发酵工程复习资料U版修订版

发酵工程完整版发酵的定义 ：无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力[H]未经呼吸链传递而直接交给某一内源性中间代谢产物，以实现底物水平磷酸化的一类低效产能生物氧化反应称为发酵。

发酵流程：保藏菌种、斜面活化、扩大培养、种子罐、主发酵、产物分离纯化、成品发酵过程的基本参数:温度、PH 值、罐压、溶解氧、氧化还原电位、空气流量、CO2含量、泡沫等 单菌发酵：现代发酵工业中最常见，传统发酵工业中很难实现。

混合菌发酵：自然发酵与人工接种发酵相结合液态发酵：发酵基质呈流动状态，如啤酒发酵、柠檬酸发酵等。

半固态发酵：发酵基质呈半流动状态，如黄酒发酵、传统稀醪酱油发酵等。

固态发酵：发酵基质呈不流动状态。

如固态酱油发酵、米醋发酵、大曲酒（白酒）发酵等。

发酵产品主要类型： A 微生物菌体1.单细胞蛋白 （饲料添加剂、食品）2.食（药）用菌 （蘑菇、香菇、灵芝、猴头等）3.微生物农药（细菌、真菌、病毒：苏云金杆菌、白僵菌）4.疫苗（细菌、病毒）第一代：病原微生物及其产物 第二代：基因工程疫苗 第三代：人工合成疫苗5.微生态制剂（细菌：乳酸菌、双歧杆菌）B 代谢产物（分为初级代谢产物、次级代谢产物，这是一类当前最主要的微生物发酵产品，也是开发潜力最大的一类）；酒精、酱油、食醋、酸奶、谷氨酸、柠檬酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素、抗生素、毒素、激素、色素等C 酶酶制剂工业是利用微生物发酵，获得与生物体内的酶具有相同功能的酶制剂。

近几年，酶制剂的生产和应用研究已普遍引起各国的重视，已在食品、发酵、纺织、医药、造纸、皮革、化工、石油、畜牧饲料等部门得到应用。

我国主要应用在食品方面，其中产量较大的是α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶、蛋白酶和脂肪酶。

发酵工程三要素：原料、菌种、工艺条件 微生物工业发酵的基本过程工业菌种选育的定义、方法菌种选育：按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用自然菌种筛选、人工诱变育种、代谢控制育种或基因重组定向育种等方法得到优良菌种的工作。

方法：(1)自然选育：从自然界土壤、水、空气、动物、植物、矿物等样品中分离筛选得到菌种的方法。

(2)生产育种：长期生产过程中自然突变获得优良菌株。

(3)抗噬菌体菌株的选育（如去除吸附位点）(4)诱变育种：采用物理、化学诱变因素处理微生物细胞，提高基因的随机突变几率，然后通过定向筛选获得所需优良菌株。

(5) 代谢控制育种：通过改变微生物菌种的代谢途径或代谢自动调节系统（如增加特定基因拷贝数来提高限速酶含量）而使微生物发生异常代谢，使所需中间代谢产物过量积累。

(6) 基因重组定向育种：通过转化、转导、杂交和原生质体融合等遗传学方法和技术定向地重组微生物DNA ，使微生物的功能发生定向的改变。

工业菌种衰退的定义、防止方法菌种衰退的概念 ：指菌种整体在多次接种传代过程中逐渐造成生产能力降低，表现为发酵力（如对培养基的利用）或繁殖力（如孢子的产生）下降或发酵产物得率降低的现象。

序：微生物工业发酵的基本过程发酵原料（玉米、米、薯干、植物、菌种↓木材、石油等）↓预处理（初选、除杂、粉碎、水解等加工）选育↓↓发酵培养基的配制（添加水、无机盐及其他营养物，活化（斜面）↓调节碳氮比、pH 值等）↓灭菌扩大培养（摇瓶或↓↓茄子瓶）接种发↓↓酵进一步扩大培养→→→→→大型发酵（测量和控制发酵温度、pH 值、（种子罐）↓溶解氧等）产物与细胞的分离（过滤、离心、沉淀等）↓产物的精制（离子交换、层析、结晶、干燥等）提↓纯产品防止菌种衰退的方法：1.作好菌种保藏工作2．尽可能使每次培养条件适合而一致3．尽量减少传代次数4．应使用幼龄菌培养菌种复壮的概念与方法菌种复壮：在菌种已衰退情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，以恢复原有典型性状的措施。

