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常规PCR技术及几类PCR新技术的介绍热启动PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。
尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。
因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。
这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。
在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed 突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。
这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。
包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。
其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。
在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。
象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。
Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。
此酶在常温下活性被封闭，要在94℃－95℃下加热数分钟才能够恢复酶活性。
同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。
使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。
Touch-down PCRTouch-down PCR又称降落PCR.即选定一个温度范围，如50—35 ℃，每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。
pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。
它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。
PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。
PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。
具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。
2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。
3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。
4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。
5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。
PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。
通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。
2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。
通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。
这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。
3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。
通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。
这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。
PCR扩增的原理和操作步骤PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学中广泛应用的技术，用于快速扩增特定的 DNA 片段。
这项技术的发明极大地推动了生物学、医学、遗传学等领域的研究和发展。
PCR 扩增的原理基于 DNA 的半保留复制机制。
简单来说，就是通过模拟细胞内 DNA 复制的过程，在体外实现特定 DNA 片段的大量扩增。
在 PCR 反应中，需要以下几个关键的要素：1、模板 DNA：这是我们想要扩增的目标 DNA 片段。
2、引物：是一小段与模板 DNA 两端特定序列互补的寡核苷酸，它们决定了扩增的起始位置和范围。
3、四种脱氧核苷酸（dNTPs）：分别是 dATP、dTTP、dCTP 和dGTP，作为合成新 DNA 链的原料。
4、 DNA 聚合酶：能够催化新的 DNA 链合成。
5、缓冲液：提供适宜的反应环境，维持 pH 值和离子强度等条件的稳定。
PCR 扩增的过程通常包括三个主要步骤，即变性、退火和延伸，这三个步骤不断循环，使得 DNA 片段得以指数级扩增。
第一步是变性。
将反应体系加热至 94 98℃，使模板 DNA 的双链解开，变成两条单链。
第二步是退火。
降低温度至 50 65℃，引物与模板 DNA 单链上的互补序列结合。
第三步是延伸。
将温度升高到 72℃左右，DNA 聚合酶以引物为起点，按照碱基互补配对原则，将 dNTPs 逐个连接到引物的 3'端，合成新的 DNA 链。
经过一轮这样的循环，一个 DNA 分子变成了两个。
然后再重复这三个步骤，新合成的 DNA 分子又可以作为模板进行扩增，经过多次循环，目标 DNA 片段的数量就会呈指数级增长。
接下来，我们详细了解一下 PCR 操作的具体步骤。
首先是准备阶段。
1、设计引物：根据目标 DNA 片段的序列，使用专业的软件或在线工具设计合适的引物。
引物的长度一般在 18 25 个碱基之间，GC 含量适中，避免形成二级结构等。
PCR实用技巧PCR是一种重要的分子生物学技术，通过这种技术可以扩增、复制、检测和定量地分析DNA片段。
在基因工程、医学诊断、疾病研究等领域具有广泛的应用。
下面将介绍一些PCR的实用技巧，希望能对读者有所帮助。
1.设计合适的引物：PCR的关键在于引物的选择和设计。
引物是一段DNA序列，用于识别和精确扩增目标DNA片段。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基配对，同时避免引物之间的互相配对和自相互配对。
最好能够在引物末端加上限制性内切酶位点，方便后续的克隆和酶切。
2.优化PCR反应条件：PCR反应的条件包括温度、时间、酶的浓度等。
合理优化这些条件可以提高PCR的效率和特异性。
一般来说，常用的PCR反应体系包括DNA模板、引物、缓冲液、dNTPs、聚合酶和MgCl2等。
其中，MgCl2的浓度是影响PCR特异性的重要因素，需进行优化。
3. 添加PCR增效剂：有些PCR样品可能会出现不理想的扩增效果，此时可以添加一些PCR增效剂来提高PCR的效率和特异性。
常用的PCR增效剂包括BSA（胸腺素A），DMSO（二甲亚砜），betaine（单甜菜碱）等。
这些增效剂能够改变PCR反应液的成分，降低DNA的空间结构，促进引物与DNA模板的结合，提高PCR的效果。
4.进行温度梯度实验：温度是PCR反应中的一个重要因素，不同的引物和模板可能对温度有不同的要求。
因此，可以利用温度梯度实验来确定最适合的扩增温度。
温度梯度实验可以在一个PCR反应中设置多个不同的温度，通过观察扩增产物的带型以及扩增效果，确定最佳的扩增温度。
5. 使用热启动酶：PCR反应在体外进行，一开始的温度变化可能导致杂交反应的发生，进而影响PCR的特异性。
为了避免这种问题，可以使用热启动酶，如热启动聚合酶（Hot Start Polymerase）。
这种聚合酶在低温时不具有DNA合成活性，只有在高温条件下才能启动。
这样可以有效降低非特异性扩增的问题。
6.进行负对照和正对照：为了准确评价PCR反应的结果，应该同时设置负对照和正对照。
PCR与DNA扩增技术PCR（聚合酶链反应）是一种重要的生物技术方法，被广泛应用于DNA的扩增和检测。
DNA扩增技术则是通过PCR等方法将目标DNA序列扩增至足够数量以供后续实验分析。
本文将介绍PCR技术的原理、步骤和应用，以及DNA扩增技术在生物学研究中的重要性。
PCR技术是一种通过体外复制DNA的方法，可以将少量DNA扩增至数百万倍。
其原理基于DNA的双链结构，利用DNA聚合酶及引物和核苷酸作为反应物质，在不断的变温过程中完成DNA的复制。
PCR反应通常包括变性、退火和延伸三个主要步骤，每个步骤的温度和时间都经过精确控制，以确保DNA的扩增反应能够高效进行。
在PCR反应中，引物（primers）是起关键作用的短链DNA片段，它们与目标DNA序列的末端互补结合，作为DNA聚合酶的起始点。
通过引物的引导，DNA聚合酶能够沿着DNA链逐渐合成新的DNA链，从而实现DNA的扩增。
此外，PCR反应还需要适当的DNA聚合酶，常用的是来自热液泛素菌（Taq polymerase）的酶。
PCR技术在分子生物学研究中具有广泛的应用，如基因克隆、序列分析、基因表达分析等领域。
通过PCR技术，科研人员能够快速高效地复制目标DNA序列，并进行后续的分析和研究。
此外，PCR技术还被广泛用于医学诊断、法医学鉴定和生物工程等领域，为科学研究和技术发展提供了有力的支持。
与PCR技术相关的DNA扩增技术在现代生物学研究中扮演着重要的角色。
DNA扩增技术能够加速DNA序列的获取和分析过程，为科学家提供了更多的研究资源和方法。
在基因组学、遗传学、疾病诊断等领域，DNA扩增技术都发挥着至关重要的作用，推动了生命科学领域的发展。
总的来说，PCR技术作为DNA扩增技术的主要方法，已经成为生物学研究中不可或缺的重要工具。
