基于毛细管电泳的核酸检测技术研究

毛细管凝胶电泳紫外检测核酸灵敏度连冬生;张相年;贺宝霞;赵树进;韩丽萍【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2010(38)8【摘要】以已知浓度的DNA Marker为标准样品,常规压力进样,电动进样,柱头场放大及联合使用基质场放大和柱头场放大等方法进行CGE-UV分析,对比不同进样方法的检测灵敏度.以聚合酶链式反应(PCR)后的高盐DNA样品验证方法的可靠性.当DNA样品稀释达40万倍,与电动进样和压力进样相比,在对峰形和峰宽无明显影响下,将电动进样的时间延至420 s,三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(TE)浓度降低至1.5%,柱头场放大灵敏度分别提高了约28和90倍;联合使用基质场放大和柱头场放大后,灵敏度分别提高3760和12000倍.DNA的检出限达0.1μg/L(S/N=3,CGE-FASI-UV).同时以本法分析PCR后的DNA产物获得了极高的灵敏度(分别比普通的压力进样和电动进样提高50477倍和33354倍).本实验采用基质场放大和柱头场放大联用,方法操作简单,灵敏度高,适用于高盐微量的DNA样品分析.【总页数】6页(P1161-1166)【作者】连冬生;张相年;贺宝霞;赵树进;韩丽萍【作者单位】广州军区广州总医院药剂科,广州,510010;广州军区广州总医院药剂科,广州,510010;广州军区广州总医院药剂科,广州,510010;广州军区广州总医院药剂科,广州,510010;广州军区广州总医院药剂科,广州,510010【正文语种】中文【相关文献】1.毛细管凝胶电泳分离和检测低聚核苷酸和脱氧核糖核酸的合成产物 [J], 任吉存;黎众魁2.高效毛细管电泳-紫外检测法快速分离测定三种抗肿瘤药物 [J], 李兴华;李甜;段婕;石红梅3.离子液体为背景电解质的毛细管电泳-间接紫外检测法同时测定葡萄酒中无机阴离子和阳离子 [J], 田苗苗; 刘心; 杨丽4.配有固定波长紫外检测器的毛细管电泳仪计量检定问题及分析 [J], 赵新颖;赵少雷;丁晓静;赵海波;林青;袁騉5.反向胶束电动毛细管色谱-直接紫外检测法测定康复新液中氨基酸 [J], 苏慧;周鑫悦;陈莉;赖昕;李琦;余丽双因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

毛细管电泳技术在基因分析中的应用研究前言近年来，科学技术的发展迅猛，其中毛细管电泳技术在基因分析方面的应用日益广泛。

毛细管电泳技术以其高灵敏度、高分辨率、高效能和适用于多样化样品等特点，在DNA测序、基因检测等方面表现出色，成为基因分析研究的重要手段之一。

一、毛细管电泳技术概述毛细管电泳技术是将分离物从毛细管的一端注入，经过电场的作用沿毛细管内壁移动，最终在另一端分离出来的技术。

毛细管电泳技术包括手性毛细管电泳、凝胶毛细管电泳、开放式毛细管电泳、可逆微波加热毛细管电泳等多种方法。

在基因分析方面，凝胶毛细管电泳是比较常见的一种方法，主要通过毛细管内填入凝胶或聚丙烯酰胺等凝胶物质作为固定相来进行分析。

二、毛细管电泳技术在DNA测序中的应用DNA测序是分子生物学中重要的技术，毛细管电泳技术对其有重要的促进作用。

毛细管电泳技术分离范围宽、分辨率高，还可以进行自动化操作。

使用垂直毛细管电泳仪进行DNA测序，可以使多少达到每日3万个样品。

其主要优点是可以通过电泳移动时间确定DNA序列，并且可以自动化进行操作，提高了工作效率和准确度。

三、毛细管电泳技术在基因检测中的应用毛细管电泳技术在基因检测方面的应用非常广泛，其检测方法简便、鉴定准确、速度快等特点受到广泛关注。

在基因检测方面，毛细管电泳技术的应用范围很广，在遗传病、肿瘤基因、传染病等方面都可使用。

常见的应用包括RFLP法、SSCP法、PCR-SSCP法、PCR-RFLP法等等，还可以结合DNA芯片技术实现高通量检测。

四、毛细管电泳技术在其他领域中的应用毛细管电泳技术不仅在基因分析领域中有广泛应用，也被应用在药物代谢学、生物化学、环境科学等领域。

例如毛细管电泳技术可以用于药物分析中的手性分离、环境监测中的污染物检测、食品安全领域中的食品检测等。

结语毛细管电泳技术在基因分析中的应用是当今生命科学领域研究的重要手段之一。

毛细管电泳技术具有高灵敏度、高分辨率、高效能及适用于多样化样品等特点，使之成为当前研究中的一项重要工具。

毛细管电泳仪核酸分离分析毛细管电泳仪核酸分离分析是一种广泛应用于生物技术和生物医学研究领域的分析方法。

它通过将DNA、RNA或其他核酸样品注入到毛细管中，利用电场的作用使核酸在毛细管内迁移，在电泳分离过程中根据核酸分子的大小、电荷和构象差异，实现对核酸样品的分离和定量分析。

本文将从毛细管电泳仪的原理、实验操作和应用领域三个方面展开介绍。

一、毛细管电泳仪的原理毛细管电泳仪是以电泳为基础的仪器设备，主要由高压电源、注射器、分离柱、检测器和数据处理系统等组成。

核酸样品首先通过注射器被导入到毛细管内，然后通过电场力将核酸分子在毛细管内迁移。

毛细管内的分离柱起到了筛选和分离核酸的作用，不同长度或不同带电性质的核酸分子将被分离开来。

分离完成后，检测器会检测样品，根据检测信号进行数据处理和分析。

二、毛细管电泳仪的实验操作1. 样品制备：将待测核酸样品提取并纯化，测定浓度和纯度。

2. 缓冲液的配制：根据实验需要选择合适的缓冲液，调节缓冲液的pH值和离子强度，以优化分离效果。

3. 毛细管的选择：根据样品特性和分离目标，选择合适的毛细管材料、内径和长度。

4. 样品注入：使用专用注射器将核酸样品注入到毛细管中。

5. 分离条件设置：根据样品的性质和实验需要，设置适当的分离电压、电流和温度等条件。

6. 分析与结果解读：根据检测器所得到的信号，进行数据处理和结果解读。

三、毛细管电泳仪的应用领域毛细管电泳仪核酸分离分析广泛应用于生命科学研究、医药领域以及法医学等领域。

具体应用包括但不限于以下几个方面：1. 生物医学研究：在基因工程、遗传学、分子生物学等领域中，毛细管电泳仪被广泛应用于核酸样品的分离、纯化和测序等方面。

2. 临床诊断：毛细管电泳仪可用于检测和分析人体内的基因突变、染色体异常等，对临床疾病的诊断、预测和治疗具有重要意义。

3. 食品安全监测：毛细管电泳仪可以对食品中的转基因成分、有害物质和添加剂等进行快速准确的分析，为食品安全监测提供科学依据。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011585310.6(22)申请日 2020.12.28(71)申请人 北京思尔成生物技术有限公司地址 100176 北京市大兴区经济技术开发区经海四路156号院11号楼4层401室(72)发明人 刘金超　刘孔尚　刘明坤　叶锋　(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 白艳(51)Int.Cl.C12Q 1/6827(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法(57)摘要本发明公开了基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法。