衰退菌种复壮的方法1.单细胞菌株分离法2．沸水筛选法：菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。

3.改变培养条件法：采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。

4.通过宿主体复壮5.诱变处理法：对发生回复突变进行重新诱变育种。

工业菌种保藏原则与方法原则：挑选优良纯种，最好是休眠体（如孢子、芽孢等），创造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧、营养物质缺乏等），就可以达到菌种保藏的目的。

同时，作为可行的方法，还要考虑方法的经济和简便。

方法：1.斜面低温保藏法：菌种在斜面培养基上培养，生长旺盛后存放在4-8℃的冰箱中，一般半年要移植一次。

适合保藏实验室常用菌种。

2.低温冰箱保藏法：菌种经液体培养后，加入无菌甘油，使甘油含量为30-40%，置于-80℃低温冰箱中保存，保存期为1-10年。

适用于保存各类微生物菌体。

3.石蜡油封保藏法：医用石蜡油灭菌冷却后加在斜面菌种上,超过斜面顶部1cm，在室温下或冰箱里可保存1-10年。

几乎所有微生物都适用。

4.砂土保藏法：将干的孢子、芽孢与彻底灭菌的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置阴凉干燥处或冰箱中可保藏1-10年。

适合于孢子、芽孢等的保存。

5.硅胶保藏法：以纯净硅胶代替砂土,其他与砂土保藏法一样。

6.冷冻干燥保藏法：瓶中加入菌体或孢子悬液，-40℃低温冰箱冷冻1h，室温真空干燥固封，可保存10-数10年。

适用于保存各类微生物菌体。

保存运输方便。

7.液氮超低温保藏法：菌种密封于安踣瓶中, 慢速冻结器中以每分钟下降1℃的速度下降到-35℃，再迅速降温至-196℃，并在该温度下的液氮超低温罐中保存，保存期为3-9年。

适用于保存各类微生物菌体。

工业菌种扩大培养工艺与级数获得活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮的培养物。

种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。

斜面菌种→一级种子摇瓶培养→二级种子罐培养→发酵罐（二级）尽量采用二级发酵斜面菌种→一级种子摇瓶培养→二级种子罐培养→三级种子罐培养→发酵罐（三级）举例谷氨酸生产的种子制备：斜面培养——一级种子培养——二级种子培养——发酵温故知新1. 菌种选育指按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用自然菌种筛选、人工诱变育种、代谢控制育种或基因重组定向育种等方法得到优良菌种的工作。

2.微生物菌种保藏的常用方法有斜面低温保藏法、低温冰箱保藏法、冷冻干燥保藏法、砂土保藏法、硅胶保藏法和液氮超低温保藏法等。

？3.高丝氨酸缺陷型菌株由于缺乏高丝氨酸脱氢酶，不能合成高丝氨酸，从而走另一代谢途径，使赖氨酸大量积累。

培养基种类：1.按成分不同划分：天然培养基、半组合培养基、组合培养基2.按物理状态不同划分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基、脱水培养基3.按功能不同划分：选择培养基、鉴别培养基4.按培养目的不同划分：种子培养基、孢子培养基、发酵培养基发酵培养基设计的原则要“投其所好”，明确目的，是实验室用还是工业大生产用，是种子扩大培养还是生产发酵产物？要求获得菌体还是积累代谢产物，是正常代谢产物还是异常代谢产物，是为异养菌设计的还是为自养菌设计的？☆用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量较高；☆用于生产代谢产物的发酵培养基氮源一般应比种子培养基低，若代谢产物是次级代谢产物，要考虑是否加入特殊物质；☆工业生产发酵培养基，应选择来源广泛、价格低廉的原料。

