DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025348引用格式:孙媛媛,崔树茂,唐鑫,等.发酵乳杆菌的生长限制性因素分析及高密度培养工艺优化[J].食品与发酵工业,2021,47(6):1-10.SUN Yuanyuan,CUI Shumao,TANG Xin,et al.Growth limiting factors of Lactobacillus fermentum and optimization of its high-density cultivation[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(6):1-10.发酵乳杆菌的生长限制性因素分析及高密度培养工艺优化孙媛媛,崔树茂∗,唐鑫,毛丙永,赵建新,陈卫(江南大学食品学院,江苏无锡,214122)摘㊀要㊀为提高发酵乳杆菌的增殖浓度,对其高密度发酵培养基成分及培养工艺进行优化以提高其活菌数㊂结果表明,酵母粉复合大分子肽的蛋白胨是发酵乳杆菌的最适氮源,缓冲盐在恒pH 培养时对菌株生长无促进作用,Mn 2+和Mg 2+均是发酵乳杆菌的限制性微量元素㊂另外,中性条件下酸根的积累不会对发酵乳杆菌有特异性毒害作用,其生长主要是受到渗透压的抑制㊂以菌株生长速率被抑制时的碳氮消耗比作为培养基中的碳氮源比例,基于菌株生长速率被抑制时的渗透压确定碳氮源的添加量㊂进一步优化恒pH 分批培养和恒pH 自动反馈补糖培养工艺,得到各菌株的最优培养策略:发酵乳杆菌FXJCJ6-1㊁发酵乳杆菌FGDLZR161㊁发酵乳杆菌CCFM422分别在恒pH 6.0㊁5.5㊁5.5分批培养时,活菌数分别达到(1.3ʃ0.1)ˑ1010㊁(1.1ʃ0.1)ˑ1010㊁(9.5ʃ0.5)ˑ109CFU /mL ,较在MRS 培养基静置培养时的活菌数提高了3.1㊁3.8和4.6倍㊂该研究结果的应用将显著提高发酵乳杆菌的工业化生产效率㊂关键词㊀发酵乳杆菌;生长限制性因素;高密度培养;渗透压;活菌数第一作者:硕士研究生(崔树茂副研究员为通讯作者,E-mail:cuishumao@)㊀㊀基金项目:国家青年科学基金项目(31801530);国家食品科学与工程一流学科建设项目(JUFSTR20180102)收稿日期:2020-08-12,改回日期:2020-09-28㊀㊀发酵乳杆菌不仅是传统发酵食品中的优势微生物,且广泛地存在于人体肠道㊂2009年,它被列入了欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EF-SA)的合格安全性推定(Qualified Presumption of Safe-ty,QPS)清单,并被美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)列为 公认的安全 (generally recognized as safe,GRAS )生物㊂在2011年被中国卫计委列入‘可用于食品的菌种名单“[1]㊂近年来,发酵乳杆菌的功能特性不断被挖掘出来,如耐酸耐胆盐[2]㊁降解胆固醇[3]㊁抗氧化[2]㊁抑菌[4-5]等,并且有多株功能性发酵乳杆菌被开发上市[6]㊂发酵乳杆菌是专性异型发酵乳杆菌,在生长过程中消耗糖产生乳酸㊁乙酸和CO 2,底物的利用效率及产物抑制可能均不同于同型发酵乳杆菌和双歧杆菌㊂乳酸菌在生长过程中首先受到底物抑制,碳源㊁氮源㊁无机盐㊁微量元素都是组成菌体增殖底物的关键内容,其中,碳源和氮源能够为菌株提供生长所需的营养物质,无机盐除了提供矿质元素外,还作为缓冲体系防止发酵液pH 下降过快,微量元素作为多种酶的辅助因子参与菌株的代谢[7]㊂丰富的底物是菌株生长的必要条件,但是底物浓度过高会使培养基的初始渗透压过高,反而会抑制菌株的生长,因此乳酸菌培养前底物浓度过高㊁底物成分比例不合适及培养后期限制性底物的不足与消耗均是菌株生长的抑制因素[8]㊂众所周知,有机酸积累引起的酸抑制是乳酸菌分批培养时抑制菌体生长的主要因素,但是通过补碱的恒pH 培养可以轻松解除酸抑制[9]㊂已有研究表明,中性条件下酸根积累引起的渗透压升高成为大部分同型发酵乳杆菌和双歧杆菌在恒pH 