产漆酶细菌的筛选、鉴定及产酶条件的初步优化

漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。

漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。

糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。

由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。

通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。

漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。

由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。

漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。

造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。

环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。

分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。

实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌是一类具有重要应用价值的菌种，能够分解淀粉类和纤维素类物质，具有广泛的应用前景。

本研究旨在通过筛选和鉴定，找到高效产漆酶的细菌菌株，并研究其固体发酵条件。

我们从土壤和水样品中收集多个潜在的产漆酶细菌菌株。

这些菌株被分离、纯化并保存以备后续的实验使用。

然后，我们使用碘碟法进行最初的筛选，通过菌株在含有淀粉或纤维素的培养基上形成明显溶解区来判断其分解能力。

筛选出的阳性菌株被进一步培养、扩增和鉴定。

鉴定的流程主要包括形态学观察、生化试验和分子生物学鉴定。

形态学观察包括菌落形态、细胞形态、孢子形态等。

生化试验主要包括氧化酶试验、淀粉分解酶试验、纤维素分解酶试验等。

分子生物学鉴定则主要通过16S rRNA序列分析来确定菌株的分类地位。

通过以上的筛选和鉴定过程，我们最终确定了一株高效产漆酶的细菌菌株。

接下来，我们进行了固体发酵条件的研究。

我们对产漆酶细菌的最适发酵基质进行了选择和优化。

我们评价了不同基质如淀粉、纤维素、豆饼等对产漆酶产量的影响，并通过响应曲面法确定了最佳基质比例。

然后，我们研究了发酵温度、pH值、初始菌液浓度、培养基添加剂等参数对产漆酶产量的影响，并进行了优化。

我们对优化后的固体发酵条件进行了验证和比较。

通过对产漆酶产量、酶活力和底物降解效率的测试，我们确定了最佳的固体发酵条件。

漆酶高产菌的筛选及产酶优化刘家扬;蔡宇杰;廖祥儒;王欣;李枝玲;张大兵【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)004【摘要】采用愈创木酚初筛平板从干枯的木头中筛选得到一株产漆酶活力较高的菌株SYBC-L3(以下简称L3),在含有愈创木酚的PDA平板上生长时菌落周边出现明显的铁红色变色圈.通过对L3发酵产漆酶的单因素试验及L9(34)正交试验,确定了最适发酵条件,优化后的培养基为:麦芽糖 12 g/L, 豆粕 6 g/L,CuSO4 0.5g/L,KH2PO4 1 g/L,Na2HPO4 0.2 g/L,MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L,MnSO4 0.034 g/L, 愈创木酚0.8 mmol/L,吐温-80 0.5g/L;优化后的培养条件为:接种量10%(V/V),装液量80 mL/250 mL, 起始pH 4,转速200 r/min,温度30 ℃,以DMP 为底物在第8天时酶活可达60 130 U/L,比优化前提高42倍.【总页数】6页(P10-14,45)【作者】刘家扬;蔡宇杰;廖祥儒;王欣;李枝玲;张大兵【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江苏汉邦科技有限公司,江苏,淮安,223001;江苏汉邦科技有限公司,江苏,淮安,223001【正文语种】中文【相关文献】1.产漆酶真菌筛选及其产酶条件的优化 [J], 柴新义;安双登;盛硕;苏海2.漆酶高产菌株的筛选及产酶条件优化 [J], 王丽娟;何培新;李明丽3.产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 [J], 赵文娟;徐升运;任平4.产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化 [J], 王雪; 刘太林; 杨焜梅; 王志成; 湛莹; 薛兆淞; 李永佳5.栓菌属高产漆酶菌株的筛选及其发酵产酶条件研究初报 [J], 朱明旗;曹支敏;李振歧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
一、引言
漆酶是一种重要的工业酶，具有去除污水中有机物、漆水处理、食品添加剂等广泛的
应用。

目前，大部分漆酶产生菌株来源于土壤和水体等自然环境中。

而固体发酵是一种能
够充分利用含固体物质的废弃物进行生物转化的方式，可用于酶的生产。

本研究将选择适
合固体发酵的细菌菌株，进行筛选鉴定及研究其固体发酵条件，以提高漆酶的产量和活
性。

二、方法和材料
1. 菌株的筛选
从土壤和水体中分离细菌，根据产酶圈的形成情况进行初步筛选。

选择产酶圈明显的
菌株进行进一步的鉴定。

2. 细菌的鉴定
利用形态学、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法对选出的菌株进行鉴定，确定其属种。

