DNA凝胶电泳图
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DNA琼脂糖凝胶电泳制备全过程图解页数:10
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琼脂糖凝胶电泳页数:14
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DNA琼脂糖凝胶电泳原理页数:6
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DNA琼脂糖凝胶电泳页数:20
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DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤页数:2
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DNA琼脂糖凝胶电泳分析 ppt课件页数:20
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实验技术 DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定(修改后)SDS-PAGE
0.3 0.5 0.6 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0
5-60 1-30 1-20 0.8-12 0.5-10 0.4-6 0.2-4 0.1-3
操作步骤
♦琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，核酸染料 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却， ♦凝胶板的制备：加梳子，倒胶 凝胶板的制备：加梳子， ♦样品的制备：样品 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 体积溴酚蓝 ♦加样：加样端为负极（黑） 加样：加样端为负极（ ♦电泳：5V/cm 电泳： ♦观察：紫外灯下观察，照相 观察：紫外灯下观察，
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电 分子在琼脂糖凝胶中泳动时， 分子在琼脂糖凝胶中泳动时 荷效应与分子筛效应。不同的 荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分 ， 子量大小及构型不同， 子量大小及构型不同，电泳时的泳动率 就不同， 就不同，从而分出不同的区带 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分 ， 琼脂糖凝胶电泳法分离 子筛效应， 子筛效应，迁移速度与分子量的对数值 成反比关系
开环 线性 超螺旋
质粒DNA的3种形式泳动速度 超螺旋 线性 开环 的 种形式泳动速度 超螺旋>线性 种形式泳动速度:超螺旋 线性>开环 质粒
分离不同大小DNA 分离不同大小DNA片段的 DNA片段的 合适琼脂糖凝胶浓度
琼脂糖含（ ） 琼脂糖含（%） DNA片段的有效分离范围 片段的有效分离范围(kb) 片段的有效分离范围
主要实验器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子 电泳槽
取液器 溴酚蓝
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
准备样品
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
DNA琼脂糖凝胶电泳(原)
凝胶制作过程
1. 根据电泳需要，配臵合适浓度的电泳及制胶缓冲液，一 般为1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液 的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖至清明、透亮。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使
用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成 为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但在实际 的操作过程中经常出现一些问题，如凝胶电泳图谱的 条带模糊不清，条带弯曲变形, 凝胶图谱变形，灌制
凝胶后的点样孔撕裂不整齐等，使得电泳结果的重复
性差。
二、相关概念
上样注意事项
加样时枪头不要碰坏凝胶控壁，否则DNA带型不整齐，加 样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液以赶走样品空中的气泡； 每孔最大上样量取决于DNA样品片段的大小，数目及样品 孔形状与容量； 每孔最大上样容积决定于样品孔体积； DNA marker可在两侧的样品孔均加上。
电压和温度
电泳时电压应该不超过20V/cm，电泳温度应该低
4.在软件界面点击“拍摄”按钮即可。
注：1、尽量减少紫外照射时间，调焦距和位臵时可以用白光。 2、不同凝胶结果对比时，用相同焦距、曝光时间和光圈大小。
如何调节焦距、聚焦、光圈以获得 高质量的图片？
三个最重要的可调参数分别是焦距、聚焦 和光圈。其中焦距调节清晰度，聚焦调节图像 大小，光圈调节明暗。一般先调光圈至适宜的 亮度后，再调聚焦将图像放到最大，最后调节 焦距，在图像较大的情况下焦距比较容易调节 到最清晰状态，然后再把图像缩放在适宜大小 后成像即可。
实验七---DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验七---DNA的琼脂糖凝胶电泳实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时）实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。
这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。
不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。
一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。
但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
最新细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳_图文ppt课件
SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA 分离
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA 不再降解
Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小 肽/氨基酸
酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫
方法
一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－
10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨， 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm， 离心5min，制成1×107细胞悬液备用。
二、提取胸腺细胞DNA：
⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、 RNaseA/蛋白酶K液=A液）
线粒体的改变
• 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转
换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子 流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死
• 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测
缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。
• 发育
凋亡的生理学意义
凋亡的生理学意义
• 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入 100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴 20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。
