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海产品中副溶血性弧菌的分离、鉴定及与临床分离株的生化性
状比较
宁喜斌;刘代新;张继伦
【期刊名称】《微生物学通报》
【年(卷),期】2008(35)6
【摘要】利用TCBS和科玛嘉两种选择性培养基从60份海产品中初筛得到27株疑似副溶血性弧菌,经生化鉴定,27株均为副溶血性弧菌,其中22株是从鲜活海产品中分离得到,5株从冷冻海产品中分离得到.进一步与临床上得到的32株副溶血性弧菌进行了四个特殊生化试验的比较,结果发现副溶血性弧茵临床分离株与海产品分离株在溶血、脲酶及枸橼酸盐利用3个生化试验上存在差异,而阿拉伯糖利用试验无差异,这为根据生化性状研究不同来源副溶血性弧菌提供基础.
【总页数】5页(P918-922)
【作者】宁喜斌;刘代新;张继伦
【作者单位】上海水产大学食品学院,上海200090;上海水产大学食品学院,上海200090;上海出入境检验检疫局,上海201202
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
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水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定 6中国兽医杂志2010年(第46卷)第11期ChineseJournalofVeterinaryMedicine水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定于雪芝,章丽娇,康冬柳.,何伟勇,韩博,苏敬良(1.中国农业大学动物医学院农业部人畜共患病重点开放实验室,北京海淀100193;2.汀西省吉安市畜牧兽医局,江西吉安343000)摘要:噬菌蛭弧菌为一类杆形,弧形或螺旋形的革兰阴性菌,可以寄生并裂解其他细