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培养细胞透射电镜超薄切片制备方法
细胞透射电镜超薄切片是一种常用的电镜技术，用于观察细胞的超微结构。
下面是一种常用的细胞透射电镜超薄切片制备方法：
1. 细胞固定：首先，将要观察的细胞固定在适当的细胞培养基或缓冲液中。
常用的细胞固定剂有戊二醛、乙醛等，用于维持细胞内各种结构和细胞间连接的完整性。
2. 细胞架构处理：固定后的细胞经过漂洗，然后进行细胞架构处理。
根据需要，可以使用内部或外部染色剂对细胞结构进行染色，以提高细胞的对比度。
3. 细胞包埋：在细胞固定和染色后，将细胞包埋在适当的树脂中。
常用的树脂包括Epon、Araldite等。
包埋过程中需要将细胞置于特殊的盒子或管中，并将树脂逐渐浸入细胞中，使细胞与树脂充分接触。
4. 刮丝切片：包埋完成后，将树脂固化并取出样品。
使用特殊的刮丝刀在树脂块上刮下薄片。
切片的厚度通常在70-90纳米之间。
5. 超薄切片收集：收集切下的超薄切片并将其放到透射电镜网格上。
通常使用特殊的刀片或刮片将切片直接转移到网格上，然后用特殊的工具将切片平整在网格上。
6. 染色：切片通常需要染色以增加对比度。
常用的电子显微镜
染色包括乌洛托品，还可以使用其他染色剂进行后续的特殊染色。
7. 观察：将染色后的超薄切片放入透射电镜中，进行观察和拍摄。
需要注意的是，在整个制备过程中，尽量减少样品的处理时间和曝光在空气中的时间，以保证细胞结构和细胞间连接的完整性。
此外，制备超薄切片需要一定的经验和技巧，因此在进行细胞透射电镜超薄切片制备之前最好接受相关的培训和指导。
透射电镜制样流程透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）制样是指通过一系列的化学和物理方法来制取透射电镜所需的样品。
透射电镜是一种高分辨率的显微镜，可以在纳米尺度下观察材料的原子结构和微观形态。
为了获取高质量的TEM图像，制样过程非常关键。
下面将详细介绍透射电镜制样的流程。
1.样品制备：样品可以是纳米颗粒、薄膜、纤维或生物样品等。
首先，准备适宜的基底材料，如碳膜覆盖的铜网格或碳膜覆盖的铜刀片。
样品通常需要制成非常薄的切片，通常在50到100纳米的厚度范围内。
制备方法包括机械切割、电解石蠟切片、离子切割或电离蚀刻等。
2.固定和固化：对于生物样品，需要先进行固定处理，以保持样品的形态和结构。
常用的固定剂包括戊二醛、酸性醛或重金属盐。
然后，固定的样品需要进一步处理以固化，如用过氧化物、树脂或聚合物进行浸渍，以增加样品的稳定性。
3.切割和悬浮：将固化的样品切割成适当的尺寸和形状。
使用超微切割机、离子切割仪或其他切割工具进行切割。
切割后，样品通常会悬浮在水或有机溶液中，以便进一步处理。
4.脱水和对比染色：脱水是将样品从水中逐渐转移到有机溶剂中的过程。
这种处理可以控制样品的体积，以减少对比染色和观察中的伪影。
脱水通常通过渗透固定液逐渐转移，然后通过有机溶剂（如醋酸乙酯、丙酮或丙二醇）进行交换。
5.嵌入：将样品嵌入到透明的聚合物或树脂中。
嵌入过程中，通常采用逐渐增加浓度的树脂混合物，以确保样品得到完全浸透。
然后，将样品与树脂进行硬化，通常在高温下进行。
6.超薄切片：将固化的样品切割成非常薄的切片。
使用超薄切片机和钻磨刀片进行切割。
切割后的切片应尽快收集并转移到透明的铜网格或铜刀片上。
7.超薄切片处理：超薄切片通常需要进行后继处理以增强对比度和解决其他问题。
这可能包括染色、胶层增强或薄膜剥离等方法。
