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分子生物学大实验习题及解答一、名词解释1、genome；2、基因芯片；3、持家基因；4、Operon；5、感受态细胞；6、逆转录酶；7、PCR技术；8、转化；9、重组DNA技术；10、基因沉默；11、hnRNA；12、复制子；13、反义RNA；14、衰减子；15、拟基因；16、RNA编辑；17、颠换；18、拓扑异构酶；19、变性；20、转座子二、基础理论单项选择题1、DNA连接酶的作用为（）A、合成RNA引物B、将双螺旋解链C、去除引物、填补空隙D、使双螺旋DNA链缺口的两个末端连接2、DNA复制中RNA引物的主要作用是( )。
A、引导合成冈奇片段B、作为合成冈奇片段的模板C、为DNA合成原料dNTP 提供附着点D、激活DNA聚合酶3、下列哪一种蛋白不是组蛋白的成分（）A、 H1B、H2A 、H2BC、 H3、H4D、 H54、DNA的变性：（）A、包括双螺旋的解旋B、可以由低温产生C、是可逆的D、是磷酸二酯键的断裂5、转录需要的原料是:（）A、 dNTPB、 dNDPC、 dNMPD、 NTP6、在原核生物复制子中以下哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核甘酸：A、DNA聚合酶ⅢB、 DNA聚合酶ⅡC、DNA聚合酶ⅠD、外切核酸酶MFl7、下真核生物复制起始点的特征包括（）A、富含GC区B、富含AT区C、 Z DNAD、无明显特征8、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（）A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同B、分子大小不同C、分子极性不同D、溶解度不同9、DNA复制时不需要以下哪种酶？（）A、 DNA指导的DNA聚合酶B、RNA指导的DNA聚合酶C、拓扑异构酶D、连接酶10、1、证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是：肺炎链球菌在老鼠体内的毒性和T2噬菌体感染大肠杆菌。
这两个实验中主要的论点证据是：（）A、从被感染的生物体内重新分离得到DNA，作为疾病的致病剂B、DNA突变导致毒性丧失C、生物体吸收的外源DNA（而并非蛋白质）改变了其遗传潜能D、DNA是不能在生物体间转移的，因此它一定是一种非常保守的分子11、利用自己的位点专一重组酶把自己从寄主基因组中的一个地方移到另一个地方的遗传元件叫（）A、启动子B、转座子C、T-DNAD、顺反子12、原核DNA合成酶中（）的主要功能是合成前导链和冈崎片段A、DNA聚合酶ⅠB、DNA聚合酶ⅡC、DNA聚合酶ⅢD、引物酶13、在基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒以便于重组和筛选。
现代分子生物学资料第一章绪论一、三大发现：列文·虎克的细胞学说、焦耳用实验确立的能量守恒定律、达尔文的进化论。
二、分子生物学定义：从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。
三、分子生物学研究内容：1、DNA重组技术（基因工程） 2、基因的表达调控 3、生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究四、DNA发现的几个实验：美国科学家AVERY用S型和R型致病菌侵染小鼠的实验、美国科学家HERSHEY 在1952年从事的同位素分子标记法噬菌体侵染细菌的试验。
第二章染色体与DNA一、染色体的结构和组成原核生物：DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。
真核生物染色体有蛋白质和DNA组成，蛋白质包括组蛋白（H1，H2A、H2B、H3、H4）和非组蛋白。
2、C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。
C值往往与种系的进化的复杂程度不一致，某些低等生物却有较大的C值，这就是著名的“C值反常现象”。
3、DNA的一级结构：指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序， DNA序列是这一概念的简称。
4、双螺旋的基本特点：双链反向平行配对而成；脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA骨架，碱基排在内侧；内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：T，C：G）。
5、DNA 的二级结构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。
是有Watson和Crick在1953年共同发现的。
分类：右手螺旋（是其通常存在形式）：A-DNA，B-DNA。
左手螺旋：Z-DNA。
6、超螺旋：DNA双螺旋结构中，一般每转一圈有十个核苷酸对，双螺旋总处于能量最低状态。
正常DNA双螺旋额外的多转或少转几圈，就会出现双螺旋空间结构改变，在DNA分子中形成额外张力，若此时DNA分子的末端是固定的或是环状分子，双联不能自由转动，额外的张力就不能释放而导致DNA分子内部院子空间位置的重排，造成扭曲，即出现超螺旋结构。
生物化学及分子生物学实验考试-图文一、实验原理步骤：1、分子克隆总流程：分子克隆：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。
常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
流程：（1）带有目的基因的DNA片段的获得——PCR引物设计，PCR获得。
（2）重组DNA分子的构建——与载体酶切连接。
（3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选——转化，培养，筛选（4）检测——菌落PCR检测，粗提质粒检测，酶切检测，精提质粒测序。
2、质粒DNA的提取及鉴定一一碱裂解法原理：根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
在pH12.0-12.5,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。
当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。
步骤：1、细菌培养和收集①将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37°C振荡培养过夜。
（已完成）②取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中，10000rpm离心lmin,吸去培养液。
2、细菌裂解及质粒的提取③将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。
④加200ul溶液II（新鲜配制），盖紧管盖，轻轻混匀内容物，将离心管放冰上5min。
⑤加150ul溶液III（冰上预冷），盖紧管口，轻轻颠倒数次使混匀。
冰上放置10min。
⑥12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作好标记）中。
分子生物物理学考试试题一、选择题（每题4分，共40分）1. DNA的主要功能是：A. 转录和翻译B. 存储和传递遗传信息C. 合成和降解蛋白质D. 维持细胞结构2. 下列哪项属于非编码RNA？A. tRNAB. mRNAC. rRNAD. miRNA3. 以下哪个方法可用于测定蛋白质二级结构？A. 质谱B. 核磁共振C. 紫外吸收光谱D. X射线晶体学4. 相对于无电阻的蠕虫状链模型，DNA的结构更类似于：A. 双螺旋B. 电弧形状C. 平行线D. 多股绳5. 下列哪个组分不是核磁共振谱仪的基本部件？A. 磁体B. 检测线圈C. 高压发生器D. RF发射线圈6. 具有自旋并在磁场中有预cess的核磁共振谱法是A. 13C NMRB. 31P NMRC. 19F NMRD. 1H NMR7. DNA双螺旋结构中的碱基对通过什么方式相互衔接？A. 氢键B. 离子键C. 范德华力D. 共价键8. 以下哪项不是PCR反应的主要组分？A. DNA模板B. 引物C. DNA聚合酶D. DNA热稳定酶9. 蛋白质的一级结构由什么决定？A. 氨基酸序列B. α-螺旋和β-折叠C. 两个多肽链的折叠方式D. 磁性相互作用10. 蛋白质的折叠是一个自发的过程，受到以下因素的影响，除了：A. 温度B. pH值C. 溶剂条件D. 盐浓度二、填空题（每题6分，共30分）1. DNA的遗传密码是由___个核苷酸组成的。
2. 蛋白质的结构可以分为___、___和___三个层次。
3. RNA聚合酶经过____、____和____三个步骤实现RNA的转录。
4. 在蛋白质的翻译过程中，mRNA上的起始密码子是___。
5. 蛋白质的折叠通常在细胞内的___环境下完成。
三、简答题（每题15分，共45分）1. 请简要描述PCR技术的原理和应用领域。
2. 什么是核磁共振？简述核磁共振的原理和在分子生物物理学领域中的应用。
3. 简述蛋白质的起源和功能。
知到网课答案分子生物学实验满分考试答案问：网络交友时应注意 ____。
( )答：不暴露身份和个人资料信息问：1962年，蕾切尔・卡逊出版了下列哪本书？它以寓言开头向读者描绘了一个美丽村庄的突变，从陆地到海洋，从海洋到天空，全方位地揭示了化学农药的危害，“再也没有鸟儿歌唱”，生活何处探寻美好？答：《寂静的春天》问：《休伦港宣言》是美国新左派的最后一篇宣言。
（）答：×问：1960年代的运动对后世的影响方式是（）。
答：D问：历史上的大多数知识论者都是内在主义者。
（）答：√问：（）就是：把原来的生产要素重新组合，改变其产业功能，以满足市场需求，从而创造利润。
答：创新问：（）就是“领导理论”。
答：领导有效性理论问：（）就是对于广告决策、广告实施、广告效果检测的全过程做预先的考虑与设想，基础是市场调查。
答：广告策划问：（）就是管理浮动。
答：肮脏浮动问：（）就是国家军队事务处于没有危险的客观状态，也就是国家的军事存在、军事力量和军事活动等不受威胁、挑战和打击、破坏的客观状态。
答：军事安全问：影响卟啉环对氧的携带功能是镰刀型细胞贫血症的主要特征。
（）答：√问：“威加海内兮归故乡”中“加”的意思是通“家”。
()答：×问：()使人们肯定地相信遗传物质不是蛋白质而是DNA。
答：艾弗里问：发现核酸里包含有()种核苷酸的人是莱文。
答：4种问：白马是否马？这是战国时期争论的学术命题之一。
“白马非马”是谁的观点？答：公孙龙问：农业时代的生产要素是土地、劳动力、资本三要素；工业时代增了技术要素，包括技术、资金、土地、劳动力四要素；信息时代又增加了信息要素，形成信息、技术、资金、土地、劳动力五大农业生产要素。
（）答：正确问：农业时代的战争中战场上信息传递的手段有（）答：金鼓旌旗烽火台问：农业试验中应用最多的平均数是（）答：算术平均数问：农业视觉图像获取的输入设备不包括（）。
答：绘图仪问：农业是满足人类、动物和植物生产需要，对自然植物利用和（）所进行的土地耕作及相关活动。
分子生物学实验理论考试(总7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--2012-2013学年第二学期分子生物实验考试题库1、PCR原理是什么？答：PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。
它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定。
引物就是与待扩增DNA片段两侧互补的寡核苷酸。
双链DNA是在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链DNA分子（变性），两引物分别与两条DNA的两侧序列特异复性，在适宜条件下，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸，在引物的引导下，按5'→3'方向复制互补DNA，即引物的延伸。
在适宜的条件下，这种热变性→复性→延伸的过程不断循环重复，前一个循环的产物DNA可作为后一个循环的模板DNA参与DNA合成，使产物DNA的量按2^n方式扩增。
2、PCR一般体系应加入哪些试剂？答：10*PCR缓冲液（含Mg+）、模板DNA、四种dNTP、一对引物、耐热Taq聚合酶。
