耐高温柠檬酸菌种驯化及筛选

发酵工厂菌种选育的具体方法与实验设计[1]食品发酵与酿造工艺学题目：发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计年级：xxxx级专业：食品科学与工程姓名：xxx学号：xxxxxxx柠檬酸的菌种选育的具体方法与实验设计微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。

而自然界现有的菌种由于其产量较低，不能直接用于生产，目前，发酵工业生产中所使用的菌种，都是经过人工选育的优良菌种。

本篇以柠檬酸的菌种选育为例，阐述发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计。

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性能、化学性能、衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸。

我国的柠檬酸产业，较早地进入了国际市场，经过多年的努力和奋斗已成为世界第一的生产和出口大国。

特别是经历了近几年的竞争与整合，全行业的面貌大为改观。

所以柠檬酸的菌种选育对于整个行业和国家来说都尤为重要。

一．柠檬酸的菌种的具体选育方法1.取样：从腐烂水果上分离出一株柠檬酸产生菌——黑曲霉。

2.培养基的制备：2.1 分离培养基(%)：甘薯粉15%，柠檬酸l0%分装在试管内，1公斤/厘米2压力灭菌20分钟。

2.2 生长培养基：4°Be’麦芽汁，2%琼脂。

l公斤/厘米2压力灭菌15分钟。

2.3 种子培养基(%)：甘薯粉8%，献皮l%。

每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米2压力灭菌30分钟。

2.4 发酵培养基：12%甘薯粉，每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米2压力灭菌30分钟。

3.菌种培养方法：采用迥转摇床，193转/分，偏心距25毫米，31℃振荡培养，菌丝接种，接种量5%(v/v)，培养5天。

4.菌种的分离与筛选：采用酸性滤纸法，把少许试样混入分离培养基中，摇匀，倾入无菌培养皿内(内有2—3层滤纸做支持物)，31℃培养4—5天，把长出的单菌落挑入生长培养基斜面上，31℃培养4—5天，即可见到抱子。

柠檬酸高产菌株的选育222011********* 刘亚超 2011级生物技术关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。

为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。

目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。

本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。

引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。

柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。

所以可以起抗凝血作用。

柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。

所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。

1.材料与方法1.1 材料1.1.1菌种以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。

1.1.2培养基分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。

1.1.3 试剂及仪器3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。

1.2 方法1.2.1 菌株的分离纯化用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。

1.2.2 初筛用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。

取各个不同梯度的孢子悬液1 mL注人2％淀粉查氏培养基平板中涂布，28℃，培养3 d-KI试剂，测量菌落产生的透明圈大小并记录下数据。

专利名称：一株耐高温柠檬酸生产菌株专利类型：发明专利
发明人：黄和,李霜,左静,徐晴,满云
申请号：CN201110360406.7
申请日：20111115
公开号：CN102352322A
公开日：
20120215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物工程技术领域，涉及一株耐高温柠檬酸生产菌株。

本发明还涉及获得该菌株的诱变筛选方法及应用方法。

本发明的菌株分类命名为zjs-8，保藏号为CCTCCNO：M2011359。

得到该菌株的方法是采用离子束注入诱变处理出发菌株，然后将处理后的菌液涂布于含溴甲酚绿的筛选平板上高温培养，挑取变色圈与菌落直径比值较大的单菌落进行高温发酵产柠檬酸。

采用此方法筛选得到的菌株可耐受42℃的高温，且在高温条件下遗传性状稳定，产酸水平较高，这对柠檬酸工业的节能生产提供了一条可行的道路。

申请人：南京工业大学
地址：210009 江苏省南京市新模范马路5号南京科技广场A座1309室
国籍：CN
代理机构：江苏致邦律师事务所
代理人：樊文红
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降解柠檬酸的酵母菌的筛选及降酸特性研究一、研究内容和意义摘要柠檬酸是柑橘等水果中的主要有机酸，在果汁、果酒生产中是影响其风味和口感的主要物质，由于一些水果中柠檬酸含量过高而影响了果汁、果酒的口感。