8.观察：将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。
在观察前，样品需要在真空中或过氮气中去除气泡和其他杂质。
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
【求助】贴壁细胞电镜标本如何制作一、透射电镜细胞样品制备技术和观察方法(一)原理透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)是利用阴极发射的电子，通过阳极中央的微孔形成的电子束穿透样品获得样品的电子信号，经物镜、中间镜和投影镜等多级电子放大至数百至数千万倍，最后成像在荧光屏上便可即时观察，或是投射到照相底片感光片上作为永久记录。
由于标本必须置于高真空中进行电镜观察，所以电镜观察的生物标本必须特殊制备，不能含水，离体的生物标本要迅速加以固定，以防产生结构改变。
另外，电子的穿透力很弱，这就需要把样品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一个细胞切成100～200片)。
为了使柔软的生物组织能够制成这样薄的切片，并使切片耐受高真空和电子轰击，所以在切片前要进行包埋。
超薄切片技术是透射电镜观察成功的关键。
超薄切片制作样品过程大体分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染色等。
细胞超薄切片技术中如何把细胞完整无损地从培养瓶皿壁上包埋下来是最大的难题。
新的定型产品无菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解决了这个难题，把薄膜放在培养瓶皿中，让细胞直接长在塑料薄膜上，不仅细胞生长效果好，而且可与细胞一起包埋切片，省去了许多麻烦。
(二)超薄切片基本操作步骤1、取材(1)离心法适用于悬浮生长细胞或单层生长细胞，欲观察细胞内部超微结构，取对数生长期的细胞低速离心，令细胞沉于锥形离心管底部，吸除上清液，立即加戊二醛固定。
(2)原位法将无菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包装的成品)剪成适宜的小块置入培养瓶中，然后接种细胞悬液，待细胞附于薄膜上并生长后，取出进行固定。
2、固定将离心管中的细胞团块或取出的薄膜移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS漂洗3次，每次10分钟。
再用1% 四氧化锇在4℃固定15～30分钟，接着用PBS漂洗3次。
3、脱水用系列丙酮在室温下脱水。
50% 丙酮溶液1次，10分钟。
超薄切片法详细流程超薄切片法呀，那可真是个挺有趣的技术呢。
一、样品准备。
咱们得先有个合适的样品哦。
这样品可不能随随便便的。
要是研究生物组织呢，就得把组织取出来，还得小心别破坏了它原本的结构。
比如说研究植物的叶片细胞，那得轻轻地把叶片切下一小片，就像对待小宝贝一样。
要是研究动物组织，像肝脏之类的，也要很细致地取出来一块。
然后呢，这个样品得固定好。
固定剂就像保护神一样，把样品的状态定格住。
常用的固定剂有戊二醛呀，它能让细胞里的各种成分都老老实实待在原地，不会到处乱跑。
把样品放在固定剂里泡一泡，就像给它洗个舒服的澡，但这个澡可是有大作用的呢。
二、脱水处理。
固定好之后，就该脱水啦。
水对于超薄切片来说可不是个好东西，得把它去掉。
这就像给样品脱掉湿漉漉的外衣一样。
我们可以用乙醇或者丙酮来脱水。
从低浓度开始，一点点增加浓度。
就像爬楼梯一样，一步一步来。
