下一代测序技术的内容概览高通量DNA测序技术（下一代测序技术NGS）在过去的15年里已经有了快速的发展，新的方法也在继续实现商业化。
随着技术的发展，对基础和应用科学中的相关应用范围也在增加。
这篇综述的目的是提供一个对NGS方法论的概述以及相关的应用。
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方法的建立DNA测序方法的建立是Sanger双脱氧合成法以及Maxam-Gilbert的化学裂解法。
Maxam-Gilbert化学裂解法是基于DNA的化学修饰然后在邻近修饰过的核苷酸附件的位点进一步裂解DNA骨架。
Sanger测序采用了特殊的链终止核苷酸（双脱氧核苷酸），它缺少一个3‘OH连接位点。
因此，不能够在DNA聚合酶的作用下合成磷酸二酯键，结果是正在伸长的DNA链在该位置终止了。
双脱氧核苷酸是具有放射性的或者具有荧光标记的，便于分别在测序凝胶或者自动测序仪器上识别。
尽管原始的Maxam-Gilbert方法的化学特性已经被进行修饰来帮助消除有毒性的反应物，但是Sanger测序通过合成双脱氧核苷酸的方法已经变成了一种测序的标准。
Sanger测序法在1977年被创建，并且在UNIT7.4中被详尽的描述了。
尽管通过当前NGS 标准测序相对较慢，但是在Sanger末端终止法的改进，自动化，以及商业化这些方面已经使它能够在当前的多种应用范围中成为最适当的测序方法。
特别的，超薄的凝胶板电泳已经被多通道毛细血管电泳代替了，逐渐还出现了自动填充可循环的毛细血管以及电动样品加样，这对提高Sanger测序过程的速度与便利性有很大的贡献。
在Sanger测序中已经出现的最显著的创新点有：（1）荧光染色的发展，（2）采用末端循环测序降低所要求的输入DNA的质量并且用耐热聚合酶高效准确的将终止物染色与正在伸长的DNA链结合起来，（3）解释和分析序列软件的发展。
在自动化的Sanger测序项目中的主导者是Applied Biosystem（AB）。
当前商业化的AB测序仪全部使用的是荧光染色和毛细管电泳（CE）。
用于DNA测序或者片段分析协议的机器的容量在发生改变，4组毛细血管（SeqStudio Genetic Analyzer），8到24组毛细管（3500 Series Genetic Analyzer），以及48到96组（3700 Series Genetic Analyzer）。
所以的这些测序仪产生了600-1000个碱基的正确的序列。
尽管多年以来，不同种类基于Sanger测序的测序仪器已经被引进，包括来自Licor，Amersham，MilliGen，Perkin Elmer 和Dupont，所以的这些除了AB仪器都已经被停产了。
Sanger测序技术在一些应用中任然非常有用，而这些应用中高通量测序是不被要求的。
一些DNA测序的核心设备和以测序来获利的公司提供了Sanger测序服务。
对于个体测序反应对公共的用法是在一个特殊的模板上用特殊的DNA引物，例如去检验质粒的构建和PCR 产物。
既然来自大量的商家的用于DNA纯化的分子生物试剂盒和试剂以及相对较高质量的合成产物都是可用的，这就使得甚至是相对较大的Sanger测序项目都能够在合理的时间框架和成本范围内完成。
除了检测DNA的序列AB仪器上的毛细管电泳（CE）还被应用到测量酶对基于荧光标记的DNA底物的选择活性，列如，可以分析DNA片段的大小。
毛细管电泳同样能够用来同时分析一个单反应中的多个底物，产物或者反应介质，通过不同的荧光标记。
CE被用在DNA 聚合酶和DNA连接酶动力学，以及包括冈崎片段和核糖核苷酸的删除修复的偶联酶通路的研究中。
AB CE在在糖生物学中也是很有用的，可以用来分析荧光标记的多糖。
第二代测序方法术语“下一代”隐含着DNA测序技术发展的下一步，同时也表明将会产生一个以下一代命名的新技术。
我们更喜欢用下一代，第三代等这些术语，因为我们意识到上述的自动化的AB测序技术才是继采用放射性和凝胶板的Sanger测序技术之后的第二代测序技术。
假定这个命名的保守性，对大基因组的高通量测序的低成本要求激发了一些第二代或者下一代测序技术的发展，这些技术除了采用自动化的Sanger测序之外，还用了大量的创新方法。
由于自动化Sanger测序技术的商业化的实现，一些技术不再被使用（例如，Solid ，Polinator，Helicos）。
这些第二代测序技术和相关的方法将在下面进行描述。
第二代测序技术能够被划分为两个主要的类别，通过杂交测序以及通过合成测序（SBS）。
SBS方法是Sanger测序的进一步发展，没有双脱氧末端，结合了重复循环合成，成像以及不断将核苷酸加入到伸长链中的方法。
第一映像，这些新的方法可能会非常昂贵，但是这些反应的同时进行都是以纳升、微升或者公升的体积在很小的空间内进行的，因此花在每个碱基测序上的成本是微不足道的。
持续的精炼和缩小将进一步降低成本。
关于成本要注意的一点是：测序完成的成本是多样化的，一些可能会忽视常规估计的每个“每个碱基的成本”。
试剂成本通常取决于规定的容量，并且通常是与商家协商好的。
例如，核心机构和测序中心会规定大量的测序会获得折扣价。
成本通常不会包含劳动力和最后过程的生物信息分析。
然而，一千美元就能测人类基因组这个目标或者降低每个碱基的成本是测序技术和研究机构要面对的黄金标准。
