Fluo-3 AM_钙离子荧光探针_

钙离子荧光探针
钙离子荧光探针（CalciumIonFluorescentProbe）是一种特殊的荧光探针，可用于检测细胞内钙离子的浓度。

钙离子在哺乳动物细胞中发挥着重要作用，用于激活细胞内酶、转录因子和神经元信号传导。

因此，准确地检测和监测细胞内钙离子浓度，将有助于深入研究细胞环境中的生物学过程。

钙离子荧光探针的原理是：钙离子的参与荧光探针的改变使其荧光发生变化，以反映细胞内钙离子的浓度。

这种类型的荧光探针有多种类型，其中绝大多数都是以蛋白质或小分子化合物为基础，其中荧光活性位点上结合有一种特定的钙离子侦测分子。

在细胞内，当钙离子浓度增加时，这种侦测分子与钙离子结合，从而引起荧光发生变化，可用来监测细胞内钙离子的浓度。

钙离子荧光探针的优势有两个方面：其一，它非常灵敏，能够有效检测钙离子的浓度，从而预测和研究细胞内环境的变化；其二，它具有极高的特异性，能够单独检测钙离子中的杂质，而不受其他可能存在的离子的干扰。

结果，它能够准确反映细胞内钙离子的变化，为研究细胞生物学过程提供了重要的参考。

由于钙离子荧光探针的优势，它被广泛应用于生命科学和医学研究中。

例如，它可用于检测细胞中钙离子的浓度，以及在疾病发生中细胞内钙离子浓度的变化；可用于监测神经元细胞中钙离子的活动性，以及神经元之间的信号传导；还可以用于研究细胞增殖调控中钙离子的作用机制。

总而言之，钙离子荧光探针是一种新颖、灵敏、特异性较高的荧光探针，在生物学研究中有着广泛的应用，可以精准监测细胞内钙离子的浓度，为深入探索细胞环境中的生物学过程提供有力的技术支持。

分子式: C51H50Cl2N2O23分子量: 1129.85外观: 红色粉末别名: Fluo 3-AM纯度: 85%以上（HPLC）储存条件: -20℃运输条件: 室温Fluo 3-AM是一种检测细胞内钙离子的荧光探针。

Fluo 3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍，是目前最常用的一种钙离子荧光探针。

激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以Fluo 3可被广泛使用于这种显微镜上。

这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品细胞的光损伤。

Fluo 3也可用来检测紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙。

Fluo 3-AM是Fluo 3的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。

Fluo 3-AM (钙离子荧光探针) 需用无水DMSO (anhydrous DMSO)配制。

Fluo 3-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。

Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo 3，从而被滞留在细胞内。

Fluo 3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。

50 μg Fluo 3-AM的配制操作说明(for Human T cells)*试剂:2 mM的Fluo 3-AM/DMSOPluronic F127Hanks’ balanced salt solution (HBSS)HEPES buffer saline (10 mM HEPES, 1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 5 mM glucose, 0.1% BSA, pH 7.4)操作:1. 配制2mM的Fluo 3-AM/DMSO溶液即：将1mg Fluo 3-AM溶于442ulDMSO中（推荐现配现用）。

2. Pluronic F127先用DMSO配制成20%（W/V）的溶液，室温保存。

钙离子荧光探针步骤
1. 准备材料
- 钙离子荧光探针试剂盒
- 培养皿或载玻片
- 细胞或组织样本
- 细胞培养基或生理盐水
- 荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜
2.细胞或组织样本准备
- 将细胞或组织样本转移到培养皿或载玻片中
- 用适当的培养基或生理盐水覆盖样本
3.加入钙离子荧光探针
- 根据试剂盒说明,配制钙离子荧光探针工作液
- 将工作液小心加入到样本中,避免干扰细胞或组织
- 在适当温度和时间下孵育,让探针与细胞内钙离子结合
4.清洗
- 用新鲜培养基或生理盐水轻轻冲洗样本,去除未结合的探针
5.观察和成像
- 将样本置于荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下
- 选择合适的激发波长和发射波长,观察钙离子荧光信号
- 对感兴趣的区域进行成像和记录
6.数据分析
- 使用专业软件分析荧光强度和分布
- 根据荧光信号强弱评估细胞或组织中钙离子的水平和动态变化
7.实验结束
- 根据实验需求,进行后续处理或保存样本
- 妥善处理废弃物品和溶液
注意事项:
- 严格遵守实验室安全规程
- 谨慎操作,避免污染和失活探针
- 适当控制实验条件,获得可靠数据。