先从30%的乙醇开始，让样品适应一下，然后50%、70%、90%，最后到100%。
这个过程得慢慢来，要是太着急，样品可能就不高兴啦，会出现变形之类的问题。
在每一个浓度的溶液里都要泡上一定的时间，可不能偷工减料哦。
三、浸透与包埋。
脱水之后呢，就是浸透啦。
要把样品浸到一种特殊的包埋剂里。
包埋剂就像给样品做一个温暖的小窝。
常用的包埋剂有环氧树脂之类的。
把样品放在包埋剂里，让包埋剂慢慢地渗透到样品的每一个角落。
这就像是包埋剂在跟样品说：“我来保护你啦。
”然后把样品和包埋剂一起放到模具里，等包埋剂凝固。
这个时候就像看着蛋糕在模具里慢慢成型一样，可期待啦。
四、切片。
等包埋好了，就可以切片啦。
这可是个技术活。
用超薄切片机来切，切片机的刀片要非常锋利，就像剑客的宝剑一样。
切的时候要调整好厚度，超薄切片嘛，那厚度可是很薄很薄的，一般是几十纳米到几百纳米。
就像把一个大大的蛋糕切成超级薄的片一样，这个过程得小心翼翼的。
要是切得不好，那前面的努力可就白费啦。
五、染色。
切好片之后，还得染色呢。
1 玻璃刀(glass knife) 與刀口水槽(trough) 製作玻璃刀需於切片當天製作，請於切片當天預留0.5-1 h。
方法步驟：1)首先取一乾淨的玻璃條，粗造面朝下(由玻璃條側面觀之)。
利用製刀機將玻璃條(glass strip) 切割成一英吋大小的正方形，再由對角線(約略偏斜) 切割一裂痕，自兩側及底部加壓使玻璃斷裂為二即成。
理想的刀口應呈現平整均勻，在解剖顯微鏡下無鋸齒狀缺刻(圖1.5.1)。
施加壓力於經鑽石刀劃過的玻璃條時，需慢慢的添加壓力。
當切口出現一半月型的陰影或白影(視觀察角度而定)時，即停止繼續增加壓力，使切口自行持續擴大至斷裂。
經此過程做出的玻璃刀有較佳的品質。
圖1.5.1 玻璃刀的製作(A) LKB700製刀機。
(B) 利用製刀機上的鑽石刀在玻璃條上略做切割。
(C) 旋轉製刀機右側旋鈕，自玻璃條兩側及下方均勻施加壓力，使其斷裂。
(D) 及(E) 每一正方形玻璃條可製作2把玻璃刀，每把刀各自有刀鋒及刀座。
第一把刀的刀鋒恰好緊鄰第二把刀的刀座。
(F) 製作完成的玻璃刀可以在顯微鏡下檢查刀鋒部分，理想的刀鋒應為平滑無缺刻。
整把刀最適合切片的部分為Z區，約佔1/3；S區不用於切片；而E區的使用需視刀鋒的品質而定。
(圖片A-C, E取自生物電子顯微鏡學, 圖片D, F取自Methods of Preparation for ElectronMicroscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences)2)將銀膠帶的一端貼於刀口下方並與底部平行後，另一端圍繞成一平滑的弧形貼於另一側，圈出一船型水槽。
過程中勿用手接觸用以形成水槽，帶有黏性的膠帶面，以免將手上的油脂黏於其上(圖1.5.2 A-B)。
3)以刀片沿玻璃將多餘的膠帶切除，然後於水槽下緣與玻璃刀接觸面以蠟或指甲油封合，避免水滲漏(圖1.5.2 C)，待乾燥後即可使用。
圖1.5.2 刀口水槽的製(圖片取自生物電子顯微鏡學)2、樣品塊修整(trimming)包埋完成後的樣品塊須先經過修整，將樣品塊尖端修整成適當的大小及形狀,並將要觀察的部份露出。
透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
透射电镜组织处理
透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是一种高分辨率的显微镜，可以用于观察和分析材料的微观结构和成分。
在使用透射电镜进行样品观察之前，需要对样品进行适当的处理。
