微分脉冲极法测定果汁中维生素c的含量

实验三 果蔬中维生素C的定量测定（紫外法）

（4学时）

一、实验目的

1. 学习用铜离子氧化法测定维生素C（Vc）（紫外法）；

2. 了解Vc定量测定的其他方法，如：磷钼酸比色法、碘量法、2,6-二氯酚靛酚滴定法（近年来用全自动电位滴定仪进行电位滴定）、紫外法、2,4-二硝基苯肼测定总抗坏血酸量、高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光法、Flinb近红外分光光度法等。

二、实验原理

抗坏血酸在波长243～267nm处有较高的吸收值，但在样品成分比较复杂时，因有强烈的背景吸收而不适宜用紫外法测定其Vc含量。用碱加热法等处理法都存在试剂较贵、操作复杂、时问长等一系列问题而不能广泛应用。利用铜离子消除背景误差，能直接测定一些水果蔬菜样品中的Vc含量而不需要进行前处理，操作简单干扰少。

附加说明：在测定Vc的国标方法中，荧光法为测定食物中Vc含量的第一标准方法，2,4-二硝基苯肼法作为第二法。

三、实验器材与试剂

实验材料

桔子

实验器材

紫外/可见分光光度计；涡旋混合仪；高速冷冻离心机；榨汁器；电热恒温水浴锅；试管与试管架；胶头器长滴管及移液管；250mL烧杯等。

实验试剂

1. 120μg/mL Vc贮液：120mg Vc，加适量蒸馏水溶解，然后用1000毫升容量瓶定容。存4℃备用。

2. 5μg/mL的铜离子溶液：①先配成1000μg/mL的硫酸铜溶液；②取上述硫酸铜溶液5mL，加入1mol/L的醋酸溶液7mL及1mol/L醋酸钠200mL，用蒸馏水定容。③5×104mol/L的EDTA溶液：36.5mgEDTA溶于适量蒸馏水，250 mL馏水定容。④铜离子-EDTA混合液（6.2×105mol/L）：使用前将上述铜离子溶液和EDTA以4:1（v/v）混合而成（现用现配）。