一、Fluo-3AM的理化性质颜色及形状：橘红色液体纯度：，大于95%（高效液相）溶解性：溶于DMSO吸收波长/发射波长：506nm /526nm(低/高钙)消散系数：86000/Mcm(506nm)保存与使用：粉状的FLUO-3AM应保存于-20度以上。

建议使用DMSO作为溶媒。

在溶解前，FLUO-3AM和DMSO均须放置至室温。

溶解过程可能会比较慢。

用无水的DMSO溶解的FLUO-3AM长期保存，应严格密封，并保存于-20度。

使用前，将保存液放置至室温后再打开。

可避免AM探针在长期的保存过程中水解。

二、Fluo-3AM的工作原理FLUO-3广泛用于长波长的荧光钙指示剂。

其在506NM处被吸收，可以被氩离子激光的488nm激发光激发，便于检测。

FLUO-3在没有同钙结合的情况下，无荧光产生。

但是，在与钙结合后，荧光（526nm）增强至少40倍。

Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。

Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。

Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。

Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。

实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。

三、Fluo-3AM的应用1、过程概述用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为0.5-5μM。

通常用含有0.5-5μM的Fluo-3 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育15-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。

然后在流式细胞仪上进行检测。

2、Fluo-3AM使用液的配置100ug的Fluo-3AM，分子量是1219.9。

按实际需要的摩尔浓度折算，无水DMSO溶解。

细胞内钙离子的检测方法包括荧光探针法、放射性同位素示踪法、电极法等。

下面我将结合以上方法给出详细的说明：
1. 荧光探针法：这是一种应用广泛的细胞内离子检测方法，主要应用于钙离子检测。

钙离子荧光探针如BCECF、Fluo-3、Fura-2等可以嵌入细胞，特异性地与细胞内的钙离子结合，从而改变其荧光特性。

例如，当钙离子结合到Fluo-3等染料上时，染料的吸收和发射光谱会发生变化，使其在细胞内的钙离子浓度变化时可以被仪器检测到。

这种方法具有灵敏度高、操作简便等优点，但也有一定的局限性，如细胞内钙离子浓度变化时可能伴随其他离子浓度的变化，导致结果复杂。

2. 放射性同位素示踪法：这种方法需要使用放射性标记的物质，如Ca45，将其引入细胞内，通过放射自显影技术检测细胞内钙离子的变化。

这种方法操作相对复杂，且有一定的放射性污染风险，因此较少使用。

3. 电极法：这是一种通过在细胞内放置一个微电极，该电极可以测量钙离子的电化学变化。

这种方法主要用于体外实验，如组织块或单个细胞的钙离子测定。

在实际操作中，荧光探针法更为常用，因为其灵敏度高、操作简便。

然而，任何一种方法都有其局限性，需要在实验设计和实际操作中根据具体情况进行选择和调整。

以上就是细胞内钙离子检测的一些常见方法，希望能对你有所帮助。

一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。

Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。

Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。

后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。

并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。

因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。

Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。

但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。

此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。

Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。

荧光分光光度f7000细胞内钙离子浓度测定荧光分光光度法是一种常用的细胞内离子浓度测定方法之一，特别适用于测定细胞内钙离子浓度。

在本文中，将介绍荧光分光光度法测定细胞内钙离子浓度的原理、步骤和应用。

一、原理荧光分光光度法利用荧光探针与目标离子之间的相互作用，通过检测荧光强度来测定细胞内离子浓度。

荧光探针是一种能够与特定离子结合的化合物，当与离子结合时，荧光探针的荧光性质会发生改变，从而可以测量到荧光信号的强弱。

对于细胞内钙离子浓度的测定，通常会使用钙选择性荧光探针Fura-2或Fluo-3。

这两种荧光探针在与钙离子结合后，荧光发射峰会发生位移。

其中，Fura-2在结合钙离子后的荧光发射峰位移从380 nm至500 nm，而Fluo-3在结合钙离子后的荧光发射峰位移从510 nm至540 nm。

二、步骤1. 细胞处理：将待测细胞种植在培养皿中，使其附着于培养皿底部。

然后，用含有钙选择性荧光探针的培养基处理细胞，使荧光探针能够进入细胞内。

2. 荧光探针染色：将细胞孵育在荧光探针染色溶液中一段时间，确保荧光探针能够与细胞内的钙离子结合。

3. 荧光信号测定：使用荧光分光光度仪进行荧光信号测定。

将含有染色细胞的培养皿放置在荧光分光光度仪样品舱中，选择相应的激发波长和检测波长，然后开始记录荧光信号。

4. 数据分析：使用荧光分光光度仪软件对测得的荧光信号进行数据分析。

根据荧光信号的强度，可以计算出细胞内钙离子的浓度。

三、应用荧光分光光度法测定细胞内钙离子浓度在许多生物学研究领域都有广泛的应用。

1. 生物医学研究：钙离子是细胞内重要的信号转导分子，参与调节许多生理过程，如细胞增殖、迁移、分化等。

测定细胞内钙离子浓度可以揭示这些生理过程的调节机制。

例如，在研究神经元突触传递过程中，测定细胞内钙离子浓度可以了解神经元活动的程度和时间。

2. 药物筛选：荧光分光光度法可以在药物筛选过程中用于测定药物对细胞内钙离子浓度的影响。

钙离子荧光探针原理钙离子荧光探针是一种常用的生物学探针，用于观察细胞内钙离子的浓度变化及其参与的生理过程。

钙离子是细胞内一种重要的信号分子，参与细胞的生长、分化、凋亡等多种生理过程，其浓度变化对细胞生命活动起着关键作用。

因此，研究细胞内钙离子的浓度变化和调控机制对于了解细胞的生命活动具有重要的意义。

钙离子荧光探针的原理是利用一些特定的化合物，如螯合剂和荧光分子，通过与细胞内的钙离子结合形成复合物，并发生荧光变化。

当钙离子浓度变化时，探针的荧光信号会随之发生变化，从而实现对细胞内钙离子浓度变化的检测。

最常用的钙离子荧光探针是Fura-2和Fluo-3。

Fura-2是一种螯合荧光探针，它的结构中含有两个螯合基：一个对钙离子具有高亲和力，另一个对镁离子具有较低的亲和力。

Fura-2与细胞内的钙离子结合后，发生吸收和荧光变化，荧光的激发波长为340 nm，发射波长为510 nm。

当钙离子浓度升高时，其螯合基的受体位发生形变，荧光强度会发生变化。

Fluo-3是一种单倍体异硫氰酸荧光探针，它通过选择性结合细胞内的钙离子而变成荧光形式。

Fluo-3在荧光组成的过程中使用了一对吸收波长(495 nm)和发射波长(525 nm)。

钙离子荧光探针具有高灵敏度、高空间分辨率、反应速度快等优点，可以广泛应用于细胞生物学的各个方面。

例如，它可以用于研究细胞内钙离子的变化和参与的生理过程，如细胞的周期性运动、原癌基因表达的调控、神经元的活动等。

此外，钙离子荧光探针还可以用于药物筛选和评估，评估药物对细胞内钙离子浓度的影响，了解药物的作用机制。

总之，钙离子荧光探针是一种重要的生物学探针，可以帮助我们更好地了解细胞内钙离子的浓度变化及其参与的生理过程，对临床诊疗和药物研发具有重要价值。

细胞内钙离子浓度的测定方法与机制研究生命是由细胞组成的。

随着科技的不断进步，研究细胞的方式也越来越多元化。