培养时的主要抑制因素[8]㊂发酵乳杆菌代谢产生的乳酸和乙酸对菌体的抑制是否亦是渗透压抑制还是有酸根毒害作用需进一步研究,且在菌株培养时需均衡底物和代谢产物浓度,既确保底物浓度不会对菌株产生抑制,又需保证底物能够为菌体高浓度增殖提供充足营养㊂本文在分析底物抑制和代谢产物抑制的基础上,基于底物浓度㊁渗透压及最适pH 优化发酵乳杆菌的恒pH 培养工艺,达到高密度培养的目的,为工业化生产提供一定的理论依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂1.1.1㊀菌株发酵乳杆菌FXJCJ6-1分离自新疆昌吉的一位回民的粪便样品,发酵乳杆菌FGDLZR161分离自广东连州的一位儿童的粪便样品,发酵乳杆菌CCFM422分离自海南省乐东黎族自治县的酸豆角样品,均由江南大学食品生物技术中心保藏㊂1.1.2㊀试剂葡萄糖㊁胰蛋白胨㊁酵母粉㊁牛肉膏㊁无水乙酸钠㊁柠檬酸氢二铵㊁K2HPO4㊁MgSO4㊃7H2O㊁MnSO4㊃H2O㊁Tween80㊁NaCl㊁乳酸钠水溶液,国药集团化学试剂有限公司;酵母蛋白FM103㊁酵母浸粉FM803㊁酵母浸粉FM528㊁大豆蛋白胨FP410㊁牛骨蛋白胨FP326㊁鱼骨蛋白胨FP351,安琪酵母股份有限公司;葡萄糖试剂盒,上海荣盛生物药业有限公司㊂1.2㊀仪器与设备ZHJH-C1115B型超净工作台,上海智诚分析仪器制造有限公司;GRP-9080型隔水式恒温培养箱,上海森信实验仪器有限公司;FE20型pH计㊁EL3002型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;MS3basic型涡旋振荡器,德国IKA公司; MLS-3750型高温高压灭菌锅,日本SANYO公司; T&J-Minipod1Lˑ8型迷你平行发酵罐,迪必尔生物工程有限公司;löser-om806m型冰点渗透压测定仪,德国löser公司;UV-2450紫外分光光度计,日本岛津公司㊂1.3㊀实验方法1.3.1㊀培养基的配制MRS液体培养基(g/L):葡萄糖20㊁蛋白胨10㊁牛肉膏10㊁酵母粉5㊁乙酸钠2㊁K2HPO42㊁柠檬酸氢二铵2㊁MgSO4㊃7H2O0.1㊁MnSO4㊃H2O0.05㊁Tween 801mL,调节pH6.2~6.4㊂MRS固体培养基:与MRS液体培养基配方相同,另加20g/L的琼脂粉㊂氮源偏好分析培养基[10](g/L):氮源1㊁葡萄糖6㊁K2HPO410㊁Na2HPO410㊁MgSO4㊃7H2O0.25㊁MnSO4㊃H2O0.05㊁Tween801mL,调节pH6.0㊂MRS氮源偏好分析培养基(g/L):氮源1(0.4胰蛋白胨㊁0.4牛肉膏㊁0.2酵母粉),其他成分同氮源偏好分析培养基㊂MRS氮源(MRS无机盐)培养基(g/L):氮源1 (0.4胰蛋白胨㊁0.4牛肉膏㊁0.2酵母粉)㊁葡萄糖6㊁乙酸钠2㊁K2HPO42㊁柠檬酸氢二铵2㊁MgSO4㊃7H2O 0.25㊁MnSO4㊃H2O0.05㊁Tween801mL,调节pH 6.0㊂上述培养基均在115ħ灭菌20min㊂1.3.2㊀菌株活化与培养用接种环从保菌管中蘸取少量菌液,在MRS固体培养基上划线,平板置于37ħ培养24~36h㊂挑取单菌落,接入5mL MRS液体培养基中,37ħ培养12h㊂以体积分数为4%的接种量将培养液接种到新鲜的MRS液体培养基中,培养12h后得到活化的种子液㊂以下实验方法中的接种量均为4%㊂1.3.3㊀菌株对不同氮源利用的偏好性分析按照1.3.1的方法配制不同的氮源培养基,接入菌株后37ħ培养至稳定期,测定OD600㊂1.3.4㊀生长限制性无机盐分析用NaCl代替MRS培养基中的无机盐,保持2种培养基的渗透压相同,在发酵罐中接入菌株,37ħ恒pH6.0培养至稳定期,每2h取样,绘制菌株的生长曲线,同时在稳定期取样,测定活菌数㊂1.3.5㊀生长限制性微量元素分析培养基配方(g/L):氮源1㊁葡萄糖6㊁K2HPO4 10㊁Na2HPO410㊁Tween801mL㊂培养基中只添加单一的微量元素(0.05MnSO4㊁0.05MgSO4),质量比1ʒ1添加MnSO4和MgSO4,空白组(两者都不加), 