本发明提供了一种检测多个融合基因的试剂盒，包括多对扩增引物对；每对所述扩增引物由引物A和引物B组成；所述引物A从5'端起依次由用于结合测序引物的接头序列A和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列A；所述引物B从5'端起依次由用于调整扩增产物长度的接头序列B和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列B；所述引物A的5’端修饰荧光基团。

本发明通过将毛细管电泳片段分析和一代测序相结合，实现了基于融合基因核酸的多重检测和序列的同步获取，使得在进行基于片段分析的多重检测的同时，对于阳性融合基因进行一代测序获取其具体序列。

权利要求书2页 说明书9页序列表2页 附图8页CN 112553306 A 2021.03.26C N 112553306A1.一种检测多个融合基因的试剂盒，包括多对扩增引物对；每对所述扩增引物对特异扩增1个所述融合基因的靶序列；每对所述扩增引物由引物A和引物B组成；所述引物A从5'端起依次由用于结合测序引物的接头序列A和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列A；所述引物B从5'端起依次由用于调整扩增产物长度的接头序列B和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列B；所述引物A的5’端修饰荧光基团；所述靶序列为包含融合基因中各基因连接位点的序列。

收稿:2008年8月,收修改稿:2008年9月*国家自然科学基金项目(No.20875009)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.2007CB914101)资助**Corresp onding author e -mail:qufengqu@毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用*屈 锋1**刘 允1任肖敏1赵新颖2张经华2(1.北京理工大学生命科学与技术学院 北京100081; 2.北京市理化分析测试中心 北京100089)摘 要 核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SELE X)技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。

毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。

应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。

本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE -SE LEX)的主要方法(EC EEM,NECEE M,Non -SELEX 和三者比较)和研究进展进行了综述。

关键词 核酸适配体 毛细管电泳 核酸适配体筛选中图分类号:O65718;Q524 文献标识码:A 文章编号:1005-281X(2009)07P 8-1576-07Application of Capillary Electrophoresis in AptamersStudy and Aptamers SievingQ Feng1**Liu Yun 1 Ren Xiaomin 1 Zhao Xinying 2 Zhang Jinghua2(1.School of Life Science &Tec hnology,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China;2.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis,Beijing 100089,C hina)Abstract Aptamers,DNA or RNA oligonucleotides obtains by syste matic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)from a random oligonucleotide library,which exhibit high affinity and specificity to a wide variety of targets.Capillary electrophoresis,a micro -separation method with advantages of high performance,high speed and lowcost,has been applied in aptamers sieving in recent years.This article introduces the separation methods in aptamers sieving process such as affinity chromatography,nitrocellulose filter,gel electrophoresis,magnetic bead separation and so on.The aptamer affinity interaction studied by capillary electrophoresis,the methods of CE -SELEX (EC EEM,NECE EM,Non -SELEX and comparison of them)in aptamer sieving and advances of CE -SE LEX are reviewed.Key words aptamers;capillary electrophoresis;apta mer sie vingContents1 Introduction2 Separation methods in SELEX3 Studied of aptamers affinity interaction by capillaryelectrophoresis4 Capillary electrophoresis methods in aptamers sieving411 NECEE M 412 ECEE M 413 Non -SELEX414 Comparison of NECEE M,ECEE M and Non -SE LEX 5 Application of CE in aptamers sieving 6 Prospects第21卷第7P 8期2009年8月化 学 进 展PROGRESS I N C HE MISTRYVol.21No.7P 8 Aug.,20091引言SELEX技术(syste matic evolution of ligands by e xponential enrichment),即指数富集配体系统进化技术,通过靶分子与大容量化学合成的随机寡核苷酸(主要是ssDNA和RNA)文库作用,将所形成的靶分子-寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离,再利用PC R体外扩增技术对形成复合物的寡核苷酸进行扩增。