本项目拟筛选一株降解果汁中柠檬酸的酵母菌，通过生物降解的方法来适度降低这些果汁中的含量偏高的柠檬酸。

本项目的研究对进行工业化生产获得风味和口感俱佳的果汁、果酒具有现实意义。

二、主题词柠檬酸；酵母菌；选育；降酸三、立论依据（包括项目的研究意义及国内外现状分析）果酒的生产是利用新鲜的水果为原料，利用野生的或人工添加酵母菌来分解糖分，产生酒精及其他副产物。

伴随着酒精和副产物的产生，果酒内部发生一系列复杂的生化反应，最终赋予果酒独特的风味及色泽。

在生产中为了达到酿造高质量的果酒。

果酒中的酸有原料带来的，如葡萄中的酒石酸，苹果中的苹果酸，杨梅中的柠檬酸等；也有发酵过程中产生的，如醋酸，丁酸，乳酸，琥珀酸等。

酒中含酸量如果适当，酒的滋味就醇厚、协调、适口。

反之则差。

同时，酸对防止杂菌的繁殖也有一定的作用。

生产中用于表示果酒含酸量的指标有总酸和挥发酸。

总酸，即成酸性反应的物质总含量，与果酒的风味有很大关系（果酒一般总酸量为0.5-0.8克／100毫升）。

挥发酸，是指随着水蒸气蒸发的一些酸类，实践中以醋酸计算（果酒中的挥发酸不得高于0.15克/100毫升）。

适量的有机酸可以赋予果酒醇厚感和清爽感，可以抑制病菌的活动，另外酸还可以溶解色素物质，使果酒的颜色更加美丽，所以说有机酸是影响果酒感官特性的重要指标之一。

本项目侧重适度降低这些果酒、果汁中含量偏高的柠檬酸。

通常的降酸方法包括化学降酸法和生物降酸法。

化学降酸是在果汁或酒液中加入化学试剂(如碳酸钙、碳酸氢钾、酒石酸钾和双钙盐等)，其操作简单易行，降酸效果明显，但其化学反应往往会影响口感和酒液的色泽，同时由于金属离子的大量溶入，可能会带来酒液的不稳定，如失光、混浊等。

这些化学试剂一般为弱酸盐．它们与酒样中的强酸盐发生化学反应，置换出强酸，从而达到降酸的目的。

产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选一、实验目的1.了解和掌握柠檬酸发酵菌种黑曲霉的菌种特性和分离方法。

2.初步掌握菌种筛选方法设计。

二、实验原理柠檬酸主要用于食品工业，作为酸味料广泛用于饮料、果酱、水果糖、冰淇淋等，还用于制药、化工、塑料等工业。

能用于生产柠檬酸的菌种有毛霉、青霉、曲霉，其中尤以黑曲霉产生柠檬酸的能力最强，且能利用多种碳源，是生产中最常见的菌种。

黑曲霉广泛存在于自然环境中，空气、水、土壤中都有该菌存在。

本实验根据野生柠檬酸发酵菌种耐酸性的特点，从土壤中分离纯化以获得柠檬酸发酵的野生菌种。

三、仪器与试剂高压灭菌锅、恒温培养箱、干燥箱、超净工作台、恒温摇床、培养皿、三角瓶、烧杯、接种棒、试管、量筒、滤纸、酒精灯等。

四、方法与步骤指示剂法（变色圈法）（一）菌种分离平板采用察氏-多氏琼脂培养基加入0.04%溴甲酚绿：蔗糖30g NaNO3 2g MgSO4·7H2O 0.5gKH2PO4 1g KCl O.5g FeSO4·7H2O 0.01g溴甲酚绿0.4g 琼脂20g 蒸馏水1000ml PH自然。

