绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达

1 绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达

摘 要

绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。

关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆 表达

1. 前言

1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）

绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物

发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。

1.2 GFP 的结构

GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。 长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。

1.3 GFP的研究应用

GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。

本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。其上有所用酶的酶切 2 位点。

图1 绿色荧光水母 图2 GFP晶体结构 图3 质粒pEGFP-N1

2. 实验目的

2.1 PCR扩增目的基因

学习PCR的基本原理与实验技术；了解引物设计的一般要求；克隆目的基因。

2.2 PCR产物及质粒pET-28b的酶切、电泳

学习体外构建或鉴定重组DNA分子时，根据目的基因及载体选择合适的限制性内切酶；掌握琼脂糖凝胶的配制及电泳过程；学会观察酶切产物的酶切情况。

2.3 回收酶切产物

获取所需要的DNA片段

2.4 目的基因与载体的连接

用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。

2.5 重组DNA转化

在体外连接组装而成的重组DNA分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。通过实验学会重组DNA转化的最基本的操作以及如何提高转化效率的基本思路。

2.6 阳性菌落质粒的提取

掌握从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落方法。

2.7 重组子的鉴定

鉴定重组子的正确性的同时，了解重组子鉴定常用的几种方法及其原理，掌握其中一、两种鉴定方法的操作步骤。

2.8 GFP蛋白的诱导表达

掌握用IPTG诱导GFP基因表达和SDS-PAGE电泳的基本原理及基本操作步骤。 3 3. 实验原理

3.1 PCR扩增目的基因

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种最常用的体外基因扩增技术，其工作的基本原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端相互补的寡核苷酸为引物，在特殊的耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过多次循环反应，前一循环的产物DNA可继续作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使得目的DNA片段的量按2n方式呈指数级递增，所以该反应称为链式反应。PCR包括三个基本反应步骤：变性，退火，延伸。

3.2 PCR产物及质粒pET-28b的酶切、电泳

利用特定的限制性内切酶就能切割靶DNA的特定部位，得到特定长度的DNA片段或是得到特定粘性末端。在基因工程重组体的构建中，一般也必须选用合适的一种或两种限制性内切酶分别作用于目的基因以及载体，以得到相互匹配的粘性末端。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。用荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide, EB ）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。

3.3 回收酶切产物

利用试剂盒中胶块融化液 DR-I Buffer溶解琼脂凝胶，通过离心分离出DNA片段。

3.4 目的基因与载体的连接

重组DNA分子是在Mg2＋、ATP或NAD存在的连接缓冲液系统中，DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键，将两种 DNA分子进行连接。

3.5 重组DNA转化

带有外源DNA片段的重组体分子在体外构建成后，需要导入适当的宿主细胞内进行繁殖或表达出具有一定生物活性的蛋白。可以根据不同的受体选择不同的导入方式，如：转化、转染、感染。细菌表面通过CaCl2处理后，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面，双链DNA分子解链变成单链，单链DNA分子一条进入受体细胞内，另一条被降解。进入细胞内的单链DNA则复制成双链环状DNA，随同复制子同时复制，并被转录翻译。

3.6 阳性菌落质粒的提取 4 质粒提取试剂盒采用SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂白液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

3.7 重组子的鉴定

不同的克隆载体及相应宿主系统，其重组子的筛选和鉴定方法不尽相同。根据重组子遗传表型改变进行筛选，有-互补、插入灭活等方法；根据重组子结构来筛选，方法有限制酶切分析、PCR法以及杂交筛选等。通过这些方法的鉴定，我们可以确定是否在载体中插入了外源DNA，但是，如果该DNA片段来源于PCR扩增，或经突变改造后的产物，还要最终通过DNA序列分析，进行确定其是否与我们所要研究的目的基因的序列完全一致。

3.8 GFP蛋白的诱导表达

IPTG（异丙基硫代β-L半乳糖苷）是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。

GFP基因连接到pET-28b的多克隆位点，GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。接着BL21编码的T7 RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。