DOI :10.11895/j.issn.0253⁃3820.181347毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究杨歌　朱超　刘晓慧　王勇　屈锋*(北京理工大学生命学院,北京100081)摘　要　毛细管电泳(CE)被认为是核酸适配体筛选的高效方法,其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离高效,样品用量少,筛选成本低㊂但由于小分子靶与核酸的结合位点少,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,通常认为CE⁃SELEX 不适用于筛选小分子靶标的适配体㊂本研究建立了基于CE⁃SELEX 的盐酸克伦特罗靶标的的适配体筛选方法㊂将80nt 的ssDNA 库与盐酸克伦特罗特混合孵育,通过CZE⁃UV 分离混合物㊂收集ssDNA 库峰前的馏分,通过PCR 扩增和ssDNA 制备,完成第一轮筛选㊂将次级核酸库经过3轮筛选,获得10条ssDNA 序列㊂选择3条亲和力较强的序列Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12,通过CE⁃LIF 测定其与盐酸克伦特罗的K d 分别为9.315×10-7mol /L㊁1.040×10-6mol /L 和1.143×10-5mol /L㊂软件分析表明,上述3条序列均可形成茎环二级结构,其中Apt 4茎环结构的自由能最低,结构最稳定㊂以沙丁胺醇为对照,验证了3条序列,具有较高的特异性㊂关键词　盐酸克伦特罗;核酸适配体筛选;毛细管电泳;毛细管电泳⁃指数富集配体系统进化　2018⁃05⁃24收稿;2018⁃07⁃29接受本文系国家自然科学基金项目(No.21675012)资助*E⁃mail:qufengqu@1　引言核酸适配体(Aptamer)由几十个核苷酸组成,具有分子量小㊁易穿透细胞膜㊁化学性质稳定㊁容易制备和修饰等特点[1~3]㊂适配体结合的靶标范围广泛,包括离子㊁小分子㊁蛋白质㊁细胞和微生物等㊂适配体具有广泛的应用前景和潜在需求,近年来是生物学㊁医学㊁药学和分析化学领域的研究热点之一[4]㊂蛋白质㊁细胞和微生物等靶标的Aptamer 可用于疾病诊断和治疗㊁药物研发㊁蛋白质组学以及基因表达调控机理研究[5]㊂而药物㊁氨基酸㊁抗生素等小分子靶标的适配体通常作为化学和生物传感器的识别分子用于食品和环境检测以及生物分析等领域[6]㊂目前已报道的靶标超过500种,适配体超过2300种[7],但具有实际应用价值的适配体还不多㊂研究者开发了各种新的筛选方法和技术,以提高适配体的筛选效率和适配体的性能[8]㊂毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)作为一种高效㊁快速㊁样品用量少的微量分析方法,在蛋白质的适配体筛选中应用较多(即CE⁃SELEX)[9~12],被认为是核酸适配体筛选的最高效方法㊂其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离效率高㊁分离速度快㊁样品用量少㊁筛选成本低㊂由于小分子靶标与核酸的结合位点少,亲和力较低,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,所以小分子⁃核酸库的复合物分离存在困难,通常认为CE⁃SELEX 用于小分子的适配体筛选有难度㊂目前,仅有Bowser 小组利用CE 筛选N ⁃甲基卟啉二丙酸的适配体的报道[13]㊂本课题组长期从事毛细管电泳筛选多尺度靶标(蛋白质[14]㊁微生物[15]㊁细胞和小分子)的核酸适配体的筛选方法研究㊂盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride,Clen,C 12H 18C l2N 2O ㊃HCl,Mr =313.7g /mol),又称 瘦肉精”,非法使用时可提高猪的瘦肉率,是我国食品安全检测的重要指标㊂本研究建立了CE 筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的系统方法和流程㊂选择80nt 的ssDNA 库与盐酸克伦特罗混合孵育,通过CE⁃UV 分离后,经PCR 扩增和ssDNA 制备,完成一轮筛选㊂重复筛选4轮后,克隆测序获得10条ssDNA 序列㊂选择3条亲和力较强的序列,通过CE⁃LIF 测定其解离常数K d ㊂进一步以分子结构和分子量与盐酸克伦特罗相似的沙丁胺醇(Salbutamol,Sal,C 13H 21NO 3,Mr =239.31g /mol)为对照分子(图1),验证了筛选的序列对盐酸克伦特罗的特异性㊂同时建立了胶体金比色分析(AuNPs)与氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)介导的适配体荧光 猝灭⁃恢复”两种方法,可快速验证所第46卷2018年10月分析化学(FENXI HUAXUE)　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第10期1595~1603筛选适配体的亲和力和特异性㊂结果表明,CE⁃SELEX 可用于一些小分子的适配体高效快速筛选,本方NHOH·HClAClH 2NClNHOHBOHHO图1　盐酸克仑特罗(A)及沙丁胺醇(B)的结构式Fig.1　Structural formula of clenbuterol hydrochloride (Clen)(A)and salbutamol (B)法为小分子的适配体筛选提供了参考㊂2　实验部分2.1　仪器与试剂BeckmanP /ACETMMDQ 配紫外和激光诱导荧光(LIF)检测器(美国贝克曼库尔特有限公司);Agilent 7100配DAD 检测器(美国安捷伦科技有限公司);S1000TM Thermal Cycler型PCR 仪㊁iQ TM 5Multicolor Real⁃Time PCR Detection System㊁电泳仪和电泳槽(美国Bio⁃Rad 公司);G:BOX 型凝胶成像系统(美国Syngene 公司);NanoDrop 2000c 紫外⁃可见光谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)㊂熔融石英毛细管(邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司)㊂盐酸克伦特罗(98.5%,Dr.Ehrenstorfer GmbH,Germany);80nt ssDNA 核酸库:5′⁃AGCA GCACAGAG GTCA GATG⁃40N⁃CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA⁃3′(两端为20nt 引物区固定序列,中间为40nt随机序列),FAM 标记的ssDNA 库(FAM⁃ssDNA library);引物P1:5′⁃AGCA GCAC AGAG GTCA GATG⁃3′,标记荧光的引物5′⁃FAM⁃P1:FAM⁃5′⁃AGCA GCAC AGAG GTCA GATG⁃3′,引物P2:5′⁃TTCA CGGT AGCA CGCA TAGG⁃3′(生工生物工程(上海)股份有限公司);2×Taq Plus PCR Master Mix (天根生化科技有限公司);TransStart TM Top Green q⁃PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司);核酸染料Gold View(北京鼎国昌盛生物技术有限公司);HCl㊁NaOH㊁NaCl㊁KCl㊁MgCl 2㊃6H 2O(分析纯,北京化工厂);三羟甲基氨基甲烷(Tris,赛默飞世尔公司);氧化石墨烯(GO)溶液(北京拜尔迪生物技术有限公司);实验用水均为某品牌蒸馏水㊂2.2　实验方法2.2.1　溶液配制　以30mmol /L HCl 溶解盐酸克伦特罗,配制成0.8mmol /L 的储备液㊂干粉状核酸库用50mmol /L 硼酸盐溶液(pH 8.2)溶解,配制成100μmol /L 核酸库㊂使用前,将100μmol /L 核酸库在94℃变性10min,然后以0.5℃/s 缓慢冷却至25℃㊂将盐酸克伦特罗与核酸库溶液于37℃孵育30min 后,进行CE 分析㊂2.2.2　毛细管电泳　75μm 熔融石英毛细管(有效长度/总长40cm /50.2cm),首次使用时分别用1mol /L㊁0.1mol /L NaOH 和去离子水分别冲洗30min㊂两次实验间和实验结束后,依次用0.1mol /L NaOH 和H 2O 冲洗5min㊂分析条件:50mmol /L 硼酸盐溶液(pH 8.2),20kV,UV 214nm;LIF 检测激发波长:488nm,发射波长:520nm;进样压力3.45kPa,5s㊂复合物分离收集,15kV,混合物进样6.89kPa,4s㊂收集0~5.9min(Before ssDNA library)溶液至50μL 的PCR 用溶液㊂重复收集2次㊂2.2.3　PCR 扩增条件　