其高效、精准的特点使得科学家能够更好地理解生命的奥秘，推动了科学技术的发展和应用。
PCR与DNA扩增技术的不断演进和应用将为生物学领域带来更多的机遇和挑战，为人类社会的发展和进步作出更大的贡献。
很实用的pcr操作方法PCR （聚合酶链式反应）是一种用于在实验室中扩增DNA序列的技术。
它是迄今为止最常用、最有效的DNA分析方法之一。
PCR可以在短短几个小时内扩增出数百万份DNA复制品，这对于基因工程、基因组学研究和医学诊断具有重要意义。
以下是一种常用的PCR操作方法：1. 制备反应混合液：将PCR反应所需的试剂和模板DNA加入到一个无核酸酶的管或微孔板中。
一般反应液组分包括：扩增缓冲液（含有聚合酶反应所需的离子和缓冲剂）、两个引物（用于扩增所需的DNA片段）、聚合酶（用于DNA复制）和模板DNA（待扩增的目标DNA序列）。
2. 混合反应液：使用微量吸管或移液器轻轻混合反应液，确保所有试剂均匀分布。
3. 放置反应液：将反应液置于热循环仪（PCR仪）中，该仪器能够精确控制反应液的温度。
根据所需的扩增程序，设置温度周期。
4. 前变性：将反应液加热至95，这会使DNA解开成两个单链。
此步骤通常需要数分钟，以确保所有的DNA双链都被解开。
5. 扩增循环：在扩增循环中，每个循环都包含三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤：将反应液加热至较高温度（通常为94-98），使DNA双链解开成两个单链。
退火步骤：将反应液降温至两个引物结合的最佳温度，使引物与目标DNA序列特异性结合。
延伸步骤：将反应液加热至较低温度（通常为72），使聚合酶在引物上合成新的DNA链。
6. 扩增周期：重复扩增循环，通常需要20-40个循环，以扩增目标DNA序列。
7. 扩增结束：最后一个扩增周期完成后，将反应液保持在72的延伸温度下，以确保最后一个DNA链的完整合成。
8. 储存PCR产物：将PCR产物保存在低温下，通常为-20或更低的温度。
这样可以防止PCR产物的降解和污染。
需要注意的是，PCR是一种高度敏感的技术，可能会受到有机体DNA和其他环境DNA的污染。
为了避免假阳性结果，必须采取有效的实验室措施来防止污染。
这包括使用无核酸酶的操作区域、每次PCR反应前进行模板准备和混合的准备区域等。
PCR基本操作包括哪些步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
它在基因工程、药物研发、疾病诊断等领域具有广泛的应用。
PCR基本操作包括以下几个步骤：1. DNA样本处理与提取PCR反应所需的DNA样本可以从细胞或组织中提取获得。
常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐析法、商用DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要进行定量和质量检测，确保PCR反应的可重复性和准确性。
2. 反应体系准备PCR反应体系主要由DNA模板、引物、缩合酶、反应缓冲液和可调节的离子浓度组成。
根据实验需要，可以添加特定的辅助试剂、核苷酸等。
反应体系的设计和优化对PCR反应的灵敏度和特异性有重要影响。
3. PCR反应程序设置PCR反应需要按照一定的温度和时间控制，以使DNA片段在不同温度区间中完成变性、退火和延伸等步骤。
一般情况下，PCR反应的程序包括初始变性、循环反应和最终延伸等阶段。
4. PCR反应条件优化PCR反应的条件优化对于提高扩增效率、特异性和产物纯度至关重要。
优化参数包括反应体系组分、引物浓度、反应温度、扩增周期数等。
通过优化反应条件，可以解决一些常见问题，如非特异性扩增、抑制性物质的影响等。
5. PCR产物分析与检测PCR产物可通过凝胶电泳、定量PCR、测序等方法进行分析和检测。
凝胶电泳是常用的PCR产物分析方法，可以确定目标DNA片段的大小和纯度。
定量PCR则可以精确测量DNA模板的初始量或PCR产物的多少。
通过以上几个步骤，PCR技术可以在较短的时间内扩增目标DNA片段，从而满足各种科研和应用需求。
PCR反应的成功需要仔细的实验操作和条件优化，以保证结果的准确性和可靠性。
分子植物育种实验室方法(二)M ETHODS IN LAB OF M OLECULAR PLAN T BREEDING(2)PCR技术及实用方法郑景生1,2 吕蓓11海南省农作物分子育种重点实验室,三亚,5720252福建省农业科学院稻麦研究所,福州,350019摘要本文系统介绍了PCR技术的原理,反应组分、反应程序及PCR产物的电泳检测方法。
这些实用的PCR方法大都来源于国内外一些著名的实验室并经海南省农作物分子育种重点实验室改进而成。
这些方法作为分子植物育种实验室的技术平台具有非常好的实用性,能满足常规的分子生物学及生物工程技术研究的要求。