3、PCR防止其它DNA污染，应注意哪些问题？答：标本放置时密封要严避免溢于容器外，容器要清洁避免造成相互间交叉污染；移液器使用要规范避免污标本间污染;无菌工作台操作，避免气体中有杂菌。
4、影响PCR产物产量的因素主要有哪些？答：引物、酶的种类及浓度、dNTP的质量（优劣）与浓度、模板核酸的量与纯化程度、Mg2+浓度、温度与时间、循环次数。
5、引物设计应注意哪些问题？答：①引物长度不宜过长20bp左右较佳；②引物扩增片段的长度以200-500为宜；③引物碱基的中G+C的含量应在40-60%为宜，G+C太少则扩增效果不佳，G+C过多则易出现非特异条带；④避免引物内部出现二级结构，避免两天引物间互补，特别是3'端的互补否则会形成二聚体结构；⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
临床医学检验：分子生物学检验技术考试题库1、填空题由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是____________________。
正确答案：1/42、配伍题翻译前体（江南博哥）的RNA是()细胞内含量最多的RNA是()蛋白质翻译的模板是()核小体RNA是()A．hnRNAB．mRNAC．snRNAD．rRNAE．tRNA正确答案：A,D,B,C3、判断题基因的多态性指一个群体中，同时和经常存在两种以上的变异型() 正确答案：对4、多选下列哪些是染色体以外的遗传因子()A．病毒核酸B．真核生物的线粒体C．细菌的质粒D．转座子E．转位因子正确答案：B, C, D, E5、单项选择题pBR322质粒载体的描述中，错误的是()A．只有一个复制起始位点B．具有两个抗生素抗性基因C．抗性基因中有抗四环素基因D．具有较小的分子量E．具有较高的拷贝数正确答案：C6、判断题蛋白质芯片技术的特点为假阳性率低，样品用量少，无交叉杂交现象()正确答案：错7、单选?某女，29岁，由于感冒、发烧住院，实验室检查：免疫球蛋白降低，CD4分子数量减少。
经询问，该病人有不洁性接触史。
进一步检查应做()A．梅毒抗体或抗原检查B．泌尿生殖道感染C．HIV抗原检测D．分子生物学检查染色体E．不需要检查，直接治疗正确答案：C8、单选?男，45岁，发现有动脉硬化症状。
查体：见角膜有老年性色素环。
查血：TC12.00mmol/L，TG2.6mmol/L。
最可能的诊断是()A．混合性高脂血症B．高甘油三酯血症C．家族性高胆固醇血症D．Ⅰ型高脂血症E．Ⅱ型高脂血症正确答案：C9、问答题试述基因多态性在遗传性疾病发生方面有何重要意义?正确答案：基因多态性是指在一个群体中，存在两种或两种以上的变异型或基因型，而且这类基因型的频率比较高，一般认为每种变异型超过1%，即可定为多态性。
在人类基因组中大部分DNA序列不参与蛋白质的编码，因此在这些序列中可出现大量的不均一性。
分子生物学实验考试说明考试题型：填空题15空共30分，名词解释4个共20分，综合题3题共50分。
考试重点：一些概念：1、感受态细胞2、转化3、载体4、质粒5、拷贝数6、基因组7、限制性内切酶8、酶切图谱9、PCR10、T m值11、引物12、变性13、退火14、延伸2、实验中常用仪器设备的使用原理及注意事项。
3、实验中所用各试剂的作用。
4、各实验电泳图谱的分析。
（已知质粒图谱，要能画出相关实验的电泳图谱；反之，已知电泳图谱也能分析实验现象）一些思考题：实验一：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1、感受态细胞在生理上与普通细胞有何差异？这种差异对转化外源DNA有什么特别作用？2、在转化实验中，涂平板前需要在37℃下振荡培养30-60min，请说出这一实验步骤的目的。
3、电转化的原理是什么？为什么其转化率高于CaCl2法？实验二：大肠杆菌质粒DNA的提取1、碱法提取质粒DNA时应注意哪些问题？溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用分别是什么？2、描述质粒DNA电泳图谱，并解释可能产生的现象及原因。
实验三：琼脂糖凝胶电泳1、试说明水平电泳槽与你在生化实验中所用的垂直电泳槽有何区别。
实验四：大肠杆菌基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳1、试比较基因组DNA的提取与质粒DNA的提取有何区别。
实验五：质粒DNA限制性内切酶实验及琼脂糖凝胶电泳1、重组实验中常用的酶有哪几类？分别起什么作用？2、DNA酶切反应不彻底的电泳图谱是怎么样的？DNA若发生降解，酶切图谱又如何？实验六：聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因及琼脂糖凝胶电泳1、PCR反应体系的组分。
2、PCR程序各步骤及作用。
3、降低退火温度对PCR结果有何影响？延长变性时间对PCR结果有何影响？循环次数是否越多越好？为什么？4、在PCR产物分析时发现，除了目的产物带外，还存在其他的非目的产物条带，试分析产生该现象的原因并提出改进的方法。
章节测试题1.【综合题文】请你参与下列探究：【问题情景】在课外活动中，小斌按照课本实验（见图1）探究微粒的性质时，闻到了刺激性的氨味，于是，小斌在老师的指导下，设计了如图2的实验装置，进行同样的实验，结果不再有刺激性的氨味，并且快速出现实验现象，得到了和课本实验同样的结论。
【实验探究与结论】小斌用图2装置进行实验。
2.【答题】碘是一种由碘分子构成的非金属，某同学利用碘进行了如下的实验：（1）把少量的固体碘放在湿润的馒头上，发现馒头会变蓝色，（2）再取少量的碘溶解在水中，用馒头去沾取碘液，发现馒头也会变蓝色，则：（1）从微观的角度分析，______是保持碘化学性质的最小微粒。
（2）取少量的碘放入烧杯中，用酒精灯加热，碘升华变成碘蒸气，把湿润的馒头放在碘蒸气中，馒头______（填“会”或“不会” ）变蓝色。
（3）请用分子的观点来解释实验中的现象：______。
（4）现在市场上买来的食盐都是加碘盐，用馒头沾取少量的食盐水，馒头不变蓝色，由此可知，食盐______（填“存在”或“不存在”）碘分子。
【答案】（1）碘分子（2）会（3）碘是由碘分子构成的，分子是保持物质的化学性质的一种微粒，在上述实验中碘分子都没有发生改变，所以都能使淀粉变蓝色（4）不存在【分析】本题考查分子的性质和应用。