(1)常规PCR 扩增增加模板量　因收集的复合物中ssDNA 含量较低,需经PCR 扩增增大模板量,对PCR 需进行条件优化[16](见3.3节)㊂PCR 条件:总体积50μL,2×Taq Plus PCR Master Mix 25μL,300nmol /L 引物P1㊁P2为6μL㊂PCR 条件:94℃预变性1min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环15次后72℃后延伸5min㊂(2)不对称PCR 制备次级库　将上述PCR 产物经2.2.4方法浓缩和纯化后作为模板,进行不对称PCR 扩增,制备次级核酸库㊂优化的不对称PCR 条件:总体积,100μL,其中2×Taq Plus PCR Master Mix 50μL,引物P1为1.8μmol /L,引物P2为60nmol /L㊂PCR 条件:94℃预变性1min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环40次后,72℃后延伸5min㊂2.2.4　PCR 产物的浓缩和纯化　PCR 及不对称PCR 后,需对产物进行浓缩和纯化,分别获得不对称PCR 所用的模板或用于下轮次筛选的次级库㊂浓缩和纯化方法:PCR 扩增的DNA 产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳分离,60V,40min;切下所需凝胶转移到1.5mL 离心管中,12000r /min 离心1min,-20℃冰冻20min㊂取出冻结的凝胶立即捣碎后,加入500μL 水,振摇200次㊂向管中加入500μL Tris 饱和醇酚,振摇200次,于4℃以12000r /min 离心15min㊂将上清液加入含有500μL 氯仿⁃异戊醇(24∶1,6951 分析化学第46卷V /V )的1.5mL 离心管中,振摇200次,于4℃以12000r /min 离心15min㊂弃去上清液后,将沉淀置于干净吸水纸,干燥后得到核酸序列,用于后续筛选或不对称PCR㊂2.2.5　核酸序列分析与亲和力表征方法　(1)核酸序列由奥美德诺(北京)基因科技有限公司测定使用DNAMAN 软件(Lynnon Biosoft,USA)分析序列的二级结构㊂(2)以CE⁃LIF 表征亲和力　测定加入Clen 前后,ssDNA 峰面积的变化百分数(RA)为:RA(%)=(I 0-I 1)/I 0×100%,其中,I 0为1μmol /L ssDNA 的峰面积,I 1为加入不同浓度Clen 后的ssDNA 峰面积㊂RA 越大,表示靶标与ssDNA 的相对亲和力越强㊂(3)平衡解离常数K d 测定　1μmol /L ssDNA 中加入不同浓度(0~20μmol /L)Clen,计算RA,利用软件GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.San Diego,CA),按照1∶1结合模型,对RA 随Clen 浓度变化的非线性饱和曲线拟合,求算解离常数㊂2.2.6　AuNPs 比色分析验证亲和力　(1)AuNPs 制备　采用柠檬酸盐还原法制备AuNPs,加热100mL 1mmol /L HAuCl 4溶液至沸腾;而后在同步搅拌下快速注射194mmol /L 柠檬酸钠溶液2mL,沸腾15min 后取出反应烧瓶,并将反应溶液在缓慢冷却至室温㊂(2)AuNPs 比色分析方法分析核酸序列亲和力　在96孔板中,将25μL 0.1μmol /L 的核酸序列分别与等体积且浓度为0.1㊁0.2㊁0.5㊁1㊁2㊁5和10μmol /L 的Clen 室温孵育15min,加入10μL 900mmol /L NaCl 溶液,观察胶体金溶液颜色变化㊂(3)520和620nm 处吸光度测定　使用紫外⁃可见光谱仪测定AuNP 溶液在520和620nm 波长处的吸光度㊂2.2.7　GO⁃毛细管电泳法分析验证亲和力　(1)孵育缓冲溶液配制　孵育缓冲溶液为20mmol /LpH 7.4Tris⁃HCl,50mmol /L K +,100mmol /L Na +,5mmol /L Mg 2+;(2)样品配制　将GO 溶液用(1)中的孵育缓冲溶液稀释至浓度为60μg /mL,于4℃保存备用;用孵育缓冲液将核酸序列溶液稀释至0.3μmol /L,将Clen 稀释至0.3㊁0.6㊁3㊁6和15μmol /L㊂(3)GO 方法分析核酸序列亲和力　各取稀释后的核酸序列㊁GO 与Clen 溶液10μL,在室温下混合孵育15min 后,通过2.2.2节的CE⁃LIF 方法检测荧光猝灭⁃恢复情况㊂3　结果与讨论3.1　筛选流程图2为Clen 的适配体筛选流程㊂CE 分离和收集靶标⁃ssDNA 复合物组分后,进行PCR 扩增和ssDNA 浓缩和纯化,用于不对称PCR 的模板㊂不对称PCR 扩增后,浓缩和纯化的产物为次级库,用于下一轮筛选㊂各轮次级库用CE⁃LIF 表征筛选效率㊂经过4轮筛选的产物采用克隆测序得到适配体序列㊂利用CE⁃UV,通过RA 初步比较其与盐酸克仑特罗的亲和力㊂选择亲和力较好的序列,通过CE⁃LIF CE seperationClenHeterogeneousPCRAffinity characterization with Clen by CEAs sublibraryDNA products characterizationby CEConcentrationand purificationAsymmetric PCRConcentrationand purificationssDNA library图2　CE 筛选Clen 适配体的流程图Fig.2　Clen aptamer screening process based oncapillary electrophoresis (CE)测定各序列的解离常数K d ㊂3.2　Clen 与ssDNA 库孵育混合物的CZE 分析UV 检测下,Clen 和80nt ssDNA 库分别在中性标记物DMSO 前后出峰(图3A),说明二者在溶液中分别带正㊁负电荷㊂ssDNA 库与Clen 孵育后,游离的Clen 和ssDNA 峰均无明显降低,也未观察到明显的复合物峰㊂LIF 检测下,20nmol /L 的FAM⁃ssDNA 库中加入Clen 后,增加Clen 浓度使ssDNA 库峰面积降低,面积降低百分比为42.65%(图3B)㊂在ssDNA 峰前面,可见产生的包峰,说明二者产生相互作用,形成了复合物㊂因复合物的荷质比小于ssDNA 核酸库,故在ssDNA 核酸库前出峰㊂因此,利用CE⁃LIF 可灵敏检测到ssDNA 库的峰降低以及Clen⁃ssDNA 复合物峰㊂3.3　Clen⁃ssDNA 复合物收集与PCR 条件优化由于ssDNA 核酸库中序列数与多样性可能高达1015,使用的靶标浓度低于ssDNA 时有利于提高各7951第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 0.042t （min ）A b s o r b a n c e (a .u .)0.060.020.0046810A 205t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s301000101520B图3　Clen 与ssDNA 核酸库的毛细管电泳分析:(A)CE⁃UV 检测的电泳图从下往上依次为:DMSO㊁80μmol /L Clen㊁5μmol /L 80nt ssDNA library㊁80μmol /L Clen +5μmol /L 80nt ssDNA library;(B)CE⁃LIF 检测的电泳图20nmol /L FAM⁃ssDNA 库与Clen 混合物分析,Clen 浓度从下往上依次为0㊁160㊁320和400μmol /L,体系在37℃混合孵育30min,室温放置10minFig.3　CE analysis of Clen and ssDNA library:(A)Electrophoretic patterns detected by CE⁃UV,from top tobottom:80μmol /L Clen +5μmol /L 80nt ssDNA library,5μmol /L 80nt ssDNA library,80μmol /L Clen,DMSO;(B)Electrophoretic patterns detected by CE⁃laser inductive fluorescence (LIF)analysis of 20nmol /L FAM⁃ssDNA library and Clen mixture,concentration of Clen is (from bottom to top )0,160,320and 400μmol /L respectively.The system was incubated at 37℃for 30min,and left at room temperature for 10min轮次筛选的次级库收敛度[17]㊂将3.2μmol /L Clen 与20μmol /L ssDNA 等体积混合孵育后进样,收集0~5.9min 