食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定1范围本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准第一法为微生物法，适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总量的测定；第二法为高效液相色谱法，适用于含量较高或强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。
第一法微生物法2原理烟酸是植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（A TCC 8014）生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将植物乳杆菌液接种至添加试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率，根据烟酸含量与透光率的标准曲线计算出试样中烟酸的含量。
3试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
培养基可购买符合测试要求的商品化培养基。
3.1试剂3.1.1盐酸（HCl）。
3.1.2氢氧化钠（NaOH）。
3.1.3氯化钠（NaCl）。
3.1.4浓硫酸（H2SO4）。
3.1.5溴麝香草酚蓝（C27H28Br2O5S）：pH指示剂。
3.1.6乙醇（C2H5OH）。
3.2试剂配制3.2.1盐酸溶液（1 mol/L）：用量筒量取吸取83 mL盐酸，于1000 mL烧杯中，加917mL 水，混匀。
3.2.2盐酸溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.1盐酸溶液10mL，加水溶解至100mL。
3.2.3氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠于1000 mL烧杯中，加水溶解并稀释至1000 mL，混匀。
3.2.4氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：吸取3.2.3氢氧化钠溶液10mL，加水溶解至100mL。
3.2.5生理盐水（0.9%）：称取9g氯化钠（NaCl），溶解于1000ml水中，分装10mL于试管中，121℃灭菌15min，备用。
3.2.6乙醇溶液（25%）：量取200 mL无水乙醇与800 mL水混匀。
3.2.7硫酸溶液（1 mol/L）：于2000mL烧杯中先注入700mL水，用量筒量取56mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒入水中，用水稀释到1000mL。
3.3培养基3.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。
3.3.2乳酸杆菌肉汤培养基：称取光解胨15g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，于1000 mL烧杯中，加入番茄汁100mL，加900mL蒸馏水溶解，混匀，调pH6.8±0.2（25℃），分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。
3.3.3烟酸测定用培养基：维生素测定用酪蛋白氨基酸12g，葡萄糖40g，乙酸钠20g，L-胱氨酸0.4g，DL-色氨酸0.2g，盐酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素200μg，泛酸钙200μg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素400μg，p-氨基苯甲酸100μg，生物素0.8μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg。
加蒸馏水至1000mL，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（3.2.4）调pH至6.7±0.2（20℃~25℃）。
注：自行配制烟酸测定培养基时，所有试剂不得含有烟酸。
3.4标准品3.4.1（C19H19N7O6）：纯度≥99 .5%。
3.5标准溶液的配制3.5.1烟酸标准储备液（0.1mg/mL）：精确称取50.0 mg烟酸标准品，用乙醇溶液（3.2.5）溶解并移至500 mL容量瓶中，定容，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于100μg烟酸。
3.5.2烟酸标准中间液（10μg/mL）：准确吸取10.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于10μg烟酸。
3.5.3烟酸标准中间液（1μg/mL）：准确吸取1.0mL 烟酸标准储备液（3.5.1）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于1μg烟酸。
3.5.4烟酸标准工作液（100ng/mL）：准确吸取5.00 mL烟酸标准中间液（3.2.2）置于50 mL 容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于100ng烟酸。
3.5.5烟酸标准工作液（40ng/mL）：准确吸取0.4mL 烟酸标准中间液（3.5.2）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙醇溶液（3.2.5）稀释并定容至刻度，混匀于2℃～4℃冷藏。
此溶液每mL相当于40ng烟酸。
4仪器和设备4.1天平：感量分别为0.1g和0.1 mg。
4.2均质设备：用于试样的均质化。
4.3恒温培养箱：36℃±1℃。
4.4漩涡振荡器。
4.5压力蒸汽消毒器：121℃(0.10 mPa～0.12 mPa)。
4.6离心机：转速≥2000 rpm。
4.7pH计：精度±0.01。
4.8分光光度计。
4.9超净工作台。
4.10超声波振荡器。