3. 固体发酵条件研究
确定最适合细菌产漆酶的固体发酵条件，包括pH、温度、底物浓度、初始湿度等。

三、结果
1. 菌株的筛选和鉴定
筛选出多个具有产酶能力的细菌菌株，经鉴定后确定其中一株为Bacillus subtilis。

该菌株的漆酶活性较高，适合用于固体发酵生产。

2. 固体发酵条件研究
在固体发酵条件研究中，发现Bacillus subtilis固体发酵最适宜的pH为7.0，温度为37℃，底物浓度为10g/L，初始湿度为60%。

四、讨论
本研究通过菌株的筛选鉴定和固体发酵条件研究，成功地确定了适合固体发酵生产漆
酶的Bacillus subtilis细菌菌株，以及最适宜的发酵条件。

这些结果为进一步大规模生
产漆酶提供了重要的理论依据和技术支持。

产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究摘要：从采自秦岭的森林腐木菌苔上分离到一株产漆酶的裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）菌株mys005，对其产漆酶培养方式、培养基组成及培养条件进行了优化试验。

结果表明，裂褶菌菌株mys005的产漆酶适宜培养方式为液体浅层振荡培养，含有Cu2+、Mn2+、Zn2+的微量元素复合液、洋葱（Allium cepa L.）、麦（Triticum aestivum L.）麸对其产漆酶都有较大的促进作用，而愈创木酚则对其生长和产漆酶有抑制作用。

由新鲜马铃薯（Solanum tuberosum L.）200 g、K2HPO4 1.00 g、NaCl 0.50 g、MgSO4 ·7H2O 0.50 g、NaNO3 2.50 g、CaCl2·2H2O 0.10 g、FeCl3 0.02 g、吐温-80 1.20 mL溶于1 000 mL去离子水中组成的培养基在添加微量元素复合液（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+10 mg/mL ZnSO4·7H2O）3 mL、洋葱100 g、麦麸10 g后，并且培养基起始pH 4.5、培养温度30 ℃、培养摇床转速200 r/min、培养时间7 d，则摇瓶发酵的漆酶产酶量最高可达1 121 U/mL，显示出了良好的工业开发潜力。

关键词：漆酶；裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）；筛选；产酶培养基；优化Isolation of Schizophyllum commune Producing Laccase and Optimization of Laccase Production ConditionsAbstract： A Schizophyllum commune Fr. strain mys005 producing laccase was isolated from the rotten wood lawn in forest of Qinlin. The culture method for laccase production，medium composition and cultivation conditions was optimized. Results showed that the suitable cultivation method for S. commune strain mys005 to produce laccase was shallow liquid shaking culture. Trace elements compound liquid containing Cu2+，Mn2+，Zn2+，onion （Allium cepa L.），wheat （Triticum aestivum L.）bran could promote laccase production；while guaiacol could inhibit the growth and laccase production. If adding trace element compound solution（50 mg/mL CuCl2·2H2O+20 mg/mL MnSO4·H2O+ 10 mg/mL ZnSO4·7H2O）3 mL，onion 100 g，wheat bran 10 g，in the medium containing fresh potato （Solanum tuberosum L.）200 g，K2HPO4 1.00 g，NaCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，NaNO3 2.50 g，CaCl2·2H2O 0.10 g、FeCl3 0.02 g、tween-80 1.20 mL in 1 000 mL deionized water，and keeping the starting pH at 4.5，starting temperature at 30 ℃，culture shaker speed at 200 r/min，culturing for 7 d，the laccase enzyme production yield in shake flask fermentation could be up to a maximum of 1 121 U/mL，showing great potential for industrial development.Key words：laccase；Schizophyllum commune Fr.；isolation；enzyme producing medium；optimization漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜元素的多酚氧化酶，是重要的木质纤维（Ligno cellulose）降解酶之一[1]。

白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究白腐真菌菌株的筛选及液体发酵产漆酶条件的优化研究漆酶是一种酸性酶，广泛应用于木材加工、油漆去除、纸浆脱墨等领域。

为了寻找高效的漆酶产生菌株，本研究对白腐真菌的菌株进行了筛选，并优化了其液体发酵产漆酶的条件。

第一部分：白腐真菌菌株的筛选从环境中采集了多个土壤和木材样品，并将其分离培养于漆酶富集培养基中。

经过连续传代培养，筛选出了表现出高漆酶产酶能力的白腐真菌菌株。

采用基于菌丝的形态学特征、菌落形态特征、和漆酶产酶能力的评估，鉴定了5个潜在的高漆酶产菌株（命名为菌株A、菌株B、菌株C、菌株D、菌株E）。

接下来，我们将进一步优化这些菌株的液体发酵条件。

第二部分：液体发酵条件的优化2.1 碳源在液体培养基中加入不同碳源，如木质素、纤维素、葡萄糖和麦芽糖，分别对5个菌株进行液体发酵。

结果表明，以木质素作为唯一碳源时，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力最高，分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他碳源的产酶能力高出很多。

