绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆
生物制药 2010级洪琰 3100703001
生物制药 2010级林轩圣 3100703005
生物制药 2010级陈艳 3100703006
生物制药 2010级李文敏 3100703007
生物制药 2010级王卉 3100703047
摘要：
本实验主要研究绿色荧光蛋白（GFP）的在体外细菌的基因克隆，通过PCR扩增目的基因，限制酶切割目的基因与载体，构建连接重组体，转入受体细胞筛选重组体、等步骤诱导绿色荧光蛋白在克隆菌中的克隆。
关键词绿色荧光蛋白 GFP 基因表克隆
1 前言
绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
2 实验目的
研究绿色荧光蛋白基因在DH5→克隆菌中的表达
3 实验原理
3.1高纯质粒小量制备
3.2获取外源基因（PCR）
3.3构建从组DNA（T连接）
3.4从组DNA的转化
3.5从组DNA的筛选（蓝白斑）
3.6从组DNA的鉴定（酶切）
4 实验设备
超净工作台；
恒温摇床；
高压灭菌锅；
恒温培养箱；
台式高速离心机；
大容量冷冻离心机；
PCR仪；
紫外分光光度计；
水平电泳槽；
垂直电泳槽；
电泳仪；
微波炉；
凝胶成像系统；
制冰机；
超低温冰箱；
微量加样枪（10μl，100μl，1000μl）
5 实验材料
5.1材料
质粒：pEGFP-N1；
T载体：pUCm-T；
菌种：DH5 (克隆菌)；
PCR引物：
F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA
R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC
Tm=56p
5.2试剂：
UCm-T Vector （碧云天）；
快速DNA连接试剂盒（碧云天）；
两种限制性内切酶：EcoR I, Hind III（Fermentas）；
质粒提取试剂盒（百泰克或BioEASY）；
抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)；
X-gal、IPTG等
6 实验操作步骤
6.1高纯质粒的小量制备
(材料中已经制备完毕)
6.2获取外源基因
（1）PCR反应体系设置
取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：
H2O 6μl
质粒DNA（pEGFP-N1）2μl
引物GFP1 (10μM) 1μl
引物GFP2 (10μM) 1μl
Premix Taq 10μl
总体积20μl
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上.
PCR仪操作
步骤操作
PCR参数设置①94℃预变性5分钟后开始以下循
环
②94℃30 秒
56℃30 秒
72℃ 1 分钟
③72℃7 分钟
④ 4 ℃保温
30个循环，共计约1小时50分钟
预热先不将PCR官插入模板，启动反应程
序
启动反应程序待温度升至94℃，按Pause键，暂停反
应程序，迅速将PCR管插入模板，盖
上盖子，再启动反应程序
（2）琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物
步骤操作
1、凝胶准备①称1g琼脂糖置三角瓶中，加0.5×
TBE 100ml ；
②微波炉加热大约2分钟，熔
化琼脂糖；
2、胶床准备①将梳子垂直插入到胶床的小凹槽
内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；
②将胶床放在调整好的水平台
上；
3、铺胶将冷却至60℃的凝胶加入 5
l10mg/ml溴化乙锭溶液(EB,剧毒)倒入
准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；
4、室温下静置凝胶固化室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床
置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负
极；
5、加入缓冲液向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲
液，越过凝胶表面即可；
6、拔出梳子轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；
7、样品准备样品准备：向核酸样品中加入约为样品
体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻
混匀；
8、上样用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶
的样品孔中，加样量为6 µl ；
9、开始电泳盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；
10、电泳条件电泳条件：电压80~120v，时间20～30
分钟；
11、电泳结束电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
12、结果分析电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电
泳条带
13、观察结果，拍照取出凝胶，置于凝胶成像仪中拍照，观
察结果。
6.3构建重组DNA（T连接）
步骤操作
连接体系设置将下列溶液依次加入一个无菌的Eppendorf管，充
分混匀
T载体0.5μl
待插入片段 1.5μl
快速连接缓冲液(2X) 5.0µl
双蒸水或MilliQ水 2.5µl
Rapid T4 DNA ligase 0.5µl
总体积10µl
连接反应16℃反应45min
产物保存冷却后直接取5-10μl用于转化
6.4重组DNA的转化
（1）感受态细菌的制备（CaCl2法）
步骤操作
1、细菌小量培养挑取一DH5 单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养
2、扩大培养取其中500 l菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃
振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间
3、实际细菌取50ml菌液置于离心管内，4 ℃4500g离心5分钟
4、CaCl2处理加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴
30分钟
4℃4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷
CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞
悬液。
5、感受态细胞的收集和分装感受态细胞分装成100μl的小份，暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。取其中一份进行转化
（2）DNA转化
步骤操作
