 nm的波长范围内对间苯二酚溶液扫谱，每隔10 nm记录不同波长下的吸光度，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，如图 3 所示，确定特征吸收波长为265 nm.配制浓度分别为0.2 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1、1. 0 mmol·L-1、1.2 mmol·L-1的间苯二酚水溶液，在5.0 mL的离心管中，加入1800 μL pH为4.0的磷酸缓冲溶液、200 μL不同浓度的间苯二酚溶液，30℃下恒温15 min，取出溶液加入到1.0 cm的石英比色皿中测定不同浓度的间苯二酚溶液在其特征吸收波长 265 nm处的吸光度，以吸光度-浓度作图得出间苯二酚的标准曲线，如图4所示，间苯二酚的初始浓度在0.2 mmo l·L-1～1.2 mmol·L-1之间呈线性关系.因此，把该范围应用于间苯二酚降解的整个实验中.间苯二酚降解的最佳条件测定：在5.0 mL的离心管中加入1600 μL不同pH的磷酸缓冲溶液、200 μL不同浓度的间苯二酚溶液和100 μL 0.0097 g/mL辣根过氧化物酶溶液，最后加入100 μL 2.0 mmol·L-1的 H2O2溶液开始反应，反应在30 ℃下进行，反应15 min.用紫外可见分光光度计测定间苯二酚在其特征吸收波长265 nm处吸光度值，按下面公式计算间苯二酚降解率:在5.0 mL离心管中加入1600 μL pH为4.0的磷酸缓冲溶液、200 μL浓度为0.6mmol·L-1的间苯二酚溶液、100 μL 0.0097 g/mL的辣根过氧化物酶溶液，最后加入100 μL 2.0 mmol·L-1的H2O2 溶液30 ℃下进行反应，考察反应时间对降解率的影响，结果如图5所示.间苯二酚在25 min～30 min时降解率增大较快，当反应时间到30 min 时降解率为54.8%，反应时间超过30 min后，降解率下降较快，随着反应的进行可能发生了副反应，影响降解.在5.0 mL离心管中加入1600 μL pH 为4.0的磷酸缓冲溶液、200 μL浓度为0.6 mmol·L-1间苯二酚溶液、100 μL浓度为0.0097g/mL辣根过氧化物酶溶液，最后加入100 μL 2.0 mmol·L-1的H2O2溶液，不同温度下反应30 min，考察反应温度对降解率的影响，结果如图6所示.由图可知，间苯二酚降解的最佳温度为40℃，降解率为65.1 %.高于40℃时随温度的升高酶的活性下降，降解率下降.在5.0 mL离心管中加入1600 μL不同 pH 的磷酸缓冲溶液、200 μL浓度为0.6m mol·L-1间苯二酚溶液，加入100 μL 0.0097 g/mL辣根过氧化物酶，最后加入100μL 2.0 mmol·L-1的 H2O2溶液，恒温40℃，反应30 min，考察磷酸缓冲溶液 pH 对降解率的影响，结果如图7.从图中可以看出，间苯二酚降解的最佳pH为5.0，降解率为71.4 %.pH不同，辣根过氧化物酶对间苯二酚降解的作用能力也不同.间苯二酚显酸性，在酸性的环境能有效地促进降解的效果.在5.0 mL离心管中加入1600 μL pH为5.0的磷酸缓冲溶液、200μL浓度为0.6mmol·L-1间苯二酚溶液、100 μL浓度为0.0097 g/mL辣根过氧化物酶溶液，最后加入100 μL不同浓度的H2O2溶液，恒温40℃，反应30 min，考察H2O2 浓度对降解率的影响，结果如图8所示.从图中可以看出，间苯二酚降解最适的H2O2 浓度为1.75 mmol·L-1，降解率为 88.7 %，过氧化氢浓度在0.5 mmol·L-1～1.75 mmol·L-1范围内时促进反应的进行，大于1.75 mmol·L-1时会使辣根过氧化物酶的活性降低，导致间苯二酚降解率下降.在5.0 mL离心管中加入1600μL pH为5.0的磷酸缓冲溶液、200 μL不同浓度的间苯二酚溶液，100μL浓度为0.0097 g/mL辣根过氧化物酶溶液，最后加入100μL 1.75 mmol·L-1H2O2溶液，40℃下反应30min，考察间苯二酚初始浓度对间苯二酚降解率的影响，结果如图9所示.结果表明：间苯二酚在初始浓度为1.2 mmol·L-1，30 min时的降解率达到 96.1%.在最佳的催化体系下，将间苯二酚降解的最终产物用三氯甲烷进行萃取，由于三氯甲烷的密度大于水的密度，根据相似相容原理，将下层液体取出后进行红外光谱测定.将间苯二酚红外光谱图10与降解后产物的红外谱图11通过特征吸收峰进行对比，在3300cm-1处，图10有明显的吸收峰，图11吸收峰接近消失；在2300 cm-1处图10无明显吸收峰，图11出现吸收峰，说明有新物质生成；其它各处，图10吸收峰均强于图11通过对比吸收峰的变化，说明间苯二酚被降解.在最佳催化体系下将间苯二酚的降解产物用三氯甲烷进行多次萃取，取下层液体于离心管中离心2 min，取1000 μL中间清液放置于干净的进样瓶中待测.将间苯二酚的高效液相色谱谱图12(a)与降解后产物的高效液相色谱谱图12(b)进行对比，在1.805 s处降解后产物峰面积较降解前间苯二酚明显降低.因此，间苯二酚已被较好的降解.间苯二酚在辣根过氧化物酶催化、H2O2氧化的反应体系中易降解.在 pH 5.0、温度40 ℃、反应时间30 min、初始浓度为1.2 mmol·L-1的间苯二酚溶液和1.75 mmol·L-1H2O2溶液条件下的降解率为96.1 %.。