研究细胞内钙离子浓度的测定方法与机制研究也是重要的一部分。

细胞内钙离子浓度的测定方法：1. 荧光探针法荧光探针法是一种常用的测定细胞内钙离子浓度的方法。

这种方法通过将钙离子与荧光探针结合来测量细胞内的钙离子浓度。

经典的钙荧光探针有Fura-2、Fluo-3和Rhod-2等。

这些荧光探针对钙离子的绑定并不是固定的，他们会随着钙离子浓度的变化而发生形状的改变，这样就能够在荧光显微镜中观察到钙荧光信号的变化。

2. 钙选择性电极法钙选择性电极法是另一种测量细胞内钙离子浓度的方法。

这种方法通过将一种特殊的电极放置在溶液中，来测量钙离子的浓度。

当钙离子进入细胞时，它们会与荧光探针或电极中的阳离子发生反应，从而产生一个可以测量的电信号。

细胞内钙离子浓度的机制：细胞内钙离子浓度的调节是非常重要的。

钙离子是一种重要的信使分子，可以参与许多细胞内的生理过程，例如信号传递、细胞分化和凋亡等。

因此，细胞需要一种机制来维持平衡并确保正确的功能。

1. 长度调节作用细胞膜表面有许多钙通道和钙泵。

当细胞膜受到刺激时，钙离子会通过钙通道进入细胞。

细胞也有一些钙泵，可以把钙离子从细胞中排出，从而维持细胞内的钙离子浓度平衡。

这个过程的维持平衡是一个动态的过程，这需要细胞通过调整通道和钙泵的表达来实现。

2. 钙闸蛋白调节除了长度调节作用之外，细胞还可以通过钙离子浓度感受器来调节钙离子的浓度。

当钙离子浓度达到一定水平时，这些感受器将启动一定的信号途径，从而调整细胞内钙离子的浓度。

钙离子感受器包括钙离子抗性调节蛋白，肌钙蛋白，钙离子绑定蛋白等等。

这些蛋白质可以调节钙离子与其他蛋白质的互作，因此对细胞功能的影响非常重要。

结语：细胞内钙离子浓度的测定方法与机制研究是细胞生物学研究的一个重要方向。

通过这些方法与机制的研究，我们可以更好地理解细胞的生理过程以及钙离子在其中所扮演的角色。

关于钙离子荧光探针的介绍前面我们介绍了荧光指示剂法可以将Ca2+检测的实验与其他技术结合使用，如可以与流式细胞仪、荧光分光光度计、或者荧光显微镜进行联合检测。

紫外光型主要包括Quin-2、Indo-1、Fura-2等，数量较少，可见光型数目较多，包括Fluo-3、钙黄绿素、Rhod-2等。

荧光指示剂根据测光原理和数据处理的性质又可以分为比值型和非比值型两种类型。

其中Fura-2、Benzothiaza、Indo-1和BTC等系列属于比值型,化学荧光指示剂大都为非比值型染料。

虽然比值型荧光染料较少，但应用广泛，下面介绍几种典型的荧光染料的特点：Fura-2 属于双波长激发指示剂，其激发特性与Ca2+浓度有关，当介质中没有Ca2+时，其激发峰为380nm，当与钙结合时，激发峰向短波方向340nm处移动，最后分别以340nm、380nm 激发,得到发射光的比例，这种比例与细胞内Ca2+浓度成正比例的关系，这种染料可以减少染料负载，增强结果的准确性。

Fura-2与双波长显微荧光分光光度计联用可以测量单细胞内Ca2+的浓度，与流式细胞仪联用可以测定细胞悬液的Ca2+的浓度，与荧光分光光度计联用测量单细胞内及细胞悬液钙离子的浓度，因为其结果准确，而且不易被漂白，所以是广泛使用的指示剂。

Indo-1也是一种双波长发射指示剂，单波长激发（340nm）和双波长发射（405nm和506nm）,也可以用荧光比率来反应细胞内Ca2+的浓度。

它的优点与Fura-2相似，但其漂白作用明显，应用时应该尽量减小狭缝宽度和尽量减少激发光照射时间。

目前最新的荧光指示剂是第三代荧光指示剂Fluo-3,是典型的单波长指示剂，激发波长位于可见光范围内。

最大吸收峰位于506 nm,最大发射波长是526 nm，Fluo-3与Ca2+结合后其荧光强度比游离时高出40倍左右，从而避免了细胞自身的荧光干扰，作为长波长指示剂，Fluo-3可以用作激光共聚焦成像研究，或者与其他荧光指示剂钙离子荧光探针Fura-2，AM，21020钙离子荧光探针Indo-1，AM，21030Fura-8，AM【也称Fura-6】，AM，21055Fura-2和Indo-1的荧光检测在适当的条件下通过监测比值型荧光指示剂的波长变化与细胞内游离的Ca 2+浓度的变化关系来检测Ca 2+浓度是一项出色的技术，我们可以通过观察Fura-2在300 nm至400 nm之间的吸收位移来检测钙离子浓度（同时以约510 nm的固定发射波长）。

