一、基因工程的基本操作程序(阅读教材P8)目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
二、目的基因的获取(阅读教材P8～11) 1．目的基因主要是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2．获取目的基因的依据基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体上的位置，基因的转录产物mRNA ，基因的表达产物蛋白质。
3．目的基因的获取方法(1)从基因文库中获取目的基因①基因文库含义：将含有某种生物不同基因的许多 DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
②基因文库种类⎩⎪⎨⎪⎧基因组文库：含有一种生物的所有基因部分基因文库：含有一种生物的部分基因， 如cDNA 文库(2)利用PCR 技术扩增目的基因①PCR 技术全称是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。
②原理：DNA 双链复制。
③扩增过程变性：目的基因DNA 受热变性后解链为单链 ↓复性：引物与单链相应互补序列结合 ↓延伸：在DNA 聚合酶作用下延伸子链(3)人工合成法：适于合成基因较小，且核苷酸序列已知的目的基因。
三、基因表达载体的构建——基因工程的核心(阅读教材P11)1．基因表达载体的组成 (1)目的基因。
(2)启动子⎩⎪⎨⎪⎧位置：基因的首端功能：是RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA(3)终止子⎩⎪⎨⎪⎧位置：基因的尾端功能：终止转录(4)标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
2.基因表达载体的功能(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
四、将目的基因导入受体细胞(阅读教材P11～13)1．转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．导入不同类型生物细胞的方法 (1)导入植物细胞①方法⎩⎪⎨⎪⎧农杆菌转化法：适用于双子叶植物和裸子植物基因枪法：适用于单子叶植物花粉管通道法②受体细胞：植物体细胞。
(2)导入动物细胞⎩⎪⎨⎪⎧①方法：显微注射技术②常用受体细胞：受精卵(3)导入微生物细胞 ①方法：用 Ca 2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
②受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌细胞)。
③原核生物的特点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等。
五、目的基因的检测与鉴定(阅读教材P13～15)1．分子水平上的检测与鉴定(1)DNA 分子杂交技术⎩⎪⎨⎪⎧①检测转基因生物染色体上的目的基因②检测目的基因是否转录出mRNA(2)抗原—抗体杂交技术：用于检测目的基因是否翻译出蛋白质。
2．个体生物学水平上的检测与鉴定如一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验。
[共研探究]1．目的基因的获取获取目的基因是实施基因工程的第一步，随着科学技术的发展，目前获取目的基因的常用方法有以下几种。
阅读教材相关内容，结合提供的资料，完成下面的思考。
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
(2)目的基因的获取方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增和人工合成三种。
①直接分离：从自然界中已有的物种中分离，如从基因文库中获取。
a．基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
c.基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库只含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库。
②人工合成法：如果基因较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
人工合成包括利用DNA进行化学合成和反转录法。
③利用PCR技术扩增目的基因的条件、过程a．原理：DNA复制。
b．前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
c．条件：DNA模板、引物、热稳定DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
d．过程：[总结升华][对点演练]1．下列不属于获取目的基因的方法是( ) A ．利用DNA 连接酶复制目的基因 B ．反转录法C ．从基因文库中获取目的基因D ．利用PCR 技术扩增目的基因 解析：选A 对目的基因(DNA 片段)进行复制需利用DNA 聚合酶而不是DNA 连接酶。
[共研探究]1．基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
依图填空，并回答有关问题。
(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)构建基因表达载体的过程：目的基因与载体结合的过程，实质上是不同来源的DNA 重新组合的过程。
其过程如下：(3)启动子和终止子与起始密码子和终止密码子相同吗？提示：不相同，启动子和终止子位于DNA 上，是基因表达必需的部分。
起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
(4)基因表达载体的构建需要限制酶、DNA连接酶。
【归纳拓展】真核细胞基因结构(1)结构：①编码区：内含子、外显子；②非编码区：启动子、终止子。
基因结构如图所示：(2)表达：只有编码区能转录生成RNA，且内含子转录的部分要剪切掉，即转录生成的mRNA只有外显子的对应部分。
因此，以mRNA为模板，反转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。
2．将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
结合图1、图2、图3，根据教材相关内容完成下列思考。
(1)结合图示理解农杆菌转化法的过程(3)为什么植物的体细胞可以作为受体细胞，而动物的体细胞不能作为受体细胞？提示：植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体；动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体，因此动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
(4)从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？提示：不可以。
因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
[总结升华]【易错易混】(1)构建基因表达载体①用同一种限制酶切割质粒和目的基因，以获得互补的黏性末端，利于重组质粒的构建。
②插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前须有启动子，后须有终止子。
③终止子是DNA分子上决定转录停止的DNA序列；终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基。
(2)农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入。
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒上T－DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA进入受体细胞。
[对点演练]2．如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是()A．基因工程的核心步骤是基因表达载体构建B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因解析：选B由于受体细胞有植物、动物和微生物，所以目的基因导入受体细胞的方式不同，因此，基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的。
3．科学家通过基因工程的方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。
其过程大致如图所示，请分析回答：(1)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA 中是利用T－DNA____________的特点。
(2)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________。
(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是________________。
解析：(1)Ti质粒的最大优点是能将目的基因导入受体细胞的染色体DNA中，从而使目的基因在棉花体内稳定维持和表达。
(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。
(3)将目的基因导入植物细胞方法很多，以农杆菌中的Ti质粒为目的基因载体的称为农杆菌转化法。
答案：(1)可转移至受体细胞并且融合到受体细胞染色体DNA上(2)转化(3)农杆菌转化法[共研探究]目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否做成功的一步。
结合下述材料，完成探究。
1．目的基因的检测(分子水平检测)(1)从图中分析可得检测目的基因的方法为DNA分子杂交技术，其原理是采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；若没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
(2)分子检测的方法①DNA和DNA分子之间的杂交。
目的基因是否融合到受体生物的染色体DNA中，这是真核生物中的目的基因可否稳定存在和遗传的关键。
要验证这一点，就需要通过DNA和DNA分子间的杂交技术。
主要做法是用放射性同位素标记目的基因DNA片段作探针，以此检测受体细胞的DNA中有无目的基因。
②DNA和RNA分子之间的杂交。
它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法是从转基因生物中提取mRNA，用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA，意味着目的基因开始发挥功能。
③蛋白质分子(抗原—抗体)之间的杂交。
具体做法是：用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达出了蛋白质。
2．鉴定(个体生物学水平鉴定)观察图示，判断抗虫棉的接种实验属于个体生物学水平鉴定，通过做抗虫(或抗病)的接种实验以确定是否具有抗性及抗性的程度。
还可对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。
3．应用(1)检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
如果棉铃虫死亡，说明抗虫基因已经表达；否则，目的基因没有表达。
(2)DNA分子杂交的原理是碱基互补配对原则。
DNA分子杂交可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系鉴定等。