四、实验步骤

1. 标准曲线制作

取12支试管（大试管）分成2组，按下表进行操作。维生素C溶液浓度为120μg/mL。

HENAN NONGYE37河南农业2023年第25期苹果维生素C含量几种测定方法比较确山县农业综合行政执法大队 连敏 王勇

维生素C普遍存在于植物体内，在植物的多个生理代谢活动中发挥着非常重要的作用。在对植物的研究中发现，植物体内维生素C含量越高，其抗逆性越强。同时，维生素C具有抗氧化、防止衰老等功效。但是，人类本身缺少维生素C，人体内生物合成代谢途径中的一种关键酶无法合成人体所需的维生素C，因此，人们身体所需的维生素C只能从新鲜的水果或蔬菜中获取。 苹果富含维生素C、果胶、有机酸、膳食纤维和矿物质等营养物质，是老少皆宜的大众水果。鉴于苹果产业的健康发展及维生素C对动植物必不可少的作用，筛选苹果中维生素C含量测定方法就显得尤为重要。维生素C具有氧化性和还原性，在苹果果实中维生素C具有很强的还原性，苹果切开后，维生素C在空气中很不稳定，容易氧化。维生素C的检测方法有很多，如滴定法、荧光分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等，本文对这几种常用的检测方法进行比较分析，筛选出一种适合苹果维生素C含量测定的方法。一、维生素C测定方法（一）滴定法测定维生素C滴定法测定苹果中维生素C所用药品和仪器均较少，操作过程需要对每个苹果样品进行过滤后滴定，比较费时，维生素C在空气中暴露时间久了容易被氧化，测定的结果易偏低。该方法可以对苹果中维生素C中含量进行简单的相对比较，不能准确测定苹果中维生素C的含量。取苹果果肉于液氮中速冻，样品在液氮中研磨成粉末，再将样品融入2%的草酸中，充分混匀避光放置30 min后过滤，滤液便可进行滴定。样品设置3次重复。由于维生素C具有还原性，蓝色染料2,6-二氯酚靛酚具有氧化性，并且该染料在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。滴定过程中当样品溶液中维生素C被完全氧化后该染料在草酸溶液中便会呈现出红色。根据滴定草酸样品所用的蓝色染料2,6-二氯酚靛酚溶液的量，再利用公式便可计算出苹果果肉中维生素C的含量。（二） 荧光分光光度法测定维生素C荧光分光光度法测定苹果果肉中维生素C所用药品和仪器少，但操作步骤较多，测定的准确度比滴定法测定稍微高些。取苹果果肉于液氮中速冻，样品在液氮中研磨成粉末，然后在样品中加入偏磷酸-冰醋酸溶液，充分混匀后加入适量活性炭，剧烈震荡20 min后过滤，取一定量滤液加入定量的硼酸-醋酸钠，充分摇匀后放置10 min，稀释到定量浓度便可作为样品溶液。按照步骤制定维生素C的标准曲线溶液。在样品溶液和标准曲线溶液中分别加入定量的邻苯二胺，混合后避光反应35 min后边便可进行测定。样品设置3次重复。维生素C与活性炭反应，可被氧化成脱氧抗坏血酸，它与邻苯二胺进行反应生成喹喔啉，利用分光光度计在激发波长351 nm和发射波长432 nm处测定喹喔啉的荧光强度。根据公式便可计算出苹果果肉中维生素C的含量。（三）紫外分光光度法测定维生素C紫外分光光度法测定苹果果肉中维生素C时，前面对样品抽提较麻烦，整个操作过程所用药品偏多，该方法测定维生素C时所用到的低温离心机和进口酶标仪价格较高。因为前面操作步骤比较烦琐，维生素C容易被氧化，所以测定苹果果肉中维生素C含量不是很准确。紫外分光光度法适合大批量测定样品，酶标仪检测灵敏度高、速度快，1次2 min便可检测96个样品。取苹果果肉于液氮中速冻，样品在液氮中研磨成粉末，取一定样品加入提前预冷的HCL溶液进行充分抽提，抽提时间为30 min，且中间需要颠倒混匀5次。样品设置3次重复。然后利用低温离心机进行离心，取一定量的上清液加入NaH2PO4，并用NaOH调试溶液的pH。混匀后取上清液加入一定浓度的NaH2PO4和二硫苏糖醇，在25℃ 条件下黑暗反应30 min。苹果内维生素C分为氧化型和还原型，二硫苏糖醇具有强还原性，能将苹果内氧化型维生素C还原为还原型维生素C，在波长265 nm处便可测定。取一定量前面抽提的上清液加入NaH2PO4，用酶标仪测定吸收波长为265 nm处的值，最后加 AO酶，反应后再测1次数值。样品设置3次重复。根据维生素C标准曲线便可测定出苹果果肉中维生素C的含量。（四）高效液相色谱法测定维生素C高效液相色谱法测定苹果果肉中维生素C时，整个操作步骤相对简单、检测速度也快，测定结果也较准确，但高效液相色谱法所用高效液相色谱仪价格非常高。取苹果果肉于液氮中速冻，样品在液氮中研磨成粉末，取一定样品加入提前预冷的HPO3溶液进行充分抽提，抽提时间30 min，且中间需要颠倒混匀5次。样品设置3次重复。采用低温离心机离心，并用微孔滤膜抽滤上清液进行备用。然后再滤液中加入一定量的二硫苏糖醇，25℃黑暗条件下反应约15 min。苹果果肉经HPO3溶液抽提后，维生素C便可用微孔滤膜分离出来。此时便可用高效液相色谱仪在254 nm处检测其峰值。用高效液相色谱仪在波长为254 nm测出样品溶液中总维生素C含量，流动液相为乙酸缓冲液，测定时流速为 （下转第50页）ZHILIANG ANQUAN质量安全

- 1 - 实 验 报 告

课程名称 仪器分析实验 实验项目微分脉冲极谱法测定果汁中维生素C的含量

实验类型 □验证 □设计 □综合 实验时间 2010 年 4 月 7 日

实验指导老师 实验评分

一、实验目的

1.掌握微分脉冲极谱法的基本原理

2.掌握伏安极谱仪的操作方法

3.学会使用微分脉冲极谱法测定果汁中的维生素C

二、实验原理

脉冲极谱法不仅适用于无机物的定量测定，而且适用于有机物的定量测定。能否可以用记谱法测定水溶性介质中的有机物，与有机物功能团的氧化还原特性有关。功能团很大程度上决定在汞滴电极的电位窗口是否可发生氧化还原反应，是否可通过物质的还原或氧化定量测定。脉冲极谱法测定果汁中维生素C（抗坏血酸）的含量是基于抗坏血酸氧化为脱氧抗坏血酸：