37ħ培养至稳定期,测定OD600㊂1.3.6㊀中性条件下酸根的最低抑菌浓度测定参照崔树茂[8]的方法,在MRS液体培养基中添加乳酸钠㊁乙酸钠和NaCl,配成0.1㊁0.2㊁ ㊁1.5 mol/L的盐溶液,在无菌环境中用NaOH或HCl将溶液pH值调节至7.0㊂接入菌株后测定初始OD600,然后在37ħ培养24h,测定OD600,若OD600未发生变化,说明菌株被完全抑制,此样品的盐浓度为该菌株的最低抑菌浓度㊂1.3.7㊀最适生长渗透压及完全抑制渗透压的测定添加3g/L的NaCl会使培养基的渗透压平均增加100mOsm/kg,而MRS液体培养基的渗透压一般在350mOsm/kg左右,计算NaCl的添加量,配制350㊁400㊁500㊁ ㊁3300mOsm/kg的培养基,接入菌株后37ħ培养,每2h取样测定OD600,绘制菌株的耐渗透压曲线,计算菌株的代时㊂1.3.8㊀碳氮消耗比测定按照1.3.1氮源偏好分析培养基的配方,其中的氮源为各菌株的最适氮源㊂在菌株发酵过程中不断监测OD600和发酵液中的葡萄糖浓度,计算生长速率被抑制时的碳氮消耗比㊂1.3.9㊀生长限制性微量元素最适浓度的测定利用恒pH自动反馈补糖培养分析微量元素的质量浓度及比例对活菌数的影响㊂培养基中分别称取0.05㊁0.15㊁ ㊁0.55g/L的MnSO4和MgSO4,m (MnSO4)ʒm(MgSO4)=1ʒ1,以相同的培养基和培养条件置于平行发酵罐,接入菌株后37ħ恒pH6.0补糖培养至稳定期,测定OD600和活菌数,优选出最佳质量浓度㊂然后在最佳质量浓度的基础上,改变两者的比例,重复上述操作,优选出微量元素之间的最佳比例㊂1.3.10㊀最适生长pH的测定设置不同的pH梯度:5.0㊁5.5㊁6.0㊁6.5,接入菌株后37ħ培养至稳定期,测定OD600及活菌数㊂1.3.11㊀恒pH分批培养根据培养基的底物分析,确定最优的底物质量浓度,根据耐渗透压曲线和碳氮消耗比,计算培养基中的碳源㊁氮源的添加量,培养基的初始渗透压应低于菌株生长速率被抑制时的渗透压㊂在发酵罐中恒最适pH发酵,37ħ培养至稳定期,测定OD600及活菌数㊂1.3.12㊀恒pH自动反馈补糖培养推算恒pH培养时菌体被完全抑制时消耗的最适氮源添加量,根据底物分析,配制渗透压为350 mOsm/kg左右的培养基,在发酵罐中以最适pH进行37ħ恒pH补糖培养,补料液为400g/L的葡萄糖溶液,稳定期测定OD600及活菌数㊂具体操作如下:配制400g/L(c碱)的NaOH溶液和400g/L(c糖)的葡萄糖溶液,开启发酵罐的补糖和补碱系统,关联比例(k)根据公式(1)[8]设置:c碱40ˑW=c糖ˑk(1)式中:40,NaOH的摩尔分子量,g/mol;W,菌株代谢单位质量的葡萄糖产生的酸摩尔数,mol/g㊂1.3.13㊀测定方法菌体密度的测定:用紫外分光光度计在波长600nm 下测定发酵液的吸光度值,若吸光度值超过0.8,需要将菌液稀释,使稀释后菌液的吸光度值在0.2~ 0.8;活菌数的测定:平板菌落计数法;葡萄糖浓度的测定:葡萄糖试剂盒测定;渗透压的测定:渗透压仪测定㊂1.4㊀数据统计分析所有实验均重复3次,实验结果表示为平均值ʃ标准偏差㊂实验数据采用Origin9.1绘图,采用SPSS 25.0统计软件进行单因素ANOVA判断(邓肯检验),P<0.05表示具有显著性差异㊂2㊀结果与分析2.1㊀限制性底物的分析和优化2.1.1㊀氮源利用的偏好性乳酸菌利用葡萄糖发酵的效率高,可以直接利用葡萄糖进行生长代谢所需的一系列生化反应[11]㊂另外葡萄糖价格低廉,综合考虑后,选择葡萄糖作为发酵乳杆菌的最佳碳源㊂氮源作为生长底物的一种,对乳酸菌的生长起着重要的作用㊂由于乳酸菌中存在着不同的蛋白水解酶系,因此不同的乳酸菌利用的最适氮源不同[12]㊂按照1.3.3的方法,系统研究单位质量(1g)不同氮源对发酵乳杆菌的增殖效果,以此归纳出发酵乳杆菌对氮源利用的偏好性㊂从表1可以看出,3株发酵乳杆菌在复合氮源(酵母浸粉528+牛骨蛋白胨+牛骨蛋白胨)培养基中的OD600与在其他单一氮源培养基中的OD600有显著性差异(P<0.05),说明发酵乳杆菌对复合氮源的利用程度较高㊂这与SAFARI等[13]的研究结果一致,他们发现复合氮源更有利于嗜酸乳杆菌㊁干酪乳杆菌和植物乳杆菌等乳酸菌的生长㊂表1㊀不同氮源分批培养发酵乳杆菌的最高生物量(OD600) Table1㊀Maximum