分子克隆实验指南

分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。

胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。

在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。

③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。

④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。

制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。

3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。

①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。

分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。

2、学习和掌握质粒、T载体的特点。

3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。

4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。

5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。

6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。

7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。

8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。

二、相关知识（一）T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。

在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。

（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。

所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。

为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。

现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。

相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。

（三）大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。

分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。

其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。

以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。

PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。

PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。

PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。

-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。

-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。

-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。

扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。

多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。

限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。

内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。

通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。

连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。

连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。

连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。

转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。

转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。

转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。

筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。

通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。

技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。

分子克隆技术实验操作手册《分子克隆技术》实验操作手册李香花吴昌银邢永忠华中农业大学生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。

分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。

实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子杂交和表达检测三部分分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。

本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。

分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting 等。

Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。

DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素或DIG)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经显影或显色显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。

本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。

系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。

质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。

本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。

实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

分子克隆实验步骤总结分子克隆实验步骤1.对目的片段进行pcr扩增：Pcr体系：（50μL）DNA Template：10-100ng10×PCR buffer：5μL50mM dNTPs：0.5μLPrimers：1μM eachWater：add to 49μLTaq Polymerase：1μL2.琼脂糖电泳，看有无目的条带3.对目的条带进行切胶回收4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；Taq酶，则无需加尾）加尾体系：（10μL）胶回收DNA: 8μLBuffer: 1μLdNTPmix: 0.5μLTaq Polymerase：0.5μL5.T载体连接：室温，30min体系：（6μL）加尾后产物：4μLT载体：1μLSalt solution 1μL6.30-40μL感受态加入重组后的质粒。

7.放冰上30min。

8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）9. 加SOC（200-250μL）10.37℃，300rpm，1h11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜13.试剂盒提质粒14.酶切：37℃，2h体系：（20μL）Buffer2: 2μL酶：0.5μL模板：1μLBSA：0.2μLH2O：16.31μL15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。

菌落PCR体系（20ul）10*taq buf 2uldNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM）1.6ul Primer F （10uM）0.5ul Primer R（10uM）0.5ul DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul ddH2O 12.5ul程序：94度10min94度30sec56度30sec72度2:10 30cycle 72度10min4度forever。

分子克隆技术操作手册（实用版）目录一、引言二、分子克隆技术的概念与原理1.定义与概念2.分子克隆技术的基本原理三、分子克隆技术的操作步骤1.载体的选择与构建2.目的基因的获取与扩增3.基因片段的连接与重组4.转化与筛选5.克隆子的鉴定与分析四、分子克隆技术的应用1.在基因工程中的应用2.在蛋白质工程中的应用3.在生物制药中的应用五、分子克隆技术的发展趋势六、结论正文一、引言分子克隆技术是现代生物技术领域中的一项重要技术，它在基因工程、蛋白质工程、生物制药等领域具有广泛的应用。

本文将详细介绍分子克隆技术的概念与原理、操作步骤以及应用和发展趋势。

二、分子克隆技术的概念与原理1.定义与概念分子克隆技术是指在体外将不同来源的基因片段通过基因工程技术进行拼接组装，形成一个新的基因表达载体，并将其导入受体细胞，使目的基因在受体细胞中表达的技术。

2.分子克隆技术的基本原理分子克隆技术的基本原理主要包括以下几个方面：（1）载体的选择与构建：选择适合目的基因的载体，并将其构建为重组表达载体；（2）目的基因的获取与扩增：从原始基因中获取目的基因，并通过PCR 等方法进行扩增；（3）基因片段的连接与重组：将目的基因与载体进行连接，形成重组基因表达载体；（4）转化与筛选：将重组基因表达载体导入受体细胞，并通过筛选得到表达目的基因的克隆子；（5）克隆子的鉴定与分析：对克隆子进行鉴定与分析，以确认其是否表达目的基因。

三、分子克隆技术的操作步骤1.载体的选择与构建选择适合目的基因的载体，如质粒、噬菌体等，并将其构建为重组表达载体，主要包括载体的切割、目的基因的插入、连接以及重组表达载体的转化等步骤。