的组分(图4A),即ssDNA 库前段包含Clen⁃ssDNA 复合物的馏分㊂为方便收集和增加收集量,进行连续5次收集㊂收集的组分进行PCR 扩增,并优化PCR 的退火温度㊁循环次数条件㊂预设循环数30,分别在退火温度55℃㊁56.5℃㊁58.9℃㊁61.7℃㊁65.6℃㊁68.7℃㊁70.8℃㊁72℃下进行扩增㊂扩0.060.05t （min ）A b s o r b a n c e (a .u .)0.040.030.02A 0.010.00Collection window2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp100bpmB400010CycleP C R p r o d u c t c u r v e f i t R F U30002000C1000002030402t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s6040D20004ssDNA products681210080Primers102046810R un 1Run 2Run 3图4　(A)CE⁃UV 收集复合物;(B)PCR 温度优化M:DNA Marker,a ~h 退火温度分别为:a⁃72.0℃,b⁃70.8℃,c⁃68.7℃,d⁃65.6℃,e⁃61.7℃,f⁃58.9℃,g⁃56.5℃,h⁃55.0℃;(C)Q⁃PCR 优化循环数(平行3次);(D)PCR 产物的CE⁃LIF 分析Fig.4　(A)Complex collection by CE⁃UV;(B)Optimization of PCR temperature M:DNA Marker;a-h annealingtemperatures:a⁃72.0℃,b⁃70.8℃,c⁃68.7℃,d⁃65.6℃,e⁃61.7℃,f⁃58.9℃,g⁃56.5℃,h⁃55.0℃;(C)Optimization of the number of cycles by Quantative⁃PCR(parallel 3times);(D)CE⁃LIF analysis of PCR products8951 分析化学第46卷增产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图4B),退火温度为58.9~61.7℃时,DNA 条带较亮,且亮度相近,说明PCR 产物量相差不大㊂继续升高温度,则产物条带变暗,产物量减少,因此选择退火温度为60℃㊂本实验通过荧光实时定量PCR(Q⁃PCR)优化循环数㊂产物荧光信号随扩增轮次增加,在第15次循环达到最高值(图4C)㊂对上游P1引物采用5′⁃FAM 标记,其PCR 产物可经CE⁃LIF 检测㊂由图4D 可见,过剩的P1引物峰和扩增产物dsDNA 的峰,二者迁移时间有明显差异㊂产物中仅有引物峰和dsDNA 峰,说明优化的PCR 条件下,没有副产物ss⁃dsDNA 形成㊂而高灵敏的CE⁃LIF 可用于快速检测PCR 体系中的P1引物㊁PCR 产物以及副产物,辅助PCR 条件优化㊂3.4　制备次级文库通过不对称PCR 扩增制备ssDNA 次级库㊂将3.3节的PCR 产物经浓缩和纯化后,作为次级库制备的不对称PCR 的模板,进一步扩增得到大量ssDNA㊂优化不对称PCR 的上下引物比例,可控制扩增生成的ssDNA㊂考察上下游引物浓度比P1∶P2分别为20∶1㊁30∶1和40∶1时的扩增情况,经过40循环数扩增㊂如图5A 所示,P1∶P2=30∶1时能够获得更多的PCR 产物,且不对称PCR 产物与80nt ssDNA 库条带的位置一致,未产生其他序列㊂由于不对称PCR 反应后的混合体系复杂,不能直接用作次级库进行后续筛选,需对不对称PCR 产物中的单链ssDNA 进一步浓缩和纯化㊂按2.2.4节的方法浓缩纯化ssDNA,对其进行CE 表征,纯化产物为单一的信号峰,且与对照的ssDNA 库迁移时间一致(如图5B),说明纯化效果较好㊂本研究以纯化后的不对称PCR 产物ssDNA 作为次级库并用于下一轮次的筛选㊂3.5　4轮筛选的ssDNA 库与Clen 的亲和力比较将4轮筛选分别制备的ssDNA 次级库(0.5μmol /L)与80μmol /L Clen 混合,以ssDNA 峰面积变化RA 为指标比较多轮筛选的ssDNA 的亲和力,RA 越大,靶标与ssDNA 的亲和力越强㊂如图5C 所示,1~3轮,次级库与靶标的亲和力随筛选轮次增加㊂4轮筛选后,核酸结合比例有所降低,说明亲和力已不再提高㊂3轮筛选的亲和力最优与[9,10,13,18]报道一致,说明CE⁃SELEX 的筛选效率高,3轮筛选即可获得亲和力最优的适配体㊂考虑到轮次筛选少可能引起ssDNA 序列的多样性,会给后续测序带来高成本,并考虑后续研究的结果比较,本研究采用了第4轮筛选的产物进行序列分析和亲和力评价㊂5.0t （min ）A b s o r b a n c e (a .u .)B0.07.5Purified secondary ssDNA library12.515.0A200bp 100bp 50bp2.510.010滋mol/L ssDNA library80LibCycleR e l a t i v e a f f i n i t y (%)6040C200Round 1Round 2Round 3Round 40.100.080.060.040.020.00图5　(A)不对称PCR 的引物浓度比例优化,M:DNA Marker,A⁃C 上下游引物浓度比分别为:a⁃20∶1,b⁃30∶1,c⁃40∶1;(B)CE⁃UV 表征纯化后次级核酸库;(C)各筛选轮次ssDNA 库与Clen 的亲和力比较Fig.5　(A)Primer concentration ratio optimization for asymmetric PCR,M:DNA Marker,A⁃C upstream and downstream primer concentration ratio:a⁃20∶1,b⁃30∶1,c⁃40∶1;(B)CE⁃UV characterization of the purifiedsecondary ssDNA library;(C)Affinity comparison of ssDNA library and Clen in each screening round 3.6　筛选序列分析与亲和力测定3.6.1　筛选序列的相对亲和力比较　将第4轮筛选产物进行克隆测序,得到10条序列,如表1所示㊂用软件DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft,USA)计算各序列的碱基组成,发现(G+C)含量普遍较高,与文献[6]报道一致㊂将1μmol /L ssDNA 与80μmol /L Clen 25℃混合孵育10min,加入Clen 后,ssDNA 与Clen 结合形成复合物,使游离ssDNA 减少,峰面积降低㊂通过CE⁃UV 分析,比较加入Clen 前后ssDNA 峰面积变化RA 比较各序列的相对亲和力㊂由表1可见,RA 值最大的3条序列为Apt 4㊁Apt 7和9951第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 表1　筛选序列及相对峰面积(%)Table 1　Screened sequences and relative peak area (RA)序号No.序列组成Sequences碱基含量Base percentageA%C%G%T%RA (%)Apt 1P1⁃GCCCGCATGCACTCCGGTAA AGATATGTGG TGTAATTTTC⁃P225.023.827.523.814.05Apt 2P1⁃ATGCCTTGCCAATCATGCTGTTCGAGATGGGAACTCCTTC⁃P223.826.326.323.8-7.63Apt 4P1⁃AGGGCCTGGGCTGTTGAGGCAACGTCGGTTTGTTTATTAA⁃P222.520.032.525.024.6Apt 5P1⁃CCATGGGGCAGTAGTCTTTCCACGCGTGTTTCTAACGGTG⁃P221.325.030.023.818.18Apt 6P1⁃GATACGCTGATGCCCACCGTAGCGTTGTTGGTTTACACGC⁃P222.526.328.822.511.44Apt 7P1⁃CACCATGCCAACTCGTCTGTATAACGACTATCACCTCGTC⁃P226.331.321.321.335.56Apt 9P1⁃GACTAGTCTTGGAGAGACTCAGAAGGCGGAGGTCAAGTAC⁃P228.821.332.517.5 6.05Apt 10P1⁃TACGGTGGGTGTAAATTTGGCGAGCCATCCTTTCCTTAGG⁃P222.522.530.025.09.74Apt 11P1⁃GGTGAGTCGCAAGGCCTCAA AGTAGGCTTATTGACATCTG⁃P226.322.530.021.3 1.78Apt 