关键词PCR技术,分子植物育种PCR Technique and its Practical MethodsZheng Jingsheng1,2 LǜBei11Hainan Provincial Key Laboratory of Crop M olecular Breeding,Sanya,5720252The Institute of Rice&w heat,Fujian Academy of Agricaltural S ciences,Fuzhou,350019ABST RACTThis paper introduced PC R principles,reaction components,reaction prog rams and electrophoresis detecting techniques.All of the practical protocols were derived from m any famous domestic and international laboratories and modified by H ainan Provincial Key Laboratory of Crop Molecular Breeding(HiCM BL).It has more beneficial to adapt those protocols as technology platfo rm in the lab of molecular plant breeding due to its good practicability,which could meet the demands of the researches in fields of molecular biology and biotechnology.K EYWO RDSPCR,Practical method,M olecular plant breeding1前言PCR,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PC R)是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。
这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特点,实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增,可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。
PCR技术操作简便、结果可靠,并被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析,对分子生物学的发分子植物育种,2003年,第1卷,第3期,第381—394页M olecular P lant Breeding,2003,V ol.1,No.3,381—394 展产生了革命性的影响。
发明人Kary Banks M ulis 也因此荣获1994年度诺贝尔化学奖。
PCR 技术的原理是:DNA 聚合酶以单链DNA 为模板,借助一小段双链DNA 来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。
在适宜的温度和环境下,DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3'-OH 末端,并以此为起始点,沿模板5'※3'方向延伸,合成一条新的DNA 互补链。
PC R 反应的基本成分包括:模板DNA (待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸(dN TPs )、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。
PCR 反应中,通过双链DNA 的高温变性(denaturation )、引物与模板的低温退火(anneal -ing )和适温延伸(extension )这三步反应反复循环。
每一循环中所合成的新链,又都可作为下一循环中的模板。
PCR 合成的特定的DNA 序列产量随着循环次数呈指数增加,从而达到迅速大量扩增的目的。
2PCR 反应基本成分2.1模板DNAPCR 反应的模板可以是单链或双链DNA ,可以是基因组DNA 或cDNA ,mRNA 也可作为PCR 的模板,只需用逆转录酶把m RNA 逆转录为cD -NA 即可。
由于PCR 反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定,模板DNA 不需要高度纯化,但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、能结合DNA 的蛋白质及多糖类物质的污染。
选用纯化的DNA 做模板,可增加模板分子的浓度,除去可能抑制PCR 反应的杂质如SDS 会严重抑制Taq DNA 聚合酶的活性,可显著提高PCR 扩增的有效性。
通常,模板DNA 保存于10mmol /L Tris -HCl (pH7.6)、0.1mmol /L EDTA (pH8.0)缓冲液中。
PCR 所需模板DNA 的量极微(通常在纳克级范围内),通常适宜的模板DNA 浓度为30-50ng ,不到1纳克的基因组DNA 序列就足以用来进行PCR 分析,甚至用1个DNA 分子就能扩增出特定的DNA 序列。