1.新生Wsitarn乳鼠(出生1天以内2只,体重10一15g,2.试剂与化学用品:Fluo一3/AM 钙离子荧光探针高糖DMEM 细胞培养基胎牛血清青霉素/链霉素谷氨酞胺FITC 异硫氰酸荧光素PI 碘化丙啶NF一L(C一15)poly 第一抗体葡萄糖(粉剂)4%多聚甲醛KCLNaCLNaHCO3NaHPO4.7H2ODPBS胰蛋白酶三蒸馏水多聚赖氨酸二甲基亚枫。

3仪器:流式细胞仪细胞培养箱超净工作台眼科剪2把眼科镊2把解剖剪1把细胞培养板细胞培养皿盖玻片10ml锥形管50ml锥形管青霉素瓶及瓶塞流式细胞仪专用试管10ml移液管5ml移液管酒精灯量筒量杯容量瓶滤纸二、方法1、D一HaknS液配制:(1)试剂成分克(gl/)KCL 0.4NaCL 8.0KHZPO4 0.06NaHCO3 0.35NaHPO4.7H20 0.06（2）配制程序:1)准确称量试剂。

2)将成分依次溶解于750ml蒸馏水中(待前一种完全溶解,在溶下一种)3)将2)移入l000ml容量瓶中,补足蒸馏水,充分混匀。

4)用1M NaOH或1M HCL将溶液pH值调至7.2。

5)用滤纸过滤100Om1D一HnakS液,并分装于100ml的玻璃瓶中,4℃冰箱内保存备用。

2.木瓜蛋白酶和DNA酶溶液的配制:(1)将D一Hanks液高压消菌,并调pH至7,2。

(2)称取20g木瓜酶粉末置于烧杯中,加D一Hnaks至100ml,加人适量DNA酶，完全融解,搅拌匀。

(3)用0.22um的微孔滤膜过滤除菌,50ml分装,4℃冰箱保存,用前调HP值至7.2。

配制出2mg/ml的木瓜酶+适量DNA酶。

（0.125%的胰酶容易导致消化过快，消化后细胞大量死亡，木瓜蛋白酶DNA酶必须现配现用，这里的Hanks液不能加入血清）3.二抗抗生素液配制(l)试剂成份剂量青霉素100万u链霉素1g(100万u)(2)配制程序l)将D一HankS液100ml高压消菌,并调pH至7.2。

Fluo-3 AM(钙离子荧光探针)●分子式为C51H50Cl2N2O23，分子量为1129.85。

●粉末样品储存：-20℃●文献：最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。

实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。

激发波长490-500nm；发射波长528nm激发波长506nm；发射波长526nm●储存液：配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中。

将1mg Fluo-3 AM溶解于442μL的无水DMSO中形成2mM的储存液。

低温快速操作。

●工作溶液：用实验中的缓冲液稀释成工作溶液。

文献：用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为0.5-5μM。

缓冲液中125 nM Fluo-3/pH 7.2。

10μM/1h/30℃●孵育时间：10，15-60分钟，避光。

●孵育温度：20-37℃，●关于Pluronic F-127，有些文献用，有些文献不用。

染色培育后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。

朱冬发：精子染色及观察将精子悬液在1000 rpm下离心10 min，取白色沉淀，加入37℃预温的含0.01% Pluronic F-127的过滤自然海水995 μl取代原培养液，然后再加入浓度为1 mmol/L的Fluo-3/AM5 μl，（Fluo-3/AM的实际工作浓度：1μM）振荡均匀，37℃避光负载30 min。

过滤自然海水洗3次（1000 rpm/min离心5 min），加入含50 μg/ml A23187的过滤海水震荡成精子悬液，封片观察。

将载玻片置于载物台上，选择合适的层面，在激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP2）100倍油镜下进行扫描观察。

实验所用光电倍增管PMT值为618，钙离子荧光染料Fluo-3/AM的激发波长为488 nm，发射波长为526 nm。

Fluo-3 AM (钙离子荧光探针)产品编号产品名称包装(钙离子荧光探针, 5mM) 20微升AMS1056 Fluo-3产品简介：Fluo-3 AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。