biomass of Lactoacillus fermentum in batch culture with different nitrogen sources(OD600)氮源种类氮源名称发酵乳杆菌FXJCJ6-1发酵乳杆菌FGDLZR161发酵乳杆菌CCFM422微生物类酵母提取物0.426ʃ0.09b0.253ʃ0.02d0.322ʃ0.01f酵母蛋白1030.407ʃ0.02c0.281ʃ0.01c0.323ʃ0.03f酵母浸粉8030.424ʃ0.05b0.273ʃ0.01c0.409ʃ0.01d酵母浸粉5280.429ʃ0.01b0.253ʃ0d0.374ʃ0.01e 乳基类胰蛋白胨0.260ʃ0.14f0.244ʃ0d0.30ʃ0.01h 植物类大豆蛋白胨0.393ʃ0.01c0.243ʃ0d0.432ʃ0.05c 动物类鱼骨蛋白胨0.297ʃ0.01e0.245ʃ0d0.292ʃ0h牛肉浸粉0.271ʃ0.04f0.244ʃ0d0.289ʃ0.01h牛骨蛋白胨0.306ʃ0.03e0.248ʃ0d0.314ʃ0.01fg 复合氮源528+牛骨蛋白胨+鱼骨蛋白胨0.764ʃ0.01a0.382ʃ0.02b0.474ʃ0bMRS氮源对照组0.324ʃ0.04d0.245ʃ0d0.43ʃ0.03cMRS氮源(MRS无机盐)对照组0.777ʃ0.06a0.831ʃ0.01a0.935ʃ0a 注:不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)除此之外,比较MRS氮源组和MRS氮源(MRS 无机盐)组,可以发现MRS氮源(MRS无机盐)组的OD600明显高于MRS氮源组,说明培养体系中无机盐对发酵乳杆菌的增殖效果有影响,即无机盐有可能是发酵乳杆菌的生长限制性因素㊂另外,朱丹凤等[14]研究发现,上述氮源中的氨基酸种类和含量丰富,所以排除了由于氮源中缺少必需氨基酸而影响菌株增殖的可能㊂从单一氮源来看,发酵乳杆菌对微生物类氮源的利用程度较高,这是因为这类氮源的肽相对分子质量90%都集中在500Da 以下(表2),说明发酵乳杆菌对小分子肽具有偏好性㊂但是将不同种类㊁不同分子质量的氮源复配后,发酵乳杆菌的利用程度更高,说明单一氮源中缺乏生长因子,而复配后的氮源中富含生长因子,从而促进了菌株的生长㊂综上,酵母粉复合大分子肽的蛋白胨是发酵乳杆菌的最适氮源,这个结论可以为发酵乳杆菌工业化生产提供一定的指导㊂2.1.2㊀生长限制性无机盐无机盐一般是作为缓冲盐被加入到培养基中,其能够在菌体增殖时减缓发酵液pH 值下降的速率,同时维持发酵环境的渗透压㊂姚国强等[15]研究发现,Lactobacillus reuteri IMAU10240在缺乏无机盐的培养基中生长时,其生长速率明显受到抑制㊂但是大部分乳酸菌在恒pH 条件下生长时,其增殖情况并不受无机盐存在与否的影响㊂本实验通过对比发酵乳杆菌在2种培养基(添加无机盐㊁未添加无机盐)中的生长情况,探究在恒pH 培养时,无机盐对发酵乳杆菌的生长是否有促进作用㊂表2㊀不同氮源的肽分布单位:%Table 2㊀Peptide distribution of different nitrogen sources氮源种类氮源名称不同相对分子质量的肽/Daɤ180180~500500~10001000~20002000~30003000~5000微生物类酵母提取物63.225.69.61.6酵母蛋白10330.042.220.3 6.30.90.3酵母浸粉80367.024.37.6 1.00.1酵母浸粉52870.217.78.9 3.10.1乳基类胰蛋白胨25.135.122.611.9 3.5 1.8植物类大豆蛋白胨30.535.920.39.6 2.5 1.2动物类鱼骨蛋白胨28.938.019.89.3 2.5 1.5牛肉浸粉34.930.518.410.8 