利用PC R 技术可以从石蜡包埋40多年的宫颈癌活检组织中检测出人乳头瘤病毒(HPV )DNA ,可以用多年前的血斑分析苯丙酮尿症,甚至从几千年的埃及木乃伊中分离出来的DNA 也可用作PCR 反应的模板。
2.2引物PCR 引物是一段与待扩增的目标DNA 序列侧翼片段互补的寡核苷酸片段,长度大多为10-30个碱基。
通常,一对引物包含5'端与正义链互补的寡核苷酸片段和3'端与反义链互补的寡核苷酸片段,这两个寡核苷酸片段在模板DNA 上的结合位置之间的距离决定PCR 扩增片段的长度。
根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸序列在人类基因组中可能出现的概率为1次。
因此,只要引物不少于16个核苷酸,就能保证PC R 扩增序列的特异性。
引物过长往往会降低其与模板的杂交效率,从而减低PCR 的反应效率。
PCR 反应成功的关键是设计最佳的引物。
引物设计的先决条件是与引物结合的靶DNA 序列必须是已知的,与两个引物结合的序列之间的靶DNA 序列则未必清楚。
设计引物时应尽可能选择碱基随机分布的序列,尽量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他异常序列。
两个引物中G +C 碱基对的百分比(G +C %)应尽量相似,若待扩增序列中GC 含量已知时,引物的GC 含量则应与其类似。
一般情况下,设计引物时,G +C 碱基对含量以40%-60%为佳,解链温度(melting temperature ,Tm )高于55℃。
避免引物自身形成发夹结构等二级结构,尤其是。
两个引物之间不应存在互补序列,尤其是在引物的3'末端,即使无法避免,其3'端的互补碱基也不能多于2个,以减少“引物二聚体”的形成。
否则会影响靶DNA 序列的扩增。
在合成新链时,DNA 聚合酶将单核苷酸添加到引物的3'末端,因此引物3'端的5-6个碱基与靶DNA 片段的配对必须精确、严格。
简并引物是由多种寡核苷酸片段组成的混合物,彼此间有一个或数个核苷酸差异。
简并引物的设计是通过对氨基酸序列或对相关基因的同源序列的推测进行的(陆德如等,2002)。
通常一条引物中的简并碱基不能超过4处,简并碱基数过多,会造成反应体系中有效引物量相对较少,而增加引物的使用量,易引起非特异性扩增。
简并引物与模板错配产生的非特异扩增可通过提高退火温度或“热起动”方法来克服。
由于引物设计涉及的因素较多,因此常场借助PCR 引物设计软件如PCGENE 、DNAM an 进行辅助设计,然后由专业的生物技术公司用DNA 合382 分子植物育种M olecular Plant Breeding成仪合成。
合成的寡核苷酸引物一般用层析法或聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化,纯化的引物在25%乙腈溶液中4℃下短暂保存或在-20℃下中长期保存,冻干后则可保存1-2年以上。
在PCR反应中,引物的适宜浓度为0.1-1 (mol/L。
引物浓度过高,容易形成非特异性扩增,引物浓度过低,不足以完成30个循环,降低PCR 的产量。
通常模板DNA的量较多或高度复杂DNA(High complexity DNA)如人类基因组DNA 作模板时,引物浓度应低一些;模板DNA的量较少或低度复杂DNA(Low complexity DNA)如质粒DNA作模板时,引物浓度应高一些。
在分子植物育种实验室中常用的RAPD引物、ISS R引物及SS R引物等一些通用引物均可向专业的生化与分子生物学试剂公司购买,如Promeg a 公司或Invitrogen公司等。
2.3dNTPsdNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dT TP)是PCR反应中靶DNA序列扩增的原料。
在PC R反应中每种脱氧核苷三磷酸的浓度以50-200μmol/ L为宜,不能低于10-15μmol/L。
浓度过高易引起非特异性PCR产物,当dNTP浓度高于50m mol/L时还会抑制Taq酶的活性;浓度过低则影响扩增产量。
4种dN TP的摩尔浓度应相同,不平衡的浓度会导致碱基错配率上升,降低合成速度,导致反应过早终止。
在100μl的标准反应体系中,浓度50μmol/L和200μmol/L的dNTP就足以分别合成6.5μg和25μg DNA。
本实验室常用的dN TPs购自Promega公司。
贮存液的浓度为25m mol/l dNTPs混合液,其配制方法是将购自厂商的4种核苷酸等量混合。
2.4DNA聚合酶最初的DNA聚合酶是从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶I的Klenow片段。
该片段具有聚合酶活性和3'※5'外切核酸酶活性,能识别和消除错配的引物末端,以校正复制过程中错配的核苷酸。
但Klenow片段对热敏感,DNA变性温度即可使酶失活,因此在PCR的变性步骤后都必须重新加聚合酶,造成PCR技术操作十分烦琐、耗时费力、反应低效及费用增加。
后来,从美国黄石国家公园的温泉中发现的嗜热菌—水生栖热菌(Therm us aquatic s,Taq)中分离出了分子量为60-68kDa,比活性为2,000 -8,000U/m g的DNA聚合酶。