(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、 3MNaAC, pH4.8)
• 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分 振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。 将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟， 12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次 同上，静置1分钟，离心30s。
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA 不再降解
Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小 肽/氨基酸
酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫
方法
一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－
10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨， 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm， 离心5min，制成1×107细胞悬液备用。
二、提取胸腺细胞DNA：
⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、 RNaseA/蛋白酶K液=A液）
线粒体的改变
• 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转
换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子 流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死
• 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测
缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。
• 发育
凋亡的生理学意义
凋亡的生理学意义
• 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入 100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴 20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。
(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、 3MNaAC, pH4.8)
• 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分 振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。 将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟， 12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次 同上，静置1分钟，离心30s。
05 实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(λ DNA,Hind III)(考核15%)
理和适用范围有什么异同？
如果用EcoR
I酶解λ DNA，电泳后的胶
图会如何？
解释限制性核酸内切酶专一性的机理。
器材
电泳仪（DYY-2C），水平电泳槽 微量加液器（10 uL），枪头（10 离心管0.5 mL，离心管架 恒温水浴
uL）
凝胶成像仪（Gel Logic
Gold
淹没胶孔。
制样
1号样：2 uL λ DNA + 18 uL 蒸馏水 + 5 uL 加样缓冲液，混匀，取10 uL点样。 2号样：20 uL λ DNA酶切液 + 5 uL加样
缓冲液，混匀，取10 uL点样。
点样
吸取10
uL样液；
将枪头贴近样孔上沿，略微插入样孔；
（注意：枪头不要戳破胶孔底部）
212 PRO）
view溶液
10×Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，
100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇， 500 mmol/L NaCl ）
试 剂
5×TBE缓冲液：Tris[111] 54
g，硼酸
[61.83] 27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA
0.5×TBE电泳缓冲液：用5×TBE液稀释 Gold
View：每100 mL琼脂糖胶加5 uL
试 剂
加样缓冲液（5×）（Loading dye）
溴酚蓝 （300 bp） 二甲苯腈蓝 （4000 bp） 蔗糖（甘油） Tris-HCl
思考题
加样缓冲液中各个组分的作用是什么？ 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原
轻轻将样液一次连续注入样孔。
DNA 电泳
[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。
在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
(5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。
(6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。
在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
DNA电泳技术
(丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-COCH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺）
聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的 DNA片段和DNA序列分析
• 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长 度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷 酸分子即能分离
一 毛细管电泳仪系统
电泳仪
进样系统 分离系统
检测系统
数据处理系统
Come on
二 毛细管电泳的分离模式
• 区带电泳 capillary zone electrophoresis, CZE • 毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis, CGE • 等速电泳 capillary isota- chophoresis, CITP • 等电聚焦 capillary isoelectric focus, CIEF
原理简图
・Electrophoresis: ABI310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ・Analysis: GeneScanTM Analysis Software Ver.3.7(Applied Biosystems)
优点
• • • • 1. 2. 3. 4. 分辨率高 灵敏度高 高效性 自动化: 灌胶、进样、数据收集
09:37:50
四 分离原理
电场作用下，毛细 管柱中出现：电泳现 象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν 电渗流 >ν 电泳 时,阴离 子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性 粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相 互分离。
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析ppt课件
❖ 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
DNA Ladder电泳怎么糊了(最终版)
DNA Marker电泳怎么糊了——怎样做一张漂亮的琼脂糖凝胶电泳图（续）最近实验室接到一个客户的投诉，说是购买的DL2000DNA Ladder有问题，跑电泳时出现DNA降解的情况。
由于Simgen的DNA Marker含有DNA稳定剂，曾经在室温条件下做过放置一年的真实稳定性测试，都未观察到DNA降解的现象，所以对于客户的投诉感到非常疑惑。