3.4 2.0牛骨蛋白胨25.239.920.99.5 2.7 1.8复合氮源MRS 氮源(对照)43.531.614.37.5 1.9 1.2528+牛骨蛋白胨+鱼骨蛋白胨35.834.717.98.22.11.3㊀㊀由2.1.1的结果可知,分批培养时,添加的无机盐种类对发酵乳杆菌的增殖有一定的影响㊂但是,由图1可知,在恒pH 培养时,3株发酵乳杆菌在2种培养基中的生长情况大致相同,且稳定期的活菌数也不存在显著性差异(P >0.05)㊂由此可以得知,在恒pH 培养时,缓冲盐的作用是维持发酵液pH 的相对稳定,无机盐的添加并不会对发酵乳杆菌的增殖起到促进作用㊂a -发酵乳杆菌FXJCJ6-1;b -发酵乳杆菌FGDLZR161;c -发酵乳杆菌CCFM422图1㊀发酵乳杆菌未添加和添加无机盐恒pH 培养的生长曲线及活菌数Fig.1㊀Growth curve and viable counts of L.fermentum cultured at constant pH with inorganic salts and or no inorganic salts注:不同小写字母代表差异显著(P <0.05),相同代表差异不显著(下同)2.1.3㊀生长限制性微量元素分析微量元素是一类对微生物的生长有促进作用,但需要量极少的元素,通常是作为某些活性物质的组成成分或者酶的激活剂发挥作用[16]㊂在异型乳酸发酵中,Mn 2+㊁Mg 2+是多个关键酶的辅酶因子㊂Mg 2+参与核蛋白体的聚合[17],适量的Mg 2+能促进ATP 的合成[18]㊂另外,李兴峰[19]研究发现,Mn 2+㊁Mg 2+对乳酸脱氢酶的酶活有促进作用㊂CHENG 等[20]研究发现,Mn 2+在植物乳杆菌中充当了 代谢转换 的作用,它调节了丙酮酸到乳酸等代谢途径的代谢通量㊂因此,一般在发酵培养基中都会添加MnSO 4和MgSO 4来促进乳酸菌的生长㊂由图2可知,Mn 2+和Mg 2+对3株发酵乳杆菌的生长具有促进作用,发酵乳杆菌在Mn 2+和Mg 2+均添加的情况下生长效果明显优于只添加单一微量元素的组别和空白组,具有显著性差异(P <0.05)㊂因此,可以判定Mn 2+和Mg 2+是发酵乳杆菌的生长限制性微量元素㊂a-发酵乳杆菌FXJCJ6-1;b-发酵乳杆菌FGDLZR161;c-发酵乳杆菌CCFM422图2㊀发酵乳杆菌限制性微量元素分析结果Fig.2㊀Analysis results of limiting trace elements of L.fermentum 2.2㊀代谢产物的抑制2.2.1㊀酸根积累对菌株的抑制作用按照1.3.6的方法,研究pH7.0条件下未解离的酸根对发酵乳杆菌的抑制,判断酸根是否是发酵乳杆菌生长的主要限制性因素㊂测定了pH7.0条件下NaCl㊁乙酸钠和乳酸钠对发酵乳杆菌的最低抑菌浓度㊂NaCl对菌株的抑制主要是渗透压抑制,因此将NaCl的最低抑菌浓度作为研究酸根抑制的对照㊂若乙酸钠和乳酸钠的最低抑菌浓度低于NaCl的最低抑菌浓度,则表明酸根对发酵乳杆菌具有特异性毒害作用㊂由表3可知,NaCl㊁乙酸钠和乳酸钠在pH7.0条件下对发酵乳杆菌的最低抑菌浓度均相同,说明pH7.0时,乙酸根和乳酸根对这3株发酵乳杆菌的抑制是由于酸根积累引起的渗透压升高,即,未解离的酸根并不会对发酵乳杆菌有特异性毒害作用,发酵乳杆菌的生长主要是受到渗透压的抑制㊂表3㊀NaCl㊁乙酸钠和乳酸钠在pH7.0时对发酵乳杆菌的最低抑菌浓度单位:mmol/LTable3㊀The minimum inhibitory concentration ofNaCl,CH3COONa and C3H5O3Na againstL.fermentum at pH7.0菌株NaCl乙酸钠乳酸钠发酵乳杆菌FXJCJ6-1 1.0 1.0 1.0发酵乳杆菌FGDLZR161 1.0 1.0 1.0发酵乳杆菌CCFM422 1.2 1.2 1.2 