【解答】（1）分子是保持物质化学性质的最小粒子，所以碘分子是保持碘化学性质的最小微粒。
（2）馒头中含有淀粉，淀粉遇碘变蓝。
（3）碘是由碘分子构成的，分子是保持物质的化学性质的一种微粒，在上述实验中碘分子都没有发生改变，所以都能使淀粉变蓝色。
（4）淀粉遇碘变蓝，是淀粉遇碘分子变蓝，馒头遇食盐水不变色，说明食盐中不含碘分子。
3.【综合题文】“用微观的眼光看世界”是我们学习化学的重要思想方法。
试根据以下材料，结合你所学过的知识，简要回答问题。
材料一一滴水里大约有15万亿亿个水分子，如果10亿人来数一滴水里的水分子，每人每分钟数100个，日夜不停，需要数3万多年才能完成。
分子实验考试题型——名词解释（4道）简答题（3道）综合分析题（1道）一、名词解释:【复性】变性DNA在适当条件下，两条分开的互补单链可重新恢复双螺旋构象，这种现象称为复性。
【质粒】质粒是染色体外的稳定遗传因子，能自主复制和转录并表达所携带的遗传信息。
大小为1-200Kb，为双链闭环超螺旋DNA，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
【感受态细胞】如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。
【转化】是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
【卫星菌落】某些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它可以破坏氨卞青霉素。
当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶积累过多，就会使周围的氨卞青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，即出现卫星菌落。
【PCR】聚合酶链式反应(PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。
每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。
【转化效率】转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率。
转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数(10)（注：稀释倍数=涂布前总体积／涂板用菌液体积）转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)【酶切】限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
【连接】DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键，在有Mg2+、ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。
【报告基因】GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。
β-葡萄糖苷酸酶是一种水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。
由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此GUS 基因作为报告基因被广泛应用于基因调控的研究中。
二、填空1、碱裂解法提取质粒的原理、主要试剂组成。
【原理】质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA 拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。
当加入中和液后,溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。
这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。
除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
【试剂组成】1、E.coli5а(含pUC18或19质粒)？？2、溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）；EDTA（10mmol/L）3、溶液Ⅱ：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鲜配制）4、溶液Ⅲ：60ml的5mol/L KAC；11.5ml的冰醋酸；28.5ml水5、Tris饱和酚6、氯仿+异戊醇（24：1）7、无水乙醇8、70%乙醇9、ＴＥ缓冲液（pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)10、RNaseA酶PCR反应体系的组成1、DNA模板：λ噬菌体的质粒DNA2、dNTP:4种dNTP混和物。
3、10×PCR缓冲液(buffer)，具体组分如下:MgCl2、KCl、Tris.HCl(pH8.3)、明胶4、引物(primer):上游引物（M13F），下游引物（M13R）5、Taq DNA聚合酶感受态细胞生长状态和密度要求菌悬液在LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右(对数生长期）。
注：这一步非常关键。
培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。
4、转化主要操作的目的(质粒和感受态细胞混和：0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。
(热击：在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。
(复苏：使细菌恢复正常生长状态,即摄入了外源DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，并表达质粒编码的抗生素抗性基因Ampr（即外源基因）。
当带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