土壤浸出液稀释以后，涂在上述培养基制成的平板上，于30℃培养。

由于产酸，菌落周围会出现黄色变色圈。

在变色圈还未互相连成一片时，测量变色圈直径（C）与菌落直径（H）之比。

取C/H比例较大者，并且具有黑曲霉特征的菌落挑出接到斜面上（点接法，点接在斜面中部偏下方），筛选时要考虑菌种耐高温、抗杂菌污染及原料。

（二）初筛一般初筛培养基可进行如下选择和设计（1）薯干粉直接发酵：25%薯干粉蒸煮后，用液化型淀粉酶（如枯草杆菌淀粉酶）液化，升温灭酶灭菌后，加入α-萘粉1mg/1或氯化十六烷基吡啶胺1mg/1.（2）水解糖发酵：水解糖稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO32g/1,MgSO4·7H2O O.5g/1，一氟乙酸钠50mg/1。

（3）葡萄糖母液发酵：母液稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO31～2g/1，一氟乙酸钠50mg/1。

耐热酶菌株的筛选及高温培养时的适应机制研究随着全球气候的变化和人类活动的加速，环境中对生物的温度要求越来越高。

在这种情况下，研究和利用耐热酶菌株的意义变得越来越重要。

耐热酶菌株可以在高温的情况下进行生化反应，具有重要的产业应用价值。

本文将从耐热酶菌株的筛选和高温培养的适应机制两个方面进行探讨。

一、耐热酶菌株的筛选耐热酶菌株的筛选一般是通过在高温环境下筛选具有生物活性的微生物来实现的。

这个过程需要有高温环境条件和适当的培养基。

在这个基础上，通过使用一系列的鉴定方法，比如酶活性鉴定、形态学鉴定、分子生物学鉴定等方式，从中筛选出适合产业利用的耐热酶菌株。

例如，糖化酶和聚合酶等制药和食品加工领域中常用的酶，需要在高温条件下稳定地表达，所以从环境样品中筛选出能够高效并稳定表达这些酶的耐热酶菌株，对于生产和质量保证具有非常重要的意义。

二、高温培养时的适应机制研究生物在不同的温度下生活和生长，其适应机制有所不同。

在高温环境下培养的耐热酶菌株，可能形成了一套生理适应机制，以应对高温环境下的生存和生长。

一般而言，高温环境下导致蛋白质和核酸的结构变化，从而导致这些生物分子无法正常地表达和产生生物活性。

而耐热酶菌株需要克服这些障碍，通过特殊的适应机制来保证自身的生长和繁殖。

研究表明，耐热酶菌株中存在大量螺旋形、伸展型、超长主链等具有特殊结构的蛋白质，这些蛋白质具有更高的耐温性和生物催化活性。

此外，在高温下，耐热酶菌株的细胞膜中富含高不饱和度的脂肪酸和胆固醇，这些组分具有保护细胞膜完整性的作用。

另外，耐热酶菌株的细胞壁结构也发生改变，增加了多糖和蛋白质的含量，从而维持细胞壁的完整性和稳定性。

同时，耐热酶菌株还可以利用某些耐受热性蛋白质的辅助作用，增加细胞内的抗氧化物质含量，保证生物体内氧化还原平衡状态，从而维持生物体内的正常代谢功能。

综上，耐热酶菌株的筛选和高温培养时的适应机制研究，是生物技术与产业应用领域中的热点问题，相关的研究工作具有非常重要的科学价值和实际意义。

耐高温耐高酸柠檬酸菌种驯化及筛选【摘要】：选取发酵良好的出发菌株，通过高温和高酸驯化及筛选，得到2株耐37℃高温、耐高酸30%、发酵性能优于原柠檬酸菌种Co827黑曲霉。