2.2.2㊀最适生长渗透压与完全抑制渗透压由2.2.1的结果可知,发酵乳杆菌生长的主要抑制因素是酸根积累引起的渗透压升高,因此,需要重点研究每株菌对环境渗透压的耐受程度,以此更好地优化菌株的培养工艺㊂㊀㊀由图3可知,发酵乳杆菌FXJCJ6-1和FG-DLZR161在渗透压为1000mOsm/kg时生长速率被抑制,发酵乳杆菌CCFM422在渗透压为1200 mOsm/kg时生长速率被抑制㊂2.3㊀培养工艺的优化2.3.1㊀底物浓度的优化2.3.1.1㊀碳氮比基于2.1.1最适氮源的结果,按照1.3.8的方法,测定发酵乳杆菌利用最佳氮源生长速率被抑制和完全被抑制时的葡萄糖浓度,结果如表4所示㊂表4㊀发酵乳杆菌生长速率被抑制和完全被抑制时的碳氮消耗比Table4㊀Ratio of carbon and nitrogen consumption when the growth rate of L.fermentum wassuppressed and completely suppressed抑制点发酵乳杆菌FXJCJ6-1发酵乳杆菌FGDLZR161发酵乳杆菌CCFM422生长速率被抑制时的消耗比㊀㊀(2.7ʃ0.1)ʒ1(2.8ʃ0.2)ʒ1(2.7ʃ0.1)ʒ1生长速率完全被抑制时的消耗比(4.3ʃ0.1)ʒ1(4.3ʃ0.4)ʒ1(3.8ʃ0.3)ʒ1 DISHISHA等[21]研究发现,培养基中碳源和氮源比例过低时,菌体代谢旺盛产生大量的代谢废物,从而抑制菌体增殖;碳源和氮源比例过高时,菌体主要利用营养物质来合成积累代谢产物㊂王玉林等[22]研究发现,培养基的最适碳氮比为生长速率被抑制时的消耗比时,菌株的增殖效率最高㊂由表4可知,发酵乳杆菌FXJCJ6-1和CCFM422的最佳碳氮比为2.7,发酵乳杆菌FGDLZR161的最佳碳氮比为2.8㊂基于菌株生长速率被抑制时的碳氮比结果及渗透压值,最大程度地提高培养基中的碳㊁氮含量,以此提高菌株的发酵密度㊂2.3.1.2㊀限制性微量元素浓度及比例的优化由2.1.3的结果可知,Mn2+和Mg2+均是发酵乳杆菌的生长限制性微量元素,因此,探究Mn2+㊁Mg2+质量浓度及比例与活菌数之间的关系㊂a㊁c㊁e -发酵乳杆菌FXJCJ6-1㊁FGDLZR161㊁CCFM422的耐渗透压曲线;b㊁d㊁f -发酵乳杆菌FXJCJ6-1㊁FGDLZR161㊁CCFM422不同渗透压下的代时图3㊀发酵乳杆菌的耐渗透压曲线及不同渗透压下的代时Fig.3㊀The osmotic pressure curve of L.fermentum and the generation time under different osmotic pressure conditions㊀㊀由图4-a㊁4-c㊁4-e 可知,确定m (Mg 2+)ʒm (Mn 2+)=1ʒ1时,Mg 2+和Mn 2+的总质量浓度越高,活菌数越高,但增加到一定程度后,活菌数的变化差异不大,说明一定范围内提高Mg 2+和Mn 2+的质量浓度,可以提高菌体的增殖效果㊂这与PHAM 等[23]的研究结果一致,他们发现Mn 2+质量浓度过高时会抑制α-葡萄糖苷酶等水解酶,对菌体增殖造成负面影响㊂在Mg2+㊁Mn2+的最适质量浓度的基础上改变Mg 2+和Mn 2+的比例,由图4-b㊁4-f 可知,m (Mg 2+)ʒm (Mn 2+)=1ʒ1时,发酵乳杆菌FXJCJ6-1和CCFM422的活菌数与其他组有显著性差异(P <0.05);而图4-d 表明Mg 2+和Mn 2+的质量比对发酵乳杆菌FGDLZR161的影响不是很大㊂综上,培养发酵乳杆菌FXJCJ6-1的微量元素为m (Mg 2+)ʒm (Mn 2+)=1ʒ1,总质量浓度为0.35g /L;培养发酵乳杆菌FGDLZR161的微量元素为m (Mg 2+)ʒm (Mn 2+)=3ʒ1,总质量浓度为0.35g /L;培养发酵乳杆菌CCFM422的微量元素为m (Mg 2+)ʒm (Mn 2+)=1ʒ1,总质量浓度为0.45g /L㊂2.3.2㊀最适生长pH乳酸菌的最适生长pH 值一般在5.0~7.0,不同乳酸菌的最适生长pH 不同㊂乳酸菌在发酵过程中会产生有机酸,从而使发酵液pH 低于正常生长pH 范围,导致菌株的细胞膜渗透性和细胞内酶活性受到干扰[24]㊂在确定了最优培养基的基础上,设置不同的pH 梯度,探究3株发酵乳杆菌的最适生长pH㊂㊀㊀从图5可以看出,发酵乳杆菌FXJCJ6-1的最适pH 值为6.0,发酵乳杆菌FGDLZR161和CCFM422的最适pH 值为5.5㊂a㊁b -发酵乳杆菌FXJCJ6-1Mg 2+㊁Mn 2+的浓度和比例优化结果;c㊁d -发酵乳杆菌FGDLZR161Mg 2+㊁Mn 2+的浓度和比例优化结果;e㊁f -发酵乳杆菌CCFM422Mg 2+㊁Mn 2+的浓度和比例优化结果图4㊀发酵乳杆菌限制性微量元素质量浓度及比例优化Fig.4㊀Optimization results of the mass concentration and proportion of limiting trace elements in L.fermentum图5㊀发酵乳杆菌的生长pH 优化结果Fig.5㊀Optimization results of growth pH of L.fermentum2.3.3㊀恒pH 分批培养恒pH 分批培养,是将底物一次性加到发酵罐中恒pH 培养㊂根据上述的限制性底物分析结果以及耐渗透压曲线和碳氮消耗比,确定培养基中的碳源㊁氮源㊁微量元素的添加量,需要注意的是培养基的初始渗透压应低于菌株生长速率被抑制时的渗透压㊂(1)发酵乳杆菌FXJCJ6-1恒pH 分批培养㊀㊀由表5可知,培养基初始渗透压接近于生长速率被抑制的渗透压时,发酵液中的活菌数最大㊂因此,发酵乳杆菌FXJCJ6-1恒pH 分批培养的最佳培养基配方(g /L):氮源40(酵母浸粉5288㊁牛骨蛋白胨16㊁鱼骨蛋白胨16),葡萄糖108,MgSO 40.175,MnSO 40.175,Tween 801mL,恒pH 6.0培养,活菌数为(1.3ʃ0.1)ˑ1010CFU /mL,较在MRS 静置培养时的活菌数(3.2ʃ0.07)ˑ109CFU /mL,提高了3.1倍㊂(2)发酵乳杆菌FGDLZR161恒pH 分批培养由表6可知,培养基初始渗透压接近于生长速率被抑制的渗透压时,发酵液中的活菌数最大㊂因此,发酵乳杆菌FGDLZR161恒pH 分批培养的最佳培养基配方(g /L):氮源40(酵母浸粉5288㊁牛骨蛋白胨16㊁鱼骨蛋白胨16),葡萄糖112,MgSO 40.26,MnSO 40.09,Tween 801mL,恒pH 5.5培养,活菌数为(1.1ʃ0.1)ˑ1010CFU /mL,较在MRS 静置培养时的活菌数(2.3ʃ0.03)ˑ109CFU /mL,提高了3.8倍㊂表5㊀发酵乳杆菌FXJCJ6-1的恒pH 分批培养的培养基及培养结果Table 5㊀Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum FXJCJ6-1培养基配方恒pH 分批培养结果氮源/(g㊃L -1)碳源/(g㊃L -1)微量元素/(g㊃L -1)初始渗透压/(mOsm㊃kg -1)活菌数ˑ10-9/(CFU㊃mL -1)剩余糖浓度/(g㊃L -1)发酵液渗透压/(mOsm㊃kg -1)3081MgSO 4=0.175700ʃ69.4ʃ0.8 6.61404ʃ73594.5MnSO 4=0.175810ʃ211ʃ1.3 6.21628ʃ340108930ʃ513ʃ0.15.51895ʃ2表6㊀发酵乳杆菌FGDLZR161的恒pH 分批培养的培养基及培养结果Table 6㊀Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum FGDLZR161培养基配方恒pH 分批培养结果氮源/(g㊃L-1)碳源/(g㊃L -1)微量元素/(g㊃L-1)初始渗透压/(mOsm㊃kg-1)活菌数ˑ10-9/(CFU㊃mL-1)剩余糖浓度/(g㊃L-1)发酵液渗透压/(mOsm㊃kg -1)3084MgSO 4=0.26710ʃ78.2ʃ0.16.91476ʃ43598MnSO 4=0.26830ʃ810.5ʃ0.6 6.3㊀1651ʃ1040112950ʃ511.3ʃ0.16.01890ʃ7㊀㊀(3)发酵乳杆菌CCFM422恒pH 分批培养由表7可知,氮源40和45g /L 条件下活菌数差异不大,考虑成本问题,选择40g /L 