因此，我们选择了木质素作为主要碳源。

2.2 氮源尝试了不同的氮源对菌株C和菌株E的漆酶产酶能力的影响。

我们测试了不同浓度的尿素、酵母提取物和氨基酸，结果发现在0.5%尿素和0.1%酵母提取物的情况下，菌株C和菌株E的产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL，比其他条件下的产酶能力最高。

2.3 pH值和温度进一步优化了液体培养基的pH值和温度。

在不同的pH值和温度下培养菌株C和菌株E，观察到最佳产酶条件是在pH 5.0和30°C的情况下。

在这种条件下，菌株C和菌株E的漆酶产酶能力分别达到了XX U/mL和XX U/mL。

结论：通过对白腐真菌菌株的筛选和液体发酵条件的优化研究，本研究确定了菌株C和菌株E为高漆酶产生菌株。

最佳的液体发酵条件为使用木质素作为碳源，0.5%尿素和0.1%酵母提取物作为氮源，培养基的pH值为5.0，温度为30°C。

目录摘要................................................................................................................................. I Abstract.......................................................................................................................................... II 前言 . (1)1材料与方法 (2)1.1实验材料与方法 (2)1.2 培养基 (3)1.3 实验方法 (3)1.3.1 产漆酶菌株的筛选 (3)1.3.2 漆酶液态发酵及其制备 (3)2 漆酶酶活性的测定 (4)2.1 ABTS-分光光度计法 (4)2.2 分光光度法具体步骤 (4)2.3酶活性的计算 (4)3 菌株的活化 (4)3.1 培养基及主要试剂的配置 (4)3.2 菌种活化步骤 (5)4 改良CTAB法提取待测菌株全基因组 (5)4.1 基因组提取 (5)5 结果与分析 (6)6 讨论和小结 (9)1. 讨论 (9)2. 小结 (9)参考文献 (10)致谢 (11)摘要本实验从南昌农药厂土壤中分离筛选出一株能够产漆酶活性的细菌菌株，并初步分析和鉴定了该菌株。

此菌株具有生长快速、遗传稳定、菌落规则的特性。

为了从土壤中筛选产漆酶酶活相对较高的菌株，采用以愈创木酚为底物，利用平板筛选法和定性测定酶活力法筛选得到高产漆酶菌株。

以ABTS〔2,2’-连氮基-双（3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸）〕为底物测定漆酶活得到产漆酶活性的菌株，菌株的产酶高峰期出现在发酵培养基培养后的第6天，最高的产漆酶活为5.33U。

通过测序和序列比对得到此菌株为溶血葡萄球菌JCSC1435（hemolytic Staphylococcus JCSC1435）。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究一、绪论漆酶是一种广泛存在于自然界中的酶，具有重要的工业应用价值。

在油漆等化工行业中，漆酶可以加速有机溶剂和有机物的降解，具有分解污染物、提高涂料质量等重要作用。

对于产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究具有重要的意义。

二、产漆酶菌株的筛选为了筛选出产漆酶的菌株，我们采用了固体培养的方法。

从土壤、水体等环境样品中采集菌株，然后将其进行分离纯化。

在培养基中，我们添加了有机溶剂作为唤醒剂，以刺激菌株产生漆酶。

接着，通过平板筛选法，筛选出产漆酶活性高的菌株。

用甲基橙为指示剂进行酶活性测试，并通过测定橙色环的直径来评价菌株的漆酶活性。

三、产漆酶菌株的鉴定对于筛选出的产漆酶菌株，我们进行了鉴定工作。

采用形态学观察的方法，观察菌株的形态特征，如菌落形状、色泽、边缘和胞外酶的生成情况等。

接着，通过生理生化试验，检测菌株对不同营养物质的利用情况，并对其产生的酶活性进行测定。

通过16S rRNA基因序列分析，确定菌株的种属。

四、产漆酶细菌的固体发酵条件研究为了提高漆酶的产量，我们进行了固体发酵条件的研究。

我们优化了基础培养基的配方，确定了最适合菌株生长的基础培养基组成。

接着，通过单因素实验和正交实验，优化了培养条件，包括发酵温度、pH值、初始菌量、发酵时间等。

通过对发酵产物的酶活性进行测定，确定了最佳的固体发酵条件。

五、结论通过筛选鉴定和固体发酵条件的研究，我们成功地获得了一株高产漆酶的细菌菌株，并确定了最佳的固体发酵条件。

这为产漆酶的工业化生产提供了重要的理论基础和技术支持，具有重要的应用价值。

我们的研究结果对于深入了解漆酶的产生机制、酶的结构和功能，以及漆酶的应用研究也具有重要的参考意义。