分子式为C51H50Cl2N2O23，分子量为1129.85。

Fluo-3和Fura-2相比，其优点是：一方面可以被氩离子激光(argon-ion laser)的488nm激发光激发，便于检测；另一方面，Fluo-3和钙离子结合后荧光变化更强，即对钙离子浓度变化的检测更加灵敏；同时，Fluo-3和钙离子的结合能力较弱，这样可以比Fura-2检测到细胞内更高浓度的钙离子水平；此外，对于细胞内的钙离子的即时变化反应得更加准确，减小了因为和钙离子解离速度慢而导致的荧光变化滞后。

本Fluo-3 AM (钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存液，浓度为5mM。

Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。

Fluo-3 AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。

Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。

Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。

实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525-530nm。

Fluo-3的激发光谱和发射光谱参考下图。

用于细胞内钙离子检测时，Fluo-3 AM的常用浓度为0.5-5μM。

通常用含有0.5-5μM的Fluo-3 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育15-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。

包装清单：产品编号产品名称包装(钙离子荧光探针, 5mM) 20微升AMS1056 Fluo-3—说明书1份保存条件：-20℃避光保存，6个月有效。

细胞生物学中的细胞内钙离子测定技术在细胞生物学研究领域中，测定细胞内钙离子浓度是一个非常重要的课题。

细胞内钙离子浓度的变化与许多生物学过程密切相关，如细胞信号传导、细胞增殖、细胞凋亡等。

因此，开发出准确、可靠的细胞内钙离子测定技术对于揭示细胞内钙离子的重要调控作用具有重要意义。

1. 荧光探针法荧光探针法是一种常用的细胞内钙离子测定技术。

它利用钙离子结合剂（如Fura-2, Fluo-3, Rhod-2等）及其与钙离子配合形成的荧光产物来测定细胞内钙离子浓度。

通过荧光显微镜等荧光成像仪器，可以直接观察到细胞内钙离子的分布和变化情况。

2. 钙指示剂法钙指示剂法是另一种常用的细胞内钙离子测定技术。

它利用钙指示剂（如BAPTA, EGTA等）与钙离子结合形成稳定的配位化合物，通过测定钙指示剂与钙离子的结合情况来推测细胞内钙离子的浓度。

这种方法通常需要将细胞或亚细胞分离提取，并通过化学分析方法（如光谱法、离子选择性电极法等）来测定结合状态和浓度。

3. 钙敏感蛋白法钙敏感蛋白法是一种基于钙敏感蛋白与钙离子结合的测定技术。

这种方法通常利用细胞内的特定钙敏感蛋白（如calmodulin, troponin C等）与钙离子结合后的构象或功能变化来间接测定细胞内钙离子的浓度。

通过测定钙敏感蛋白的结合活性或功能变化程度，可以推测出细胞内钙离子的浓度变化。

值得注意的是，细胞内钙离子测定技术要求仪器灵敏度高、选择性好、操作简单快速。

此外，为了保证测定结果的准确性，还需要进行严格的实验设计和数据处理。

为了增加细胞内钙离子测定技术的可靠性，研究人员不断进行技术改进和创新，推出了一系列新的测定方法，如光学成像法、基于天然荧光染料的测定法等。

总结起来，细胞生物学中的细胞内钙离子测定技术是一项关键的研究内容。

荧光探针法、钙指示剂法和钙敏感蛋白法是常用的测定技术，它们在测定细胞内钙离子浓度的同时，也为我们揭示细胞内钙离子的重要生物学功能提供了重要的手段和思路。

fluo-3 am荧光原理Fluo-3 AM荧光原理荧光染料广泛应用于生物学研究和医学诊断中，其中一种常用的荧光染料是Fluo-3 AM。

Fluo-3 AM是一种可逆的低亲水性荧光钙指示剂，具有较高的荧光量子产率和良好的细胞渗透性，被广泛用于研究细胞内钙离子浓度的变化。

Fluo-3 AM的工作原理是基于荧光共振能量转移（FRET）的现象。

FRET是一种非辐射能量转移过程，其中一个荧光物质的激发态能量被传递给另一个荧光物质的基态。

在Fluo-3 AM中，荧光共振能量转移发生在Fluo-3分子和细胞内游离钙离子之间。

Fluo-3 AM的使用需要一系列步骤。

首先，将Fluo-3 AM溶解在有机溶剂中，得到一个可以渗透细胞膜的荧光染料。

然后，将该溶液加入到含有待测细胞的培养基中，使其与细胞接触。