【关键词】：柠檬酸黑曲霉；耐高温高酸菌株；筛选【abstract 】: the fermentation of good start strains, through the high temperature and high acid domestication and screening, get two strains 37 ℃high temperature resistance, resistance to high acid 30% better performance than the original citric acid, fermentation Co827 aspergillus species.【keywords 】: citric acid aspergillus; High temperature resistant strains of the high acid; screening前言：柠檬酸是一种用途广泛对环境没有任何破坏作用的无色晶体，在食品和饮料工业中作为调味剂、保鲜剂、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂。

为了提高菌种在高酸环境下酶的活性，需要对菌种进行耐高酸驯化。

柠檬酸深层通风发酵工艺在夏季高温季节，要控温在30℃-33℃，需采取一系列降温措施，为减少降温带来的麻烦和费用，采用耐高温柠檬酸发酵是行之有效的措施之一。

以黑曲霉Co827为出发菌种，从37℃高温发酵液中分离菌种，经酸性驯化优筛得到2株耐高温高酸、产酸高、转化率高的优良菌株。

1材料与方法1.1材料1.1.1样品高温发酵液分离出的菌株1.1.2培养基富集驯化培养基：80BX-150BX麦芽汁100ml，pH值自然，0.1MPa灭菌25min-30min;分离培养基：50BX-80BX麦芽汁100ml，琼脂2g，30%柠檬酸，0.1MPa，灭菌25min-30min，制成平板备用；摇瓶培养基：按参考文献[2]方法配制。

耐高温乳酸菌的分离与鉴定耐高温乳酸菌的分离与鉴定耐高温乳酸菌的分离与鉴定【1】【摘要】目的：本实验从不同地方采集的青贮玉米饲料、果渣、牛奶、新鲜的泡菜汁等样品中筛选耐高温乳酸菌。

方法：通过初筛、复筛，获得一株耐高温且产酸能力较强的菌株L1;依据伯杰氏系统细菌学手册和乳酸菌分类鉴定的标准和描述，对其进行了生理生化特性鉴定;通过单因素试验和正交试验确定菌株L1的最佳发酵条件。

结果：确定其为乳杆菌属德氏乳杆菌;最佳增殖培养基组分为：玉米粉16%+麸皮5%;在α-淀粉酶(5 U/g玉米粉、90 ℃、30 min)和糖化酶(150 U/g玉米粉、55 ℃、2 h～3 h)酶解作用下，最佳发酵条件为：发酵温度60 ℃，发酵时间36 h，pH值3.5。

结论：经过初筛、复筛获得一株耐高温菌株L1，通过糖发酵等生理生化试验、正交试验鉴定，最后确定此菌株为乳杆菌属德氏乳杆菌(LacotobaciLLus deLbbruecki)。

【关键词】耐高温乳酸菌;分离;鉴定乳酸菌(Lactobacillus)是一类能从可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)产生大量乳酸的细菌的统称[1]。

由于乳酸菌具有糖利用率高、发酵液中纯度高、副产物少，使其在乳酸工业中占有重要地位[2]。

乳酸菌在食品发酵、青贮饲料、堆肥生产、医药行业等众多领域有着广泛的应用研究[3，4]，而在众多固态发酵领域中一个难以解决的问题是固态发酵中高温迅速产生对乳酸菌的杀灭作用，因而选育耐高温菌株具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。

本研究从青贮饲料、果渣、泡菜、牛奶中分离高温乳酸菌，并对其发酵条件的优化进行了初步研究。

1 材料与方法1.1 实验材料乳酸菌：从上海光明乳业金山牧场提供的青贮玉米饲料、陕西海盛果汁厂提供的果渣、山东牟平安得利果汁厂提供的果渣、西安农贸市场购得的新鲜泡菜汁、上海光明乳业提供的牛奶中进行分离，将收集的样品带回实验室置于4 ℃冰箱保存备用。

标准菌株：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbbruecki) JCM 1022、嗜酸乳杆菌(Lacidophilus) ATCC 3456、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IFO 13957,由陕西微生物研究所提供。