12P1⁃GGGCAAGAACGTAGACGTGACCCTGGTATTGGATTAGTTG⁃P225.015.035.025.040.53P1,P2分别为20nt 的固定引物序列:P1:5′⁃AGCA GCAC AGAG GTCA GATG⁃3′;P2:5′⁃CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA⁃3′.Apt 12,初步确定它们与靶标的亲和力强于其它序列㊂3.6.2　序列的平衡解离常数测定　利用高灵敏的CE⁃LIF,测定Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12的解离常数K d ㊂在1μmol /L FAM 标记的Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12中分别加入0~20μmol /L Clen,测定RA㊂利用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.San Diego,CA )软件,按照1∶1结合模型,拟合RA 随Clen 浓度变化的饱和曲线(图6),求得Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12的解离常数K d 依次为9.315×10-7mol /L㊁1.040×10-6mol /L㊁15010020Clen （滋mol/L ）R A （%）500Apt 12406080100K d =1.143×10-5mol/L R 2=0.9953150100R A （%）50Apt 4K d =9.315×10-7mol/LR 2=0.98665Clen （滋mol/L ）0101520251501005Clen （滋mol/L ）R A （%）50Apt 7010152025K d =1.040×10-6mol/L R 2=0.9902图6　序列的解离常数K d 计算及二级结构Fig.6　Calculation of K d and secondary structure of the sequence0061 分析化学第46卷1.143×10-5mol /L,其与文献[8]报道的小分子适配体的解离常数的数量级基本一致㊂Apt 4的K d 最小,与Clen 的亲和力最高㊂使用DNAMAN 8.0模拟Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 123种序列的二级结构,其自由能分别为-37.24㊁-27.63和-21.99kJ /mol,三者均能形成茎环结构(图6)㊂Apt 4的亲和力更强,可能是由于其茎环结构更稳定㊂150100Apt 4B m a x （滋m o l /L ）50Apt 7Apt 12Clen Sal图7　三条序列结合盐酸克伦特罗与沙丁胺醇的B max 比较Fig.7　B max comparison of three sequences combined with Clen and salbutamol3.7　适配体的特异性验证以分子结构和分子量与Clen 相似的沙丁胺醇(Sal),分析适配体序列的特异性㊂利用CE⁃LIF 测定加入Sal 后的峰面积变化RA%,分析不同浓度沙丁胺醇与3条序列的相互作用㊂利用GraphPad Prism 6拟合饱和曲线,分别得到其最大结合量B max ,并与Clen 靶标的结果比较(图7)㊂3条序列与Clen 的B max (>100μmol /L)均明显高于与Sal 结合时的B max(Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12分别为2.22㊁9.58和17.61μmol /L)㊂说明3条序列Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12与Clen 的结合具特异性,且Apt 4的特异性较其它两条序列更高㊂3.8　AuNPs 比色法分析适配体亲和力与特异性在25μL AuNPs 溶液中加入等体积的0.1μmol /L 适配体,室温混合孵育15min 后,加入NaCl 溶液,AuNPs 因适配体保护而不发生沉聚,故其颜色保持酒红色㊂在适配体包被的AuNPs 溶液中,分别加入0.1㊁0.2㊁0.5㊁1㊁2㊁5和10μmol /L 的Clen,室温孵育15min 后加入NaCl 溶液,结果可见,随着Clen 浓度增加,AuNPs 溶液颜色由酒红色逐渐转变为蓝色(图8A )㊂当Clen 浓度为0.2μmol /L 时,结合了Apt 440.0A 520/A 6203210.10.20.512510Apt 4Apt 7Apt 12C Clen (滋mol/L)BCApt 4ClensalApt 12ClensalApt 4Apt 12Clen (滋mol/L)00.10.20.512510A图8　AuNPs 比色分析适配体亲和力与特异性:(A)Clen 浓度对AuNPs 溶液颜色影响;(B)Clen 浓度增加对AuNPs 溶液A 520/A 620的影响;(C)Apt 4与Apt 12的特异性分析(重复3次)Fig.8　Analysis of aptamers affinity and specificity by AuNPs colorimetry:(A)Effect of Clen concentration on color of AuNPs solution;(B )Effect of increasing Clen concentration on A 520/A 620of AuNPs solution;(C)Specificity analysis of Apt 4and Apt 12,repeated 3times1061第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 的AuNPs 溶液转变为紫色,而加入Apt 7或Apt 12时,Clen 浓度为0.5μmol /L 时AuNPs 转变为紫色㊂说明靶标与Apt4的亲和力高于Apt7㊁Apt12,与CE 测定亲和力结果一致㊂分别在520和620nm 波长处测定AuNPs 溶液吸收值(图8B)㊂Clen 浓度为0~0.5μmol /L 范围时,A 520/A 620的比值随Clen 浓度增加而降低㊂进一步通过AuNPs 比色分析表征适配体的特异性㊂在3条适配体中选择亲和力最高的Apt 4与最低的Apt 12进行特异性比较,结果如图8C 所示㊂吸附了Apt 4㊁Apt 12的AuNPs 溶液中分别加入1μmol /L 的Clen 与Sal,加入1μmol /L Clen 的AuNPs 溶液呈蓝色,而加入1μmol /L Sal 的AuNPs 溶液仍保持酒红色,说明Apt 4㊁Apt 12均不能结合Sal,两条适配体具有特异性㊂3.9　GO⁃毛细管电泳法分析适配体亲和力通过GO 毛细管电泳法,进一步验证Clen 与适配体的亲和力㊂将0.1μmol /L 3种适配体分别与20μg /mL GO 在室温条件下缓冲体系中混合孵育15min,再在孵育溶液中分别加入0.1㊁0.2㊁1㊁2和5μmol /L 的Clen㊂分别对适配体㊁适配体/GO 溶液㊁适配体/GO /Clen 溶液进行CE⁃LIF 检测㊂结果如图9所示,在0.1μmol /L 适配体中加入20μg /mL GO 时,适配体的荧光发生猝灭,其峰面积降低达98%以上㊂进一步加入Clen 时,随Clen 浓度增加,荧光强度逐渐恢复㊂加入5μmol /L Clen 时,荧光几乎完全恢复㊂上述结果表明,与GO 结合的适配体,因Clen 加入而从GO 上脱落,Clen 从GO 上竞争结合适配体,说明其与适配体具有更强的相互作用㊂3条适配体中,Apt12的荧光恢复程度最低,说明其与Clen 的亲和力最弱,与CE 方法和纳米金比色法一致㊂t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s101２８642200150100500BApt 7t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s101２８642200150100500AApt 4t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s101２８642020012080400CApt 12160图9　GO⁃毛细管电泳法比较适配体与Clen 结合的亲和力:(A)Apt 4;(B)Apt 7;(C)Apt 12;电泳图从下向上为:0.1μmol /L 适配体;0.1μmol /L 适配体+20μg /mL GO;适配体/GO+0.1μmol /L Clen;+0.2μmol /L Clen;+1μmol /L Clen;+2μmol /L Clen;+5μmol /L ClenFig.9　Comparison of affinity of aptamers to Clen by GO⁃capillary electrophoresis:(A)Apt 4;(B)Apt 7;(C)Apt 