通过杂交测序这个方法首先在1980年被发展起来，将已知序列的DNA的寡核苷酸放在过滤器上，然后与需要测序的DNA的标记片段进行杂交。
通过重复杂交然后洗掉不是我们需要的未杂交的DNA，这个步骤可能是要确定杂交标记的片段是否与过滤膜上的DNA探针序列相匹配。
基于来自于探针杂交点的重叠信息，因此它可以用来构建更大的连续序列的信息。
通过杂交进行的测序被很大程度上投入到技术中，而这些技术主要依靠于采用特殊的探针去审核序列，例如在医疗诊断方面的应用—在特殊的基因中识别与疾病相关的SNP（单核苷酸多样性）或者是识别染色体畸变（染色体重排，缺失，加倍，拷贝数变异（CNV））。
通过合成进行的测序（SBS）SBS已经采取了一些不同的方法。
第二代测序的方法通常采用一个固体的支持物来容纳微管道或者槽穴，在这些微管道（槽穴）中进行测序反应的发生。
通常，大部分新的SBS 方法不会用双脱氧末端终止法，尽管在一些技术中也用到了可逆的终止末端，它能够允许在对加入的核苷酸进行成像的时候，核苷酸并入反应能够正常进行，然后将在标记核苷酸上合成的封锁基团移除，从而允许下一个碱基能够加入到序列中。
当前的SBS方法不同于原始的Sanger测序的方面主要是它们依赖于大量更短的序列（当前的片段大约是300到500bp）。
进一步，他们相比较于Sange测序来说具有本质上的gao 错误率，并且，在识别一致序列的基础上，它们依赖于较高序列覆盖达到百万或者百亿的短的DNA测序片段（大规模平行的测序）作为获得正确测序的方式。
然而，对于一些技术来说，测序背景错误的发生不是总能够通过增加片段的数量来更正的。
例如，当DNA包含同一个碱基的连续重复（如AAAAAAAA）时发生的均聚物序列。
在这种情况下，测序平台在正确确认一致碱基的数目的时候就受到了限制。
每个平台都会产生它自己独特的一系列潜在的测序背景错误，用户们需要意识到这些局限性。
同时采用一些配备了不同技术的平台通常被用来避免这些问题。
长序列片段到短序列的转变的技术现在又朝着产生长原始序列的技术发展，在保持这些技术的大规模平行测序的同时。
这正在第三代测序技术中发生，尤其是第四代测序技术，将在下面进行描述。
这一部分是由于每个反应的成本，也有一部原因是我们想要获得尽可能长的原始序列来避免测序背景错误，如重复的DNA原件。
大部分的SBS技术采用的方法是将要进行测序的单个DNA分子分散在上百万个分离的小井或者槽穴中，或者将其固定在固体支持物的特定位置上。
DNA分子通过PCR扩增或者通过改良的“滚圈”放大的方法进行扩增，然后用标记过的核苷酸进行合成反应，或者进行基于一个特定核苷酸加入的化学反应，这些核苷酸都是可以进行成像或者能被检测的。
大量的创新技术已经被创造出来使得上百万的DNA测序片段只在一个简单的测序过程中就行产生。
测序的过程根据通量可能会持续数小时或者几天。
454 焦磷酸测序尽管已经被淘汰了，我们依然将这个技术当做第一种出现在市场上并且采用新技术的二代测序的方法，名义上，我们叫做焦磷酸检测，它是一种核苷酸插入的副产物，用来检测特定的碱基是否被插入到正在伸长的DNA链中。
单独的DNA片段，长度为400到700bp，被固定在特定的转接器上，然后在在一个独立的乳状液滴中进行PCR反应。
（emPCR）。
珠子上的DNA序列与在转换器上的DNA序列互补，能够允许DNA片段直接结合到珠子上，理想的情况下，一个珠子上只有一个片段。
DNA合成之后紧接着进行DNA合成反应的化学检测，化学反应发生在以微升计量的小槽穴中，焦磷酸被释放之后就可以在里面检测到。
通过不断的用包含有四种核苷酸中的一种的测序试剂流过小槽穴，当正确的核苷酸被插入到合成的链中时，通过光发生反应就可以检测到焦磷酸的释放。
光的强度同样提供了包含测序过程中出现的均聚物的信息，尽管在遇到大量同一种核苷酸测序会有一些困难。
焦磷酸测序是在瑞典由焦磷酸测序AB发展起来的，并且随后被Qiagen获得，Qiagen在454生命科学上获得许可证，而在此之前它是属于Roche 的。
454测序仪在2013年停产了，尽管来自于一些供应商的实际还是可以继续使用的。
454测序仪通常被用来进行基因组测序和宏基因组样本测序，因为它能够获得较长的测序片段（600到800bp）并且通量相对较高（2500万碱基，四小时一个循环，正确率达99%或者更高），促进基因组的组装。
Ion Torrent （离子激流测序仪）离子激流测序仪在一个半导体芯片上直接将核苷酸序列转变为数字信息。
在一个DNA 合成反应中，在一正在伸长的DNA链上，当一个正确的核苷酸被插入到与她互补的碱基的对面时，一个氢离子就会被释放。
这改变了溶液的pH值，而pH值的改变可以被离子感受器记录为电压的改变，这更像是pH的测量。
如果没有核苷酸被插入，就不会有电压峰值产生。
使只含有四种核苷酸中的一种的测序试剂持续地流过并小槽穴，然后在洗掉，当合适的核苷酸被插入的时候，电压就会发生改变。
当连个相邻的核苷酸插入同样的核苷酸的时候，两个氢离子会被同时释放，电压的改变就加倍。
因此，一个种单核苷酸链的测序也可以被确定。
然而，同一核苷酸组成的较大的均聚物链有时是很难被识别到的。
离子激流测序反应发生在上百万个小槽穴里，上面覆盖有一个包含百万像素的半导体芯片，它能将化学信号转变为序列信息。