4.11微孔板酶标仪5菌种的制备与保存5.1菌种：植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）。
5.2储备菌种的制备将菌种植物乳杆菌Lactobacillμs plantarμm（ATCC 8014）转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h，取出后放入2℃～4℃冰箱中保存。
每月至少传种一次，作为储备菌株保存。
实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，在36℃±1℃恒温培养箱中培养20 h～24 h以活化菌株，用于接种液的制备。
保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2~3 代以保证菌株活力。
5.3接种液的制备试验前一天，从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基（3.3.2）中，于36℃±1℃恒温培养箱中培养6 ~18h。
在无菌条件下离心该培养液15min，倾去上清液。
加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3）重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混合均匀，离心15min，倾去上清液。
重复离心和清洗步骤三次。
以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水（3.1.3），使其充分混合均匀制成混悬液，备用。
用721分光光度计，在550nm波长下，以0.9％生理盐水为参比，读取该菌悬液的浊度值透光值（％T），用0.9％生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值，使其范围在60~80％之间。
立即使用。
6试管法所有操作均需避光进行。
6.1试样制备谷薯类、豆类、坚果（去壳）等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3 mm～0.5 mm)；乳粉、米粉等试样混均；肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。
4℃冰箱保存，1周内测定。
6.2试样提取准确称取约含烟酸0.1mg的试样，一般乳类、新鲜果蔬试样2 g～5 g（精确至0.0001g）；谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2 g～1 g（精确至0.0001g），液态试样5g；乳粉、米粉等准确称取适量试样2 g（精确至0.0001g）；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1 g~0.5 g；食品0.2 g~1 g；液体饮料或流质、半流质试样5 g~10 g于100 mL锥形瓶中，加入硫酸溶液（3.2.6），加入被检验物质干重10倍的硫酸溶液（3.2.6）。
在121℃下，水解30min后冷却至室温。
用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（3.2.4）调pH至6.0~6.5，再用0.1 mol/L 盐酸调pH至4.5±0.1(3.2.2)，用水定容至100mL，用无灰滤纸过滤，滤液备用。
6.3稀释根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(f)，使稀释后试样提取液中烟酸含量在50.0 ng ~500.0 ng 范围内。
6.4测定系列管制备6.4.1标准系列管取试管分别加入烟酸标准工作液0.00 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.00mL，补水至5.0 mL，相当于标准系列管中烟酸含量为0. 0 ng、50 ng、100 ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400 ng、500 ng。
加5.0 mL烟酸测定用培养基，见表1。
混匀。
每个标准点应制备3管。
表1标准曲线管的制作*试管No.1－2中不添加标准溶液；2中滴加菌液；No.3－10中添加标准品溶液的浓度依次增高。
3个重复。
6.4.2试样系列管取4支试管，分别加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL试样提取液，补水至5.0 mL，加入5.0 mL 烟酸测定用培养液，见表2。
混匀，每个浓度做3个重复。
表2试样管的制作6.4.3 灭菌：将所有的标准系列管和试样系列管测定管塞好棉塞，于121℃(0.10～0.12 mPa)高压灭菌5 min 。
灭菌完成后，迅速冷却，备用。
6.5 培养6.5.1 接种：在无菌操作条件下，将接种液转入无菌针管，向每支测定管接种一滴。
6.5.2 培养：将加完菌液的试管置于36℃±1℃恒温培养箱中培养16h ～24h ，直至获得最大混浊度，即再培养2 h 透光率无明显变化。
另准备一支标准0管（含0.0 ng 烟酸）不接种作为0对照管。
6.6 透光率的测定用厚度为1 cm 比色杯，在波长550 nm 条件下读取透光值，将培养好的测定管用漩涡混匀器混匀。
以未接种0对照管调节透光率为100%，然后依次测定标准系列管、试样系列管的透光率。
如果0对照管有明显的细菌增长；或与0对照管相比，标准管透光率在90%以下，、说明可能有杂菌或不明来源烟酸混入，需重做实验。
取出最高浓度标准曲线管振荡5s ，测定透光值，放回重新培养。
2h 后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。
6.7 标准曲线的绘制以标准系列管烟酸含量为横坐标，透光率为纵坐标，绘制标准曲线，也可对各个标准点做拟合曲线。
各个标准点3管之间的透光率的相对标准偏差应小于10%，如果某一标准点3支试样管中有2支烟酸含量落在50 ng ～500 ng 范围内，且该两管之间折合为每mL 试样提取液中烟酸含量的偏差小于10%，则该结果可用，如果3支试样管中烟酸含量的相对标准偏差大于10%，则该点舍去，不参与标准曲线的绘制。