的氮源进行培养㊂因此,确定发酵乳杆菌CCFM422恒pH 分批培养的最佳培养基配方(g /L ):氮源40(酵母浸粉5288㊁牛骨蛋白胨16㊁鱼骨蛋白胨16),葡萄糖108,MgSO 40.225,MnSO 40.225,Tween 801mL,恒pH 5.5培养,活菌数为(9.5ʃ0.5)ˑ109CFU /mL,较在MRS 静置培养时的活菌数(1.7ʃ0.07)ˑ109CFU /mL,提高了4.6倍㊂表7㊀发酵乳杆菌CCFM422的恒pH 分批培养的培养基及培养结果Table 7㊀Constant pH batch culture medium and culture results of L.fermentum CCFM422培养基配方恒pH 分批培养结果氮源/(g㊃L-1)碳源/(g㊃L-1)微量元素/(g㊃L-1)初始渗透压/(mOsm㊃kg-1)活菌数ˑ10-9/(CFU㊃mL-1)剩余糖浓度/(g㊃L-1)发酵液渗透压/(mOsm㊃kg -1)3594.5MgSO 4=0.225855ʃ58.5ʃ0.78.91390ʃ140108MnSO 4=0.225920ʃ59.5ʃ0.5 6.11510ʃ345121.51040ʃ2㊀9.9ʃ0.26.31680ʃ32.3.4㊀恒pH 自动反馈补糖培养恒pH 自动反馈补糖培养是基于较低的渗透压条件,后期根据底物消耗自动补料,这种培养模式避免了高浓度底物引起的限制,可以最大程度地减缓发酵液渗透压的升高,对耐渗透压能力较弱菌株的增殖效果较好㊂结果如图6所示㊂a -发酵乳杆菌FXJCJ6-1;b -发酵乳杆菌FGDLZR161;c -发酵乳杆菌CCFM422图6㊀发酵乳杆菌恒pH 分批培养和自动反馈补糖培养结果Fig.6㊀Constant pH automatic feedback sugar supplement results of L.fermentum㊀㊀恒pH 自动反馈补糖培养时,发酵乳杆菌FXJCJ6-1㊁FGDLZR161㊁CCFM422稳定期活菌数分别为(6.8ʃ0.1)ˑ109㊁(7.9ʃ0.9)ˑ109和(7.1ʃ0.2)ˑ109CFU /mL㊂由于发酵乳杆菌能够耐受较高的渗透压,所以恒pH自动反馈补糖培养的低渗优势没有得到很好的体现㊂因此选择恒pH分批培养来增殖发酵乳杆菌㊂3㊀结论(1)发酵乳杆菌对不同种类的氮源利用偏好性不同,酵母粉复合大分子肽的蛋白胨是发酵乳杆菌的最适氮源㊂(2)无机盐只是起到减缓发酵液pH降低速率的作用,在恒pH培养发酵乳杆菌时,添加无机盐并不能提高菌株的增殖效果㊂(3)Mn2+和Mg2+均是发酵乳杆菌的生长限制性微量元素,菌体的高效增殖需要两者同时存在㊂(4)中性条件下,酸根积累并不会对发酵乳杆菌有特异性毒害作用,发酵乳杆菌的生长主要是受到渗透压的抑制,且发酵乳杆菌能够耐受较高的渗透压环境㊂(5)恒pH分批培养是发酵乳杆菌的最优培养工艺㊂恒pH分批培养发酵乳杆菌时,初始底物浓度应基于菌株的耐渗透压曲线进行设定,培养基的初始渗透压应接近于菌株生长速率被抑制时的渗透压,而培养基中的碳氮源添加比例应按照菌株生长速率被抑制时的碳氮消耗比进行设定㊂参考文献[1]㊀ZHAO Y,HONG K,ZHAO J,et ctobacillus fermentum andits potential immunomodulatory properties[J].Journal of Functional Foods,2019,56:21-32.[2]㊀MIKELSAAR M,ZILMER ctobacillus fermentum ME-3-an an-timicrobial and antioxidative probiotic[J].Microbial Ecology in Health&Disease,2009,21(1):1-27.[3]㊀LYE H S,KATO T,LOW W Y,et ctobacillus fermentum FT-DC8312combats hypercholesterolemia 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