以下是透射电镜组织处理的一般步骤：
1. 固定样品：将要观察的组织样品进行固定处理。
常用的固定剂有醛固定剂，如戊二醛或葡萄糖醛固定剂。
固定的目的是停止细胞功能，保存细胞和组织的原貌。
2. 切片：将固定的样品块切割成非常薄的切片。
通常使用超薄切片机或者离心机来获得薄片。
厚度通常为50到100纳米左右，以保证透射电镜的有效穿透。
3. 染色：对切片进行染色以增强对细胞结构的观察。
常用的染色剂有重铀酸、铅酸等。
染色的目的是使细胞结构在电子束中的对比度增强。
4. 上膜：在切片的背面电镜网格上涂上薄膜，以便将切片固定在透射电镜的样品架上。
5. 透射电镜观察：将处理好的样品放置于透射电镜中观察。
通过调整电子束的聚焦和缩放，可以观察到组织和细胞的微观结构。
透射电镜组织处理的目的是保持样品的原始结构和形态，并使其适应电子束的穿透性观察。
注意，在进行透射电镜观察之前，样品必须成为极度干燥状态，因为电子束对水分很敏感。
通过透射电镜观察和分析组织样品，可以获得高分辨率和高对比度的图像，从而进一步了解组织和细胞的微观结构和功能组织。
这对于生物学研究、药物开发和疾病研究具有重要意义。
详细讨论超薄切片法流程及注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
介绍透射电子显微镜的基本操作步骤透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种重要的科学仪器，它能够通过透射电子来观察物质的微观结构。
下面将介绍透射电子显微镜的基本操作步骤。
首先，在进行透射电子显微镜观察前，需要将要观察的样品制备成超薄切片。
制备过程涉及样品的固定、切割和薄化等步骤。
然后将切片安置在透射电子显微镜的样品台上。
接下来，调节透射电子显微镜的光学系统。
首先是对光源进行调节，确保其亮度适宜，以获得足够的透射电子束。
然后，调节透射电子束的聚焦，使其成为尖锐的平面波束。
这样能够提高图像的分辨率。
此外，还要选择适当的对比度和缺陷减弱方法，以获得清晰明亮的图像。
在样品观察过程中，需要控制透射电子显微镜的透射电子束。
通常可以通过调节"电子透镜"来控制透射电子束的聚焦、去散和照射位置等参数。
在对样品进行观察时，可以通过调节透射电子束的投射角度来得到不同的观察效果。
同时，透射电子显微镜还具备能量色散谱仪等附加设备，能够获取样品的化学成分信息。
在观察过程中，要注意对透射电子显微镜的环境进行有效控制。
因为透射电子显微镜的操作需要在真空环境下进行，以避免电子与气体分子的碰撞，从而影响透射电子束的传输。
此外，还需要对样品进行冷却或加热处理，以研究材料在不同温度下的性质变化。
最后，在观察结束后，需要对透射电子显微镜进行适当的维护和清洁工作。
对于显微镜的光学系统，需要保持清洁，以确保透射电子束的传输和成像质量。
对于样品台和样品抓取工具等部件，也需要保持干净和平稳。
总之，透射电子显微镜作为一种重要的科研工具，具有较高的分辨率和观察深度，可以用于观察材料的晶体结构、纳米颗粒、生物组织等。
了解透射电子显微镜的基本操作步骤，对于科学研究人员正确运用该仪器进行实验和观察具有重要意义。
通过合理操作透射电子显微镜，可以获得更加准确的样品信息，推动材料科学、纳米技术等领域的发展。
透射电镜中样品制备的常用方法透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是一种重要的高分辨率显微镜，常用于研究物质的微观结构和性质。
在使用透射电镜观察样品之前，需要对样品进行制备，以确保样品的质量和形貌。
本文将介绍透射电镜中常用的样品制备方法，包括样品的选择、切片制备、薄膜制备等。
1. 样品的选择在进行透射电镜观察之前，样品的选择非常重要。
通常，样品需要满足以下要求：•样品具有一定的透明度，能够让电子束穿透。
•样品存在较为稳定的晶体结构，以便进行晶体学分析。
•样品的尺寸合适，不过大以免超出透射电镜的观察范围。
•样品的形状和厚度需适合观察操作。
常见的样品包括金属、有机物、无机晶体、陶瓷和生物样品等。
2. 切片制备透射电镜观察样品的常用方法之一是制备薄片，即切片制备。
切片制备的目的是将样品制备成适合透射电镜观察的薄片，通常要求薄片的厚度在几百纳米到几微米之间。
切片制备的步骤如下：步骤1：固定样品对于生物样品，首先需要将样品固定。
常用的固定方法包括冷冻固定、化学固定和凝胶固定等。
这些方法可以保持样品原有的结构和形态。
步骤2：取样从固定的样品中取出小块样品，通常使用显微针或者显微刀进行操作。
步骤3：去脂处理（可选）对于脂肪含量较高的样品，需要进行去脂处理。
常见的方法包括冷冻去脂、溶液去脂等。
步骤4：嵌培将取样得到的样品嵌入切片中，嵌培有多种方法。
常用的方法包括：冷冻嵌培、树脂嵌培等。
步骤5：切割将嵌培好的样品进行切割。
切割时需要使用马来酸酐刀或者超薄刀，在适当的位置进行切割，得到适合的样品。
步骤6：收集和保护薄片将切割好的薄片收集并放置在适当的载玻片或网格中，然后进行保护。
保护可以使用丙酮或乙醇进行漂洗、涂层等方法。
3. 薄膜制备除了切片制备外，透射电镜观察样品的另一种常用方法是薄膜制备。
相对于切片制备，薄膜制备更加灵活，可以制备更薄的样品。
薄膜制备的步骤如下：步骤1：样品制备制备需要制备的样品，并确保样品的表面较为光滑。
透射电镜的制样方法一、超薄切片法。
1.1 取材。
这可是制样的头一遭，就像盖房子打地基一样重要。
取材的时候得特别小心，要选取咱们感兴趣的部位。
这部位得有代表性啊，不能瞎取。
比如说研究细胞结构的，就得找到细胞长得好、特征明显的那块组织。
而且动作要快，就像抢红包似的，手慢无。
为啥呢？因为组织一旦离开生物体，就开始发生变化了。
1.2 固定。
固定这一步可不能含糊。
就像给组织“定个型”，让它保持生前的状态。
通常会用到化学固定剂，像戊二醛啥的。
把组织泡在里面，就像把东西放在保险柜里一样，稳稳当当的。
这一步要是没做好，后面的观察就全乱套了，那可就是“一着不慎，满盘皆输”。
1.3 脱水。
脱水就像给组织“脱衣服”，把水分一点一点去掉。
用的是一系列不同浓度的乙醇或者丙酮。
这个过程得循序渐进，不能操之过急，不然组织就会被破坏。
这就好比爬山，得一步一个脚印，急不得。
1.4 浸透与包埋。
浸透呢，就是让包埋剂慢慢渗到组织里。
包埋就像给组织做个“小房子”，把它保护起来。
常用的包埋剂有环氧树脂之类的。
这一步就像给宝贝裹上一层保护膜，得仔仔细细的。
1.5 超薄切片。
这可是个精细活，切片要薄得像蝉翼一样。
用超薄切片机来切，切的时候得全神贯注，稍有不慎就会前功尽弃。
切出来的片子就像一片片小雪花，又薄又脆弱。
二、负染法。
2.1 样品准备。
先把要观察的样品处理好，比如说提纯之类的。
这就像把菜洗干净，准备下锅一样。
得把杂质去掉，让咱们想看的东西“干干净净”地呈现出来。
2.2 负染。
用重金属盐溶液来进行负染。
这就像给样品穿上一件深色的“衣服”，让它在电镜下更明显。
染的时候要控制好量，多了少了都不行，就像炒菜放盐，得恰到好处。
三、冷冻制样法。
3.1 冷冻固定。
直接把样品快速冷冻，让它瞬间定格。
这就像给样品来了个“急冻魔法”。