发酵培养基设计的基本步骤1.调查研究：菌种来源、生理特性、生物合成途径,产物化学性质、提炼方法、质量要求等，以便“投其所好”。

2.培养基成分的确定：C/N比、重要金属非金属等、复合培养试验3.发酵条件的确定：温度、起始pH值、溶解氧、氧化还原电位、渗透压等查阅文献，借鉴经验，借助单因子试验与复合因子试验（如正交试验法）等对培养基成分与发酵条件进行优化。

4.补料：对碳及氮的代谢予以适当控制，或添加各种养料和前体物质。

5.不断完善：在生产实践过程中不断调整改进。

代粮发酵主要原料野生植物淀粉、野生植物纤维、木屑水解物、石油原料与产品（如石蜡、醋酸、乙醇等）、空气原料（碳酸气）前体物质、促进剂的概念前体物质：在有些氨基酸、核苷酸、抗生素等发酵中添加一些特殊物质能获得较高的产率，它们在发酵中主要起避免反馈抑制、作为产物的前身等作用，这些特殊物质称为前体物质。

促进剂：在氨基酸、抗生素和酶制剂发酵过程中，可以在发酵培养基中加进某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂。

促进剂作用原理（以抗生素生产为例）促进剂在抗生素生产中的作用原理：1.起生长因素作用2.推迟菌体自溶3.抑制了某些合成其它产物途径而使之向所需产物途径转化4.降低了产生菌的呼吸5.改变发酵液的物理性质，改善通气效果6.与产物结合，防止反馈抑制抗生素提纯主要方法：大多数抗生素是从滤液中提取的。

1.吸附法：利用活性炭、氧化铝等吸附剂吸附发酵液中的抗生素，再以适宜的pH值和洗脱剂洗脱，以达到浓缩和提纯目的。

此法选择性不高，获得产品纯度较低。

2.溶媒萃取法：利用抗生素在不同的pH值下在水或有机溶剂中的溶解度不同，反复提取以达到浓缩和提纯的目的。

3.离子交换法：利用某些抗生素盐类可解离为阳离子和阴离子，经离子交换树脂达到提纯和浓缩的目的。

此法的优点是成本较低，产品纯度较高，在生产上较为经济和安全。

4.沉淀法：利用某些抗生素和酸碱或金属盐类，形成不溶性或溶解度极小的复盐，使抗生素从发酵液中沉淀析出，然后进一步精制。

新抗生素生产工业化途径1.抗生素生产菌株的分离及筛选：大部分抗生素生产菌是从土壤中分离的，特别是富含有机氮的土壤，所以常用肥沃的菜园或森林等处的土壤作为分离抗生素生产菌的来源,进行分离和筛选。

2.抗生性药理试验：分离的某一菌株可使用检定菌(如:病理性葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、真菌等)确证是否能生产抗生素物质。

常用方法有：（1）交叉划线试验法（2）打点法3生成新抗生素的确证：生成的抗生素到底是新产品还是已知的，就需对其进行一系列的试验，连续测定并记载此抗生素对各种检定菌的生长阻止情况，然后对照抗菌性带表，即可确定该抗生素的种类或为新品种。

4.工业化阶段：如果发现了新的抗生素，还应该检测它对动物的毒性。

如果得到了良好的临床应用试验结果，就可开始探讨工业生产的发酵条件，顺序为振荡培养、小型发酵槽、试验工厂等。

包括确立培养基的组成、培养条件的选择和精制设计等等。

同时在生产过程中应不断注意菌株的改良问题。

温故知新1、实验室最常用培养基是（C ）A、天然培养基B、组合培养基C、半组合培养基2、一般来说，发酵培养基要求（ A ）A、碳源丰富B、氮源丰富C、原料精细3、在微生物工业菌种筛选中最常用的是（ B ），在食品或环境等微生物指标检测中常用（ A ）A、鉴别培养基B、选择培养基C、液体培养基4、制备固体培养基时需在液体培养基中加入 1.5-2.0%琼脂。