CCHCHCCCH2OOHOHOHOHHOH-2H+-2eCCCCCCH2OOOOOHOHHH

（C6H8O6→C6H6O6+2e+2H+）

该反应的氧化还原电位与pH有关：

2OH3lgC2059.0E

如果缓冲效果不适宜的话，抗坏血酸的氧化会是电极表面的pH移动，从而导致峰形变宽。在实验中选用乙酸缓冲液可以避免此类情况。

- 2 - 三、仪器与试剂

1.仪器： Metrohm 797伏安极谱仪

2.试剂： 1g/L新配的抗坏血酸标准溶液

乙酸缓冲溶液

待测果汁溶液

四、实验内容与步骤

1.接通电源，预热伏安极谱仪。（上一组刚做完，因此不用做此步骤）

2.设置相关参数，将Electrode设为DME（动态滴汞），其它参数因为上一组已经设置好，因此其它参数不用再次设置。

3.取10mL乙酸缓冲液，加入100μL果汁样品溶液，记录样品的测定曲线后，依序两次加入100μL抗坏血酸标准溶液，分别测定峰电流值，利用标准加入发自动计算果汁中维生素C的含量。

科技创新导报2016 NO.16Science and Technology Innovation Herald工业技术

科技创新导报 Science and Technology Innovation Herald41维生素C是人体重要的维生素之一，其参与体内的氧化还原反应、多种羟化反应，有防止贫血的作用，可促进伤口愈合，维持牙齿、骨骼、血管和肌肉的正常功能。人体不能自身制造维生素C，所以人体必须不断地从食物中摄入维生素C。德国营养研究会建议，每人每天应摄取50～100 mg的维生素C。而30 mg的维生素C是人体1 d摄取维生素C的最少值，如果低于30 mg，身体就会缺乏维生素C，使得部分机能无法正常运作，长期以往，甚至出现坏血症。1 实验原理维生素C分子式C6H8O6，在空气中稳定，但在水溶液中易被空气和其他氧化剂氧化，生成脱氢抗坏血酸。分子结构中的烯二醇基具有还原性，可被I2定量地氧化成二酮基，抗坏血酸分子中的烯二醇基被I2完全氧化后，则I2与淀粉指示剂作用而使溶液变蓝，因而可用I2标准溶液直接测定。其滴定反应式如下：C6H8O6＋I2=C6H6O6＋2HI。所以当滴定的溶液出现蓝色时即为终点。2 实验仪器与试剂2.1 仪器50 mL滴定管、滴定管、250 mL锥形瓶、250 mL容量瓶、25 mL移液管、500 mL烧杯、研钵、玻璃棒、电子分析天平等。2.2 试剂2.2.1 K2C2O7标准溶液（约为1/3的1.42×10-2 mol/L）准确称取0.35～0.36 g的K2C2O7基准物质于小烧杯中，加入适量蒸馏水，待其全部溶解后转移至250 mL容量瓶中，定容、摇匀、备用。2.2.2 I2溶液（约为1.42×10-2 mol/L）称取1.8I2和3.5 gKI，置于研钵中加少量水，充分研磨。待I2全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶，加水稀释至500 mL，摇匀，放置暗处保存。2.2.3 Na2S2O3标准溶液(约为2.90×10-2 mol/L)称取3.5 gNa2S2O3·5H2O置于500 mL烧杯中，加入新煮沸冷却的蒸馏水，使其全部溶解，再加入少量的Na2CO3，DOI：10.16660/ki.1674-098X.2016.16.041橙汁饮料中维生素C含量的测定周卓娜（海南省高级技工学校化工部 海南海口 571000）摘 要：维生素C是一种己醛糖，广泛存在于植物组织中，有抗坏血酸的作用，又称抗坏血酸，是水溶性维生素。其增强免疫力、促进胶原蛋白的形成、抗氧化、解毒的功效早已被人们广泛接受，许多饮料、保健品都会贴上含有维生素C的标签。该任务着手于人们日常饮用的橙汁饮料，采用碘量法，以淀粉为指示剂，对市场上销售的某品牌橙汁饮料进行维生素C含量的确定。关键词：橙汁饮料 维生素C 碘量法 淀粉中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1674-098X(2016)06(a)-0041-02