这样能最大程度地保持样品的原始状态，避免化学固定带来的一些变化。
3.2 冷冻超薄切片。
在冷冻的状态下进行超薄切片。
这可不容易，就像在冰上雕刻一样，需要特殊的设备和技术。
1 玻璃刀(glass knife) 與刀口水槽(trough) 製作玻璃刀需於切片當天製作，請於切片當天預留0.5-1 h。
方法步驟：1)首先取一乾淨的玻璃條，粗造面朝下(由玻璃條側面觀之)。
利用製刀機將玻璃條(glass strip) 切割成一英吋大小的正方形，再由對角線(約略偏斜) 切割一裂痕，自兩側及底部加壓使玻璃斷裂為二即成。
理想的刀口應呈現平整均勻，在解剖顯微鏡下無鋸齒狀缺刻(圖1.5.1)。
施加壓力於經鑽石刀劃過的玻璃條時，需慢慢的添加壓力。
當切口出現一半月型的陰影或白影(視觀察角度而定)時，即停止繼續增加壓力，使切口自行持續擴大至斷裂。
經此過程做出的玻璃刀有較佳的品質。
圖1.5.1 玻璃刀的製作(A) LKB700製刀機。
(B) 利用製刀機上的鑽石刀在玻璃條上略做切割。
(C) 旋轉製刀機右側旋鈕，自玻璃條兩側及下方均勻施加壓力，使其斷裂。
(D) 及(E) 每一正方形玻璃條可製作2把玻璃刀，每把刀各自有刀鋒及刀座。
第一把刀的刀鋒恰好緊鄰第二把刀的刀座。
(F) 製作完成的玻璃刀可以在顯微鏡下檢查刀鋒部分，理想的刀鋒應為平滑無缺刻。
整把刀最適合切片的部分為Z區，約佔1/3；S區不用於切片；而E區的使用需視刀鋒的品質而定。
(圖片A-C, E取自生物電子顯微鏡學, 圖片D, F取自Methods of Preparation for ElectronMicroscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences)2)將銀膠帶的一端貼於刀口下方並與底部平行後，另一端圍繞成一平滑的弧形貼於另一側，圈出一船型水槽。
過程中勿用手接觸用以形成水槽，帶有黏性的膠帶面，以免將手上的油脂黏於其上(圖1.5.2 A-B)。
3)以刀片沿玻璃將多餘的膠帶切除，然後於水槽下緣與玻璃刀接觸面以蠟或指甲油封合，避免水滲漏(圖1.5.2 C)，待乾燥後即可使用。
圖1.5.2 刀口水槽的製(圖片取自生物電子顯微鏡學)2、樣品塊修整(trimming)包埋完成後的樣品塊須先經過修整，將樣品塊尖端修整成適當的大小及形狀,並將要觀察的部份露出。
習慣上將樣品塊修整成平頂的金字塔型(從側面觀察)，頂部與底部略成梯形(從上方觀察)，大小應小於0.5 mm，金字塔高度不宜超過0.2 mm。
將樣品塊修整成平頂的金字塔型，是為了讓樣品在切片過程中得到最佳的支持力。
高度過大，切片時容易發生震動，在切片上留下深淺交替的平行條紋，或導致樣品塊前端斷裂。
較小的樣品塊切面較容易進行超薄切片，但過小的切片在電子顯微鏡下可觀察到的東西較少。
方法步驟：1) 將樣品塊放置在解剖顯微鏡下，以刀片(two-edged razor blade) 水平的削去尖端直到組織露出(圖1.4.1, 步驟1)。
2) 修出梯形的上下底。
先將刀片以垂直方向切下，再將刀鋒以水平朝向自己的方式緩慢前進，至前一刀垂直切下處即可除去不要的部份(圖1.4.1, 步驟2-3)。
注意力量的控制。
3) 修出梯形的兩邊，方式同上(圖1.4.1, 步驟4-5)。
4) 待初步形狀出來後，換一新刀片再做更細微的修整，盡量使上下底平行，切面光滑無缺刻。
此步驟會影響連續切片(ribbon) 的形成。
圖 1.4.1 樣品塊修整(圖片取自Methods of Preparation for ElectronMicroscopy)3、半薄切片（1-2um)、光学显微镜定位4、刀槽及液面的调节超薄切片只有漂浮在水面上或其他合适的液面上才便于收集、伸展和捞取，为此在刀口背部装上一个小的水容器，通常称为“刀槽”。