2.目的基因的获取与扩增从原始基因中获取目的基因，可以通过基因合成、PCR 等方法进行扩增，获得足够量的目的基因。

3.基因片段的连接与重组将目的基因与载体进行连接，形成重组基因表达载体。

这一步通常采用 DNA 连接酶进行催化连接，同时需要使用适当的缓冲液和试剂。

分子克隆步骤：一、贴壁细胞总RNA提取：1、吸掉培养液，用PBS洗一遍?2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)3、移至1.5mlEP管，静置5分钟4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清，约600ul6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟？7、4度12000r/min，离心15分钟，弃上清8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物9、4度7500r/min，离心5分钟10、弃上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值＊鼠尾基因组DNA粗提取：1、100ul lysis buffer for each tail,and 2ul 10mg/ml PK,55℃,overnight.2、Then,100℃ for 10min to denature the PK, use 0.5~1ul lysate as template to do PCR.Lysis buffer:(store at 4℃)KCl 0.5MTris 0.1MNP-40 1%Tween-20 1%二、RT-PCR：1、预变性体系12ul：Total RNA 2ulOligo（dT18）primer 1ulDH water 9ul65℃ 5min 速置冰上2、RT体系：20ul：预变性体系12ul5×buffer 4ulRNAase inhibiter 1ul10m dNTP 2ulMMLV 1ul42℃ 60min70℃ 5min12℃ forever3、PCR体系20ul：10×buffer 2ul10m dNTP 0.5ulPrimer(F+R) 1ul （0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA（50ul）1ulPfu 0.2uldd water 15.3ul95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever三、跑胶鉴定PCR产物：四、醇沉PCR产物：1、将PCR产物转移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍体积预冷NaAC，3倍体积70%预冷乙醇，混匀3、—80℃静置30min4、4度14000r/min，10min离心弃上清，加1ml70%预冷乙醇洗涤沉淀5、4度14000r/min，10min离心弃上清，自然晾干6、加入25-20ul dd water 吹匀静置10-20min待溶解五、原始质粒/PCR醇沉产物双酶切体系50ul：Enzyme1 1ulEnzyme2 1ul10×Buffer 5ul （在体系中被稀释成1×）10×BSA 5ul （看需要）Template 1ugADD dd water to 50ul酶切过夜？六、单独鉴定质粒酶切产物：1、采用20ul体系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）酶切2h2、跑胶鉴定七、电泳，切胶回收与纯化：使用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）PCR酶切产物纯化：1.将PCR产物于需要的电压和电流下跑电泳2. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。

分子克隆技术操作手册（实用版）目录1.分子克隆技术的概念与原理2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用领域4.分子克隆技术的优势与局限性正文一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是一种在生物体外将特定 DNA 片段复制并插入到载体DNA 中的技术。

这种技术可以使得新的 DNA 分子与载体 DNA 相结合，形成一个具有自我复制能力的 DNA 分子。

在实际应用中，分子克隆技术主要通过将目的基因与载体 DNA 连接，从而实现对目的基因的扩增和表达。

二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术的操作步骤主要包括以下几个方面：1.提取目的基因：从待研究的生物体中提取需要克隆的 DNA 片段，通常使用 PCR 技术进行扩增。

2.构建载体：选择合适的载体 DNA，将其与目的基因连接，构建成一个完整的克隆载体。

3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体转化到受体细胞中，让受体细胞表达出目的基因。

4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，从转化后的细胞中筛选出含有目的基因的克隆子。

5.鉴定克隆子：对筛选出的克隆子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。

三、分子克隆技术的应用领域分子克隆技术在生物学研究中具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以将目的基因与载体 DNA 连接，实现对目的基因的扩增和表达。

2.蛋白质工程：通过分子克隆技术，可以研究蛋白质的结构和功能，为药物研发提供重要依据。

3.基因组学：通过分子克隆技术，可以对基因组 DNA 进行拼接和分析，揭示生物体的基因组结构。

4.转基因技术：通过分子克隆技术，可以将目的基因插入到载体 DNA 中，实现对转基因生物的研究和开发。

四、分子克隆技术的优势与局限性分子克隆技术在生物学研究中具有明显的优势，如操作简单、扩增效率高、可控性强等。

然而，分子克隆技术也存在一定的局限性，如克隆效率受载体 DNA 大小限制、克隆过程中可能出现突变等。

分子克隆技术操作手册（原创版）目录一、分子克隆技术的概念与意义二、分子克隆技术的基本原理三、分子克隆技术的操作步骤四、分子克隆技术在实践中的应用五、分子克隆技术的发展前景与挑战正文一、分子克隆技术的概念与意义分子克隆技术，又称为分子复制技术，是指在体外将特定 DNA 片段与载体 DNA 结合，然后通过转化等方式将重组 DNA 引入受体细胞，从而使得目的基因在受体细胞中得以表达和扩增的一种技术。

分子克隆技术的出现，为生物学、医学和基因工程等领域的研究提供了强大的支持，使得科学家们可以更加方便地研究和操控基因。

二、分子克隆技术的基本原理分子克隆技术的基本原理主要包括以下几个步骤：1.获取目的基因：从供体细胞中提取出需要研究的目的基因。

2.构建载体：将目的基因与载体 DNA 结合，构建成一个完整的克隆载体。

3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体引入受体细胞中，使得目的基因在受体细胞中得以表达和扩增。

4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，从众多受体细胞中筛选出真正含有目的基因的克隆子。

5.提取和纯化目的基因：从筛选出的克隆子中提取和纯化目的基因，以供后续研究使用。

三、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术的操作步骤主要包括以下几个方面：1.提取目的基因：通过 PCR、限制性内切酶等方法从供体细胞中提取出目的基因。

2.构建载体：将目的基因与载体 DNA 结合，构建成一个完整的克隆载体。

这一步通常需要使用限制性内切酶和 DNA 连接酶等工具。

3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体引入受体细胞中。

转化方法有很多种，如化学法、电穿孔法、热激法等。

4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，如抗生素筛选、荧光筛选等，从众多受体细胞中筛选出真正含有目的基因的克隆子。

5.提取和纯化目的基因：从筛选出的克隆子中提取和纯化目的基因，通常需要使用限制性内切酶和 DNA 连接酶等工具。

四、分子克隆技术在实践中的应用分子克隆技术在实践中的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以将目的基因与载体 DNA 结合，从而实现对基因的改造和调控。