TMB和HRP显色原理TMB和HRP是两种常用的生化试剂，它们可以被用于检测蛋白质、核酸等生物分子。

这两种试剂在实验室中被广泛应用，尤其是在免疫学和分子生物学领域。

本文将介绍TMB和HRP显色原理的基本知识，并探索它们在实验中的应用。

TMB显色原理TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯基二胺）是一种常用的底物，它可以被氧化酶催化剂转化成可见的蓝色产物。

这种催化剂通常是过氧化物酶（POD）或碱性磷酸酶（AP）。

TMB的显色原理可以用以下反应式表示：TMB + H2O2 + POD/AP → OX-TMB + H2OOX-TMB是一种氧化物，它的颜色比TMB更深。

因此，当TMB被氧化后，溶液会从无色或浅黄色变为蓝色或深紫色。

这种反应的灵敏度很高，因此可以用于检测很低浓度的蛋白质或其他生物分子。

HRP显色原理HRP（辣根过氧化物酶）是一种常用的酶标记试剂，它可以与抗体或其他分子结合，用于检测蛋白质、核酸等生物分子。

HRP的显色原理也是氧化还原反应。

HRP可以将底物（如TMB）氧化成可见的产物。

HRP的显色原理可以用以下反应式表示：HRP + H2O2 + Substrate → OX-Substrate + H2OOX-Substrate是一种氧化产物，它的颜色比底物更深。

因此，当底物被氧化后，溶液会从无色或浅黄色变为蓝色或深紫色。

这种反应的灵敏度很高，因此可以用于检测很低浓度的蛋白质或其他生物分子。

应用TMB和HRP显色原理在实验室中被广泛应用，尤其是在免疫学和分子生物学领域。

以下是一些应用示例：1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是一种常用的免疫学检测方法，它可以用于检测蛋白质、抗体、荷尔蒙等生物分子。

在ELISA中，TMB和HRP被用作底物和酶标记试剂，用于检测特定分子的存在和浓度。

这种技术被广泛应用于医学、生物技术和环境监测等领域。

2. 蛋白质印迹（Western blot）Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用于检测特定蛋白质的存在和表达量。