但是为了慎重起见，我们还是从库存产品中抽了一支相同批次的DL2000DNA Ladder进行了电泳实验，结果显示条带正常，并未出现降解情况。
既然不是产品本身的问题，那么就有可能是电泳过程中出现的问题。
Simgen 实验室经过探索，最后我们猜测可能已经找到了问题的症结所在，结合之前有一篇详细介绍如何制作一张漂亮的琼脂糖凝胶电泳图的文章，今天再给大家介绍一个非常容易被忽略的因素——核酸染料的用量。
实验材料：DL2000DNA Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）琼脂糖（BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10）50×TAE（Simgen Cat.No.9001500）溴化乙锭（EB）（Simgen Cat.No.9026001），电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）实验步骤：1.取10ml50×TAE，加入490ml去离子水，混合均匀，稀释成1×TAE。
2.用琼脂糖，1×TAE制作两块相同浓度（1%）的凝胶，一块加入正常用量的溴化乙锭（终浓度0.5μg/ml），一块加入过量的溴化乙锭（终浓度3μg/ml）。
3.分别在两块凝胶中依次加入1.5μl、5μl、10μl DL2000DNA Ladder，放入同一电泳槽进行电泳。
4.每隔一段时间取出凝胶，观察并记录条带情况。
实验结果：电泳图如下，图一电泳了10分钟，图二电泳了15分钟，图三电泳了20分钟，图四是电泳25分钟的条带情况，每张图的左侧部分是正常溴化乙锭用量的凝胶，右侧部分是过量溴化乙锭用量的凝胶。
实验六、大肠杆菌质粒DNA的提取与电泳检测
于室温下放置10-15 min，使酒精挥发干净。 ⑨ 待沉淀干燥后，加入50 μ l TE缓冲液溶解质粒DNA。
实验步骤
3.琼脂糖凝胶电泳检测（合并下次一起电泳） （1）凝胶制备
①取琼脂糖0.8g，加入100ml的1×TAE电泳缓冲液，配成浓 度为0.8%的琼脂糖凝胶。微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶 解（注意不要溅出）。待凝胶溶液冷却至 60℃左右时，加 入溴化乙锭至终浓度为0.5μ g／ml，倒进制胶模具中。 ②室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶 的模具放置于电泳槽中。
实验原理
• 琼脂糖凝胶电泳检测
• 电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反 的电极移动的现象称为电泳。
•在pH8.0的电泳缓冲液体系中，DNA分子带负电 荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正 极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反 比（仅适于线性分子）。
•通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准DNA 片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即 可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。
（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值12.6）
（3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸 11.5ml 水28.5ml（pH4.8）
（4）LB培养基 （5）琼脂糖 （7）1×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/LTris·Cl
1 mmol/L EDTA （8）上样缓冲液（溴酚蓝 （9） 溴化乙锭（1mg/ml）
碱裂解法实验原理
利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上 的差异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形 成蛋白质-SDS复合物。同时，在pH12.0~12.5的碱性条件下，线 状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两 条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高 盐缓冲液使pH降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅 速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷酸链较长且两条互 补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结 构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染 色体DNA网状聚合物便与蛋白质-SDS复合物及不稳定的大分子一 起沉淀下来，而留在上清液中的质粒DNA可用苯酚、氯仿进一步 抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒DNA。
实验步骤
3.琼脂糖凝胶电泳检测（合并下次一起电泳） （1）凝胶制备
①取琼脂糖0.8g，加入100ml的1×TAE电泳缓冲液，配成浓 度为0.8%的琼脂糖凝胶。微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶 解（注意不要溅出）。待凝胶溶液冷却至 60℃左右时，加 入溴化乙锭至终浓度为0.5μ g／ml，倒进制胶模具中。 ②室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶 的模具放置于电泳槽中。
实验原理
• 琼脂糖凝胶电泳检测
• 电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反 的电极移动的现象称为电泳。
•在pH8.0的电泳缓冲液体系中，DNA分子带负电 荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正 极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反 比（仅适于线性分子）。
•通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准DNA 片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即 可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。
（2）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值12.6）
（3）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸 11.5ml 水28.5ml（pH4.8）
（4）LB培养基 （5）琼脂糖 （7）1×TAE电泳缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/LTris·Cl
1 mmol/L EDTA （8）上样缓冲液（溴酚蓝 （9） 溴化乙锭（1mg/ml）
碱裂解法实验原理
利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上 的差异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形 成蛋白质-SDS复合物。同时，在pH12.0~12.5的碱性条件下，线 状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两 条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高 盐缓冲液使pH降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅 速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷酸链较长且两条互 补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结 构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染 色体DNA网状聚合物便与蛋白质-SDS复合物及不稳定的大分子一 起沉淀下来，而留在上清液中的质粒DNA可用苯酚、氯仿进一步 抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒DNA。