绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)

绿色荧光蛋白 (GFP)基因的克隆和表达

背景知识

绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔 肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需 底物或辅因子。 发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成， 长 2.6kb ；GFP 是 由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为

27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解出， 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构， 长 420 nm， 宽 240 nm，由 11 个围绕中心 α螺旋的反平行 β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开 始的，桶的顶部由

3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要 的生色团则位于大空腔内。 发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .

实验一 质粒 DNA 的分离与纯化

一、实验目的

掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用于 从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、 省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。

二、基本原理

质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今 为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到

200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体 上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒 DNA 复制 中的酶体系和细菌染色体复制10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白 时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格 限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的 控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达 质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理） ，细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续 被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化 进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药 基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表 型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。目前已有 许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增； 菌体的收集裂解，质粒 DNA 的分离；质粒 DNA 的纯化。

1、 细菌的生长和质粒的扩增 从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松 弛型质粒 （如 pUC 系列）来说，只要将培养物放到标准的 LB 或 2YT 培养基中生长到对数晚期， 就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒 DNA 。但对于严谨型质粒（如 pBR322 ）来说， 则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩 增。

2、菌体的收集、裂解和质粒 DNA 的分离 质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株） DNA 与质粒 DNA 之间的两种 主要性质差异： （ 1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒 DNA 大得多。（ 2）从细胞中提取得

到的大肠杆菌 DNA 主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA 是共价闭合的环状分子。这里 主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入 SDS（十二烷基硫酸钠）和

NaOH 使菌体 裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁） 。此处理可破坏碱基配对， 故可使细菌的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。 当条件恢复正常时 （如 加入酸性的 NaAc 或 Kac 中和碱性 NaOH ），质粒 DNA 链迅速得到准确配对，重新恢复成天然 的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来，而质 粒超螺旋分子仍滞留于上清中。3、质粒 DNA 的提纯

胶电泳中不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在

最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和 OC DNA 。

三、实验材料、仪器及试剂

1. 在含有 pEGFP－N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种， 置于含有 5mL LB 培养基的试管中。 摇晃过夜。 （DH5α是一种大肠杆菌的诱变菌株，主要表现对外源 DNA的免疫缺乏，是用

于基因工程的菌种）

在含有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。

2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱

四、实验步骤

1. 取1.5ml DH5 α培养液倒入 1.5mL eppendorf 管（一种离心管） 中, 13000rpm离心1min 。 对于小量制备的质粒 DNA ，经过苯酚抽提、 蛋白质及 RNA ，达到纯化的目的。

质粒 DNA 分子具有三种构型：共价闭合环形 构型）和线性分子（ L 构型）。在细RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余

DNA （cccDNA ，SC 构型）、开环 DNA

（ OC 2. 重复 1。

3. 弃上清 ,将管倒置于卫生纸上数分钟 ,使液体流尽。

4. 菌体沉淀重悬浮于 100 μL溶液Ⅰ中 （需剧烈振荡 ）, 室温下放置 10min。

（溶液I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ；溶液I的作用；

mM为mmol/L。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当 pH值的 Tris-Cl 溶液。50

mM葡萄糖最大的好处是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 EDTA是 Ca2+和

Mg2+等二

价金属离子的螯合剂， 配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性， 和抑制微生物

生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子 都螯合掉。菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 ）

5. 加入新配制的溶液Ⅱ 200μ l, 盖紧管口， 快速温和颠倒 eppendorf 管5次 ,以混匀内容物 （千万不 要振荡 ）,冰浴 5min 。

（溶液 II ，0.2 M NaOH / 1% SDS ；溶液 II 的作用；这是用新鲜的 0.4 N 的NaOH和2％的 SDS等体 积混合后使用的。 要新从浓 NaOH稀释制备 0.4N的NaOH，保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱碱 性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳的溶解细胞的 试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜 发生了从 bilayer （双层膜）结构向

micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得 到质粒。 这一步要记住两点： 第一，时间不能过长， 因为碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。）

6. 加入 150 μL预冷的溶液Ⅲ ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 3次 ,使沉淀混匀 ,冰浴中 15分 钟,13000rpm 离心 5min。

（溶液 III ，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。溶液Ⅲ含 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸。溶液 III 加入后就会有 大量的沉淀，这其实是 SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（ PDS），而 PDS是水不溶的，因

此发生了沉淀。而高浓度的盐，使得沉淀更完全。 SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合

一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。 大肠杆菌的基因 组DNA也会一起被共沉淀， 因为基因组 DNA太长，容易被 PDS共沉淀， 注意SDS并不与 DNA分子结合。

2M的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组

DNA一旦

发生断裂，只要是 50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要 短，而且不得激烈振荡， 不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA混入，琼脂糖电泳可以

观察到一条浓浓的总 DNA条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA无法快速复性就被沉淀 了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好， DNA分子在中性溶液中都是溶解的。 NaOH

本来是为了溶解细胞而用的， DNA分子的变性其实是个副产物， 与它是不是沉淀下来其实没有关 系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS沉淀更充分一点。）

7. 上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的氯仿 /异戊醇 （24 ： 1）,振荡混匀 , 13000rpm离心 2min。

（PDS沉淀的形成后有些蛋白质不能被沉淀， 因此要用酚 / 氯仿/ 异戊醇进行抽提， 然后进行酒精 沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase而发生降解。 这里用 25： 24： 1的酚/ 氯仿/ 异戊醇是有很多道理的。酚（ Phenol ）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，但是 水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到

上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚 / 氯仿始终在下层，方便 水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水 相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），而用酚 / 氯仿的混合液进行抽提，跑到 水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进 行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的 回收。）

8. 将水相移入干净 eppendorf 管中 ,加入等体积的氯仿 / 异戊醇 （24： 1）振荡混匀 , 13000rpm离心 2min。

9. 将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇 ,振荡混匀后，置于室温下 2min， 然后 13000rpm离心 5min 。

（回收后的水相含有足够多的盐， 因此只要加入 2倍体积的乙醇， 在室温放置几分钟后离心就可 以将质粒 DNA 沉淀出来。）

10. 弃上清 ,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出 ,加入1mL 70 ％乙醇洗沉淀一次 , 振荡混

匀后， 13000rpm 离心 5min 。

（高浓度的盐会水合大量的水分子， 因此 DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。 如果感觉发

生了盐的沉淀， 就用70％的乙醇多洗几次， 每次在室温放置一个小时以上， 并用移液枪枪头 （tip ） 将沉淀打碎，就能得到好的样品。）

11. 吸除上清液 ,将管倒置于卫生纸上使液体流尽 ,室温干燥。