通常用定制的硬塑料刀槽架或用一小段医用橡皮胶缠绕过刀背，紧紧地粘在玻璃上，橡皮胶的后下部分用融化的牙科用红腊密封，以防漏水。
注意橡皮胶的顶端不应高出刀刃。
切片前在刀槽内加入双蒸水，使切后的切片漂浮于液面上。
液面的调节一般先加稍过量的液体使之凸起，以保证浸湿刀刃。
然后在双筒解剖镜下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液体，调整照明系统，当液面变成凹面、可见一反射光线的弧面，即为正确的液面。
从这一光亮的反射光可看到切出的片子。
在切片过程中由于液体蒸发，需加液以保证正确的液面。
5、超薄切片切片时将夹着修好组织块的样品夹安装在切片机的样品臂上，刀台上装好玻璃刀，其高度要与刀台上的标准规等高，后斜角一般在3～5°，在显微镜下使样品块面的上下两条平行边与刀刃平行，如是梯形的应长边在下面。
调整好刀刃和组织块的距离，再在刀槽内注入适量的双蒸馏水。
将切速放在2～5mm／秒，调节控制切片厚度的电流表，即可切片。
当切片停止时，立即打开电吹风，冷却样品臂。
捞片后关掉电吹风又可重新切片，或更换新刀。
切片厚度的判断。
一般是利用反射光干涉色来判断切片的厚度，即从切片表面反射的光和从切片下面的水面的反射光发生干涉现象（见下表）。
当用白光时，从双筒显微镜下观察两种光线间的差别。
目前公认的树脂包埋切片厚度与干涉色的近似值干涉色切片厚度暗灰色40nm以下灰色40～50nm银白色50～70nm金黄色70～90nm紫色90nm以上紫色切片太厚，电子束不易穿过，故不适用于电镜观察用。
金黄色切片其分辨率也比较低。
目前一般认为银白色的切片是较理想的厚度，其分辨率可达2.5nm左右。
也有人喜欢采用金黄色切片，尤其在细胞化学、放射自显影中较适宜。
切片的展平和捞取。
在切削过程中，由于切片很薄，经挤压使切片发皱，甚至引起标本结构变形。
为此，常用沾有氯仿或二甲苯的滤纸小片移近刀槽液面，试剂挥发性蒸汽可使切片软化伸展。
蒸发时间2～3秒钟即可，不能把试剂滴入水槽。
捞片时，可用眼睫毛做成的小针把切片轻轻地拨离刀刃，并按需要把切片带分成几段。
再用弯头的小镊子夹住铜网的边缘，有支持膜的一面向下，与切片轻轻接触，使切片贴附在铜网的膜上，轻轻提起并把膜面朝上，放于培养皿中无毛的滤纸上，待干经染色后即可电镜观察。
方法步驟：1) 將標本臂(specimen arm) 及刀座(knife holder) 退回起點。
標本臂的控制懸鈕位於切片機右後側面，退標本臂至底時先以順時鐘方向旋轉至底，再以反方向倒轉半圈。
2) 選用適當的固定座將樣品塊固定於標本臂上，加以旋緊。
略為調整樣品塊的角度(圖1.6.2 中3,4)，使樣品塊整個切面與即將放置的刀口等距平行。
緊量使其在固定過程中勿大力震動標本臂，以免影響儀器準確度。
3) 將玻璃刀安置在刀座上，調整適當的高度與位置，並加以旋緊固定不良的樣品塊與玻璃刀可能在切片上造成chatter的現象。
4) 調整玻璃刀的傾斜角度(clearance angle) 為4° (圖1.6.3中7)。
此角度視包埋劑與刀子種類的不同而改變，但一般都在2~5°間。
5) 鬆開刀座，以手動方式逐漸前移刀座，至刀口靠進樣品塊時鎖緊刀座 (圖1.6.3中1左扳時可用手扶住整個刀座，慢慢向前推進。
右扳時可固定鎖緊刀座)。
167899圖1.6.3 Richert-jung Ultracut E 超薄切片機刀座圖上各部位說明：(1) 刀座固定-右扳可固定刀座。