12;Electrophoresis pattern of CE⁃LIF detection from bottom to top:0.1μmol /L Aptamers;0.1μmol /L Aptamers +20μg /mL GO;Aptamers /GO+0.1μmol /L Clen;+0.2μmol /L Clen;+1μmol /L Clen;+2μmol /L Clen;+5μmol /L Clen4　结论建立了基于CE⁃UV 和CE⁃LIF 筛选和分析盐酸克伦特罗的核酸适配体的方法㊂CE 不仅可用于适配体序列的分离,还可用于PCR 产物的分离和表征,以及靶标与各轮筛选次级库的亲和力表征㊁适配体序列的亲和力和特异性分析㊂结果表明,建立的CE⁃SELEX 方法可用于适配体的高效快速筛选㊁筛选过程的条件优化及筛选效率表征㊂本研究拓展了CE⁃SELEX 在小分子靶标的核酸适配体筛选中的应用,也为建立核酸适配体的标准筛选方法奠定了基础㊂References1　Ellington A D,Szostak J W.Nature ,1990,346(6287):818-8222　Tuerk C,Gold L.Science ,1990,249(4968):505-5103　Kahn J S,Hu Y,Willner I.Acc.Chem.Res.,2017,50(4):680-6902061 分析化学第46卷4　QIN Shi⁃Ya,CHEN Nan⁃Di,WANG Qing,HUANG Jin,HE Xiao⁃Xiao,LIU Jian⁃Bo,GUO Qiu⁃Ping,YANG Xiao⁃Hai,WANG Ke⁃Min.Chinese J.Anal.Chem.,2017,45(12):1795-1803覃诗雅,陈南迪,王青,黄晋,何晓晓,刘剑波,郭秋平,羊小海,王柯敏.分析化学,2017,45(12):1795-18035　Meng H M,Liu H,Kuai H,Peng R Z,Mo L T,Zhang X B.Chem.Soc.Rev.,2016,45(9):2583-26026　Zhou W,Huang P J,Ding J,Liu J.Analyst ,2014,139(11):2627-26407　McKeague M,McConnell EM,Cruz⁃Toledo J,Bernard ED,Pach A,Mastronardi E,Zhang X,Beking M,Francis T,Giamberardino A,Cabecinha A,Ruscito A,Aranda⁃Rodriguez R,Dumontier M,DeRosa M C.J.Mol.Evol.,2015,81(5⁃6):150-1618　McKeague M,DeRosa M C.Nucleic Acids Res.,2012,2012(4968):7489139　Mosing R K,Mendonsa S D,Bowser M T.Anal.Chem.,2005,77(19):6107-611210　Mendonsa S D,Bowser M T.Anal.Chem.,2004,76(18):5387-539211　Berezovski M,Drabovich A,Krylova S M,Musheev M,Okhonin V,Alexander P.J.Am.Chem.Soc.,2005,127(9):3165-317112　Dembowski S K,Bowser M T.Analyst ,2018,143(1):21-3213　Yang J,Bowser M T.Anal.Chem.,2013,85(3):1525-153014　Qian L,Zhao X,Liu H,Feng Q.J.Chromatogr.A ,2014,1364:289-29415　Meng C,Zhao X,Qu F,Mei F,Gu L.J.Chromatogr.A ,2014,1358:269-27616　Musheev M U,Krylov S N.Anal.Chim.Acta ,2006,564(1):91-9617　Jing M,Bowser M T.Anal.Chem.,2013,85(22):10761-1077018　Mendonsa S D,Bowser M T.J.Am.Chem.Soc.,2005,127(26):9382-9383Screening of Clenbuterol Hydrochloride Aptamers Basedon Capillary ElectrophoresisYANG Ge,ZHU Chao,LIU Xiao⁃Hui,WANG Yong,QU Feng *(School of Life Science ,Beijing Institute of Technology ,Beijing 100081,China )Abstract Capillary electrophoresis based systematic evolution of ligands via exponential enrichment (CE⁃SELEX)was reported as a homogeneous efficient method for high⁃affinity selection of aptamer,with several merits involving screening in free solution without nonspecific binding,capable of high⁃efficient separation,low⁃sample consumption,and saving money.There are few studies regarding the aptamer selection against small molecule using CE⁃SELEX,resulting from the aspects of less binding sites and the negligible variety of its complex with nucleic acid in the electrophoretic mobility.In this study,the aptamer selection wasperformed towards a small molecule target of clenbuterol hydrochloride (Cle )by CE⁃SELEX.In brief,incubated Cle and an 80nt ssDNA library were firstly incubated,and CZE⁃UV approach was used to separate complex and random ssDNA.The complex was then collected into a vial followed by PCR amplification.Through three round selections,the third pool was selected to clone and ten sequences were finally obtained.The dissociation constants (K d )of three potential candidates (Apt 4,Apt 7and Apt 12)were determined by CE⁃LIF,and showed high affinities of 9.315×10-7mol /L,1.040×10-6mol /L and 1.143×10-5mol /L,respectively.The m⁃Fold software analysis showed that the above three sequences could form stem⁃loop structure,and Apt 4gave the lowest free energy and the most stable ing salbutamol as a control,three selected aptamers were verified with high specificity.Keywords Clenbuterolhydrochloride;Aptamerselection;Capillaryelectrophoresis;Capillaryelectrophoresis based systematic evolution of ligands by exponential enrichment(Received 24May 2018;accepted 29July 2018)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21675012)3061第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 。