Fluo-3 AM分子会通过细胞膜渗透进入细胞内，然后在细胞内被酯酶水解，释放出Fluo-3。

Fluo-3是一种钙离子螯合剂，可以与细胞内游离钙离子结合形成复合物。

当Fluo-3与游离钙离子结合时，它的荧光特性会发生改变。

Fluo-3在低钙离子浓度下几乎不发出荧光，而在高钙离子浓度下，其荧光强度会显著增加。

这是因为Fluo-3与钙离子结合后，发生了荧光共振能量转移。

当钙离子浓度较低时，Fluo-3分子间的荧光共振能量转移较弱，荧光信号较低；而当钙离子浓度较高时，荧光共振能量转移增强，荧光信号增强。

为了观察Fluo-3的荧光信号变化，需要使用荧光显微镜进行观察。

在荧光显微镜下，通过激发Fluo-3产生荧光，然后使用适当的滤光片选择荧光信号的波长范围。

Fluo-3的荧光信号可以通过摄像机捕捉到，并通过计算机软件进行图像分析和图像处理。

Fluo-3 AM荧光原理的应用非常广泛。

研究者可以利用Fluo-3 AM 来研究细胞内钙离子浓度的变化，从而了解钙离子在生物体内的重要作用。

钙离子是许多细胞信号传导过程的重要组成部分，包括细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化等。

细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。

Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。

Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。

后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。

并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。

因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。

Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。

但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。

此外，Fluo-3与Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。

Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。

1. 了解钙流实验的基本原理和方法。

2. 掌握利用荧光染料检测细胞内钙离子浓度的技术。

3. 观察和分析不同条件下细胞内钙离子的动态变化。

二、实验原理钙离子在细胞内具有重要的生理和生化作用，参与细胞信号传导、肌肉收缩、神经递质释放等过程。

荧光染料Fluo-3 AM是一种用于检测细胞内钙离子浓度的荧光染料，其原理是：Fluo-3 AM在细胞外呈非荧光状态，进入细胞后，被细胞内酯酶水解成Fluo-3，Fluo-3与钙离子结合后，发出荧光，通过荧光强度的变化可以检测细胞内钙离子浓度的变化。

三、实验材料1. 细胞：大鼠心肌细胞、神经细胞等。

2. 荧光染料：Fluo-3 AM。

3. 试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、DMSO、KCl、MgCl2、ATP等。

4. 仪器：荧光显微镜、细胞培养箱、离心机、酶标仪等。

四、实验方法1. 细胞培养：将大鼠心肌细胞或神经细胞接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养至适宜状态。

2. 染色：将Fluo-3 AM用DMSO溶解，配制成一定浓度的染色液。

将细胞用PBS洗涤后，加入染色液，置于细胞培养箱中孵育30分钟。

3. 激活：将染色后的细胞用PBS洗涤，加入一定浓度的KCl、MgCl2和ATP等试剂，模拟生理条件下细胞内钙离子的动态变化。

4. 观察与记录：利用荧光显微镜观察细胞内钙离子浓度的变化，并通过荧光显微镜的图像采集系统记录不同时间点的荧光图像。

5. 数据分析：将采集到的荧光图像导入图像分析软件，分析细胞内钙离子浓度的动态变化。

1. 细胞内钙离子浓度的动态变化：在KCl、MgCl2和ATP的刺激下，细胞内钙离子浓度呈先升高后降低的趋势，说明细胞内钙离子参与了细胞信号传导和生理过程。

2. 不同条件下细胞内钙离子浓度的变化：在不同浓度的KCl、MgCl2和ATP作用下，细胞内钙离子浓度存在差异，说明细胞内钙离子浓度受到多种因素的调节。

六、实验讨论1. 本实验通过荧光染料Fluo-3 AM检测细胞内钙离子浓度，成功观察到细胞内钙离子浓度的动态变化，为研究细胞内钙离子在生理和病理过程中的作用提供了有力手段。