(6) 鎖緊玻璃刀於刀座上。
(7) 調整玻璃刀的傾斜角度(clearance angle)。
(8) 在1右扳情況下，順時鐘方向旋轉可前進刀座；逆時鐘方向旋轉可後退刀座 (圖片取自生物電子顯微鏡學)。
(9) 左右調整刀座角度。
6) 利用注射針筒在水槽中加蒸餾水，加至水面在顯微鏡下剛好呈一均勻亮面 (圖1.6.4 C)。
不正確的水面高度可由水槽中出現黑影得知。
水面過低時，多在刀口附近水面形成黑色弧線，此時剛切出的切片可能黏附在刀口上，並擠壓皺縮 (圖1.6.4 A)。
水面過高時，水面變得灰暗，可能導致樣品塊沾溼，剛切出的切片被拖離水槽 (圖1.6.4 B)。
圖1.6.4 刀口水槽的水面高度與切片的關係(圖片取自Principles and Techniques of Electron Microscopy, Biological Applications Volume 1)7) 將玻璃刀朝樣品塊逼近，至快接近時停止，需小心勿使兩者碰撞 (圖1.6.3中8)。
8) 選擇修平樣品塊切面與切厚切片所用的刀鋒 (圖1.6.1)。
9) 在顯微鏡下調整玻璃刀刀鋒與樣品塊的距離與角度 (圖1.6.5)。
此部分難度較高，利用反射的亮帶判斷距離需經驗和適當光源的配合。
需小心勿使刀鋒超過樣品塊平面，否則整個梯形都可能斷裂。
使樣品塊梯形的上下底與刀口平行：梯形切面上下底與刀口不平行時，旋轉樣品塊使之平行 (圖1.6.2中3,4)。
使樣品塊整個梯形平面與刀口等距：(1) 水平面等距－樣品塊切面上之光帶兩端寬度不一時，代表刀口與樣品面互相歪斜，旋轉刀座，使光帶寬度一致 (圖1.6.3中9)。
(2) 垂直面等距－樣品塊切面上之光帶寬度會隨標本臂上下而改變，代表梯形之上下底與刀口距離不同，旋轉樣品塊角度，使光帶寬度一致 (圖1.6.2中3,4)。
圖1.6.5 刀口與組織切面的調整A樣品塊整個梯形平面與刀口保持垂直面等距。
B樣品塊整個梯形平面與刀口保持水平面等距。
C樣品塊梯形的上下底與刀口平行。
(圖片取自Methods of Preparation for Electron Microscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences)10) 調整切片速度為3 mm/sec及semisection切片厚度1 μm，在進行超薄切片(ultrasection)前需先進行厚片(semisection) 的觀察及樣品塊切面的微修整。
11) 調整標本臂開始切片的起始位置(樣品塊略低於刀鋒)。
極重要，若無法確定，請一定要請教有經驗的老師。
12) 開始切厚片，待切出一平面時，可以單面削平的竹籤撈起觀察。
方式如下：在玻片上滴一滴水，以撈起切片的竹籤尖端接觸玻片上的水後，將玻片放置在55~60℃加熱板上待其乾燥。
滴一滴toluidine blue在切片上，同樣在55~60℃加熱板上加熱約30 sec (此時染劑邊緣會出現金色光澤)，再以洗瓶沖洗掉過多的染劑後放回加熱板，當玻片乾燥後即可放在顯微鏡下觀察。
13) 在厚片上已切到所欲觀察的目標，且已切出完整的切面時，即可開始切超薄切片。
調整切片速度為3 mm/sec及ultrasection切片厚度為70~90 nm。
做免疫電顯實驗的切片須較厚，可定為99 nm。
14) 觀察刀鋒是否有毀損。
若有，須將刀座稍微退離樣品塊(圖1.6.3中8) 後換一刀鋒，並重新對刀，方法同步驟7-9。
15) 切出來的切片在顯微鏡下應呈銀白色(60~90 nm) 至金黃色(90~150 nm)，直線前進的連續切片帶(ribbon)。