agilent 5200检测原理
Agilent 5200是一种高级的生物分析仪器，主要用于蛋白质和
核酸的分析。

它采用了一种先进的技术来进行检测，主要原理包括
以下几个方面：
1. 荧光检测原理，Agilent 5200使用荧光检测技术来分析样品。

当样品中的蛋白质或核酸与荧光染料结合时，会产生荧光信号。

仪器通过检测样品中的荧光信号强度来确定样品中的蛋白质或核酸
的含量和特性。

2. 毛细管电泳原理，Agilent 5200还采用毛细管电泳技术。

这种技术利用电场作用于带电粒子，使其在毛细管中移动。

根据不
同的电荷、大小和形状，样品中的蛋白质或核酸会以不同的速率在
毛细管中移动，从而实现对样品的分离和分析。

3. 数据分析原理，Agilent 5200配备了专业的数据分析软件，能够对检测到的荧光信号和电泳分离结果进行精确的数据处理和分析。

这些数据分析结果可以帮助科研人员快速准确地获取样品的蛋
白质或核酸信息。

总的来说，Agilent 5200的检测原理是基于荧光检测和毛细管电泳技术，结合了先进的数据分析软件，能够高效准确地进行蛋白质和核酸的分析。

这些原理的结合使得Agilent 5200成为了生物分析领域中的重要工具，为科研人员提供了强大的分析能力和技术支持。

凝胶电动毛细管电泳技术在DNA检测中的应用凝胶电动毛细管电泳技术作为一种高分辨率、高灵敏度的分析方法，广泛应用于生物医学领域，尤其在DNA检测中起到了重要的作用。

该技术通过利用电场作用，将DNA分子在毛细管内进行分离，从而实现对DNA样品的分析，进而发掘它在遗传学、犯罪学、医学诊断等领域的应用。

首先，凝胶电动毛细管电泳技术在遗传学研究中具有重要意义。

通过该技术，可以分离和鉴定DNA的长度和序列变异，有助于研究基因结构、功能和遗传变异。

例如，在人类基因组计划中，凝胶电动毛细管电泳技术被广泛应用于分析DNA序列的染色体映射、SNP分型和基因突变等。

这些研究对于疾病的诊断和治疗、基因组学的发展以及遗传进化的研究具有重要的意义。

另外，凝胶电动毛细管电泳技术在犯罪学领域也具备较大的应用潜力。

由于每个人的DNA序列是独特的，通过对DNA样本的分析，可以在犯罪现场和嫌疑犯之间建立联系。

凝胶电动毛细管电泳技术能够对纯化的DNA样本进行分离和检测，通过与数据库中的DNA信息进行比对，可以为犯罪现场的DNA样本进行个体识别和鉴定。

这项技术在犯罪侦查和法医学中的应用已经取得了显著的成果，成为了破案工作中的强大工具。

此外，在医学诊断中，凝胶电动毛细管电泳技术也展现出其独特的优势。

例如，在肿瘤基因检测中，凝胶电动毛细管电泳技术可以快速、准确地检测出肿瘤相关基因的突变情况，从而为肿瘤的早期诊断和治疗提供重要的依据。

此外，该技术还可应用于遗传性疾病的检测和筛查。

通过对患者的DNA样本进行电泳分析，可以检测出一些常见的遗传性疾病的突变，早期发现和干预有助于降低疾病的发病率和社会负担。

在凝胶电动毛细管电泳技术的应用中，一种重要的提高分辨率的方法是多色荧光标记。

通过将多个荧光染料与DNA片段结合，可以实现多样本多标签的并行分离。

这种方法不仅减少了实验的时间和成本，还可以提供更多的信息。

此外，还可以利用凝胶电动毛细管电泳技术进行定量分析。

市售几款基于毛细管电泳原理的核酸分析仪的比较1.毛细管电泳原理及发展史毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)，又叫高效毛细管电泳(HPCE)是利用带电性不同的粒子在电场中迁移，在泳动过程中物质的各组分被分离。

被分离物质的迁移率取决于分子的结构、形状和电荷数量等因素，同时受溶液pH值、离子强度、粘度和两性电解质因素的影响。

是近年来发展最快的分析方法之一。

1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。

1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。

1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦，Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。

1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。

从此，由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求，得到了迅速的发展。

2.传统电泳的不足及毛细管电泳的优点经典电泳技术虽然对生物化学的发展起了重要的推动作用，但是传统的电泳存在诸多弊端如解析度不佳、灵敏度差、重現性差、、电泳中的有害物质核酸染料废弃物处理麻烦、定量困难、各式药品保存及品质管理复杂、多样仪器操作及管理:配胶/制胶/电泳/UV灯/照相/软件分析等、人工判读没有统一标准、后续资料处理复杂、资料保存困难，已经很难满足现代生命科学研究的要求。

随着科技的进步基于毛细管电泳技术新仪器设备也被广泛的研发出来，其克服了传统凝胶电泳实验的一些弊端，具有高通量、高分辨率、高灵敏度、全自动、标准化、无污染等优点，赋予了其强大的检测分析功能，帮助科研工作者提高效率，及研判实验的准确性。

3. 几款核酸分析仪的比较现在市面上比较流行的利用毛细管电泳技术对dsDNA、RNA进行分离的核酸分析仪有安捷伦公司的2100生物分析仪、凯杰公司的QIAxcel系统、伯乐公司的Experion系统还有来自祖国宝岛台湾光鼎公司的Qsep100系统。