4. 实验设备

PCR仪 水平电泳槽 垂直电泳槽 电泳仪 恒温水浴锅 凝胶成像系统 台式高速离心机 微量加样枪 灭菌的薄壁离心管 超低温冰箱 恒温摇床 隔水式电热恒温培养箱 超净工作台 大容量冷冻离心机 制冰机 高压灭菌锅 紫外分光光度计

5. 实验材料及试剂

5.1 PCR扩增目的基因

质粒pEGFP-N1 ，Taq 酶：5U/μl，4×dNTP: 10mM each ，10×buffer（500mM KCl , 100mM

Tris-HCl（pH= 8.3）），MgCl2: 25mM ，灭菌去离子水

PCR引物：- F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA

- R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC

– Tm=56

DNA Fragment Purification Kit Ver2.0（Takara）

5.2 PCR产物及质粒pET-28b的酶切、电泳 5 纯化的扩增产物，质粒pET-28b，1 × K Buffer，无菌去离子水，限制性内切酶BamH I

和Nde I(10U/μL)，0.1%BSA缓冲液，琼脂糖，DNA Marker 5000，1％溴化乙锭(EB) 溶液，溴酚蓝，5×TBE溶液

5.3 回收酶切产物

DNA凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit)（Takara）

5.4 目的基因与载体的连接

ddH2O ，10×T4连接酶缓冲液，载体pET-28b片段，目的基因（GFP）片段，T4DNA连接酶，CH3COONa（pH5.2）,无水乙醇，乙醇，TE缓冲液

5.5 重组DNA转化

DH5α，BL21，pET-28b重组质粒DNA，质粒pET-28b，LB液体培养基，LB固体培养基，卡那霉素（Kan）, 100mmol/L CaCl2 溶液

5.6 阳性菌落质粒的提取

阳性菌落，LB培养液，质粒提取试剂盒（百泰克）

5.7 重组子的鉴定

重组质粒，限制性内切酶（BamH I ，Nde I）(10U/μL) (TaKaRa公司)

5.8 GFP蛋白的诱导表达

感受态菌BL-21，重组质粒，LB培养液，LB固体培养基，IPTG，2×蛋白质样品缓冲液，

30%丙烯酰胺，10%过硫酸铵，TEMED ，上胶缓冲液，下胶缓冲液，1×甘氨酸电泳缓冲液，

染色液，脱色液，卡那霉素（Kan)，Marker

试剂的配制：

2×Premix 的配制：

无菌去离子水 5840μl

10×Buffer 2000μl

4×dNTP 400μl ( 终浓度：0.4mM )

MgCl2 1600μl( 终浓度：4mM )

Taq 酶 160μl ( 终浓度约 0.1U/μl )

合计 10ml ，混匀，按需分装，-20℃ 保存

1%琼脂糖凝胶液配制： 6 1g 琼脂糖放于三角烧瓶中，加0.5×TBE 100mL，摇匀。隔水煮沸或用微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，冷却到60℃，加入1％ EB至终浓度为0.5-1ug/ml，并摇匀。

5×TBE溶液：54gTris，27.5g硼酸，0.5mol/LPH=8.0EDTA 20mL,溶于去离子水中，定容至1L,电泳时10倍稀释使用。

溴酚蓝：先配制成0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合即可

TE缓冲液（pH8.0）[10mmol/L Tris-HCl；1mmol/L EDTA]的配制：

药品名称

1mol/L Tris-HCl(pH8.0) 10ml 1ml

500mol/L EDTA(pH8.0) 2ml 0.2ml

ddH2O 定容至1000ml 定容至100ml

LB培养基的配制：

组成 液体 固体

蛋白胨（Trypton） 10g 10g

酵母提取物（Yeast

Extract） 5g 5g

NaCl 10g 10g

琼脂（Agar） 15g

蒸馏水 定容至1000ml 定容至1000ml

注）于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟

卡那霉素（Kan）:用前在无菌试管中,用灭菌水配制,母液浓度为100mg/ml。

100mmol/L CaCl2 溶液：称取无水CaCl25.6克，加重蒸水至500 毫升，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

2×蛋白质样品缓冲液：Tris 0.15g ，β-巯基乙醇 1.0ml ，溴酚蓝 0.02g ，甘油