5、限制酶的几大类型、识别和作用特点、条件？？根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。
DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。
Ⅱ型限制性内切酶的主要特点：(识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸（在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶），少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的（4-11）。
(II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。
(影响酶切反应的因素：DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。
三、简答题聚合酶链式反应(PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。
每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。
PCR变温程序具体操作中，包括几个阶段？每个阶段的作用、大致范围及如何设定。
【变性】作用：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备？？大致范围：94-95℃，30秒。
设定理由：变性不完全,往往使PCR失败，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
【退火(复性)】作用：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合？？大致范围：50~60℃设定理由：通常PCR的退火温度选择为Tm-5℃。
退火温度越高,所得产物的特异性越高。
◇引物为20mer以下时：Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C)◇引物为20mer以上时：Tm=81.5十0.41×(GC％)-600/L其中L为引物的长度【延伸】作用：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链？？大致范围：72℃，1-2kb/min设定理由：延伸时间过长会导致产物非特异性增加。
但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。
一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。
循环数：35cycles。
因为循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。
3、碱裂解法提取质粒原理、溶液I、溶液II和溶液III作用【碱裂解法提取质粒原理】质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。
当加入中和液后,溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。
这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。
除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
【溶液I】1、低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。
2、EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。
3、Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。
【溶液II】1、SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。
2、NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。
由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。
能中和溶液II的碱性，使DNA复性。
K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。
溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
连接的原理及反应体系组成、作用温度【连接的原理】(核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。
(DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。
(一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。
【反应体系组成&作用温度】体系：ddH2O、λDNA/EcoT14I片段(50ng/ul)、连接缓冲液、T4DNA连接酶作用温度：16℃for：1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定；2.连接反应时间长，低温下酶不容易失活5、CaCl2法转化的原理、蓝白斑筛选的原理【CaCl2法转化的原理】0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。
在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。
摄入了外源DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。
带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
【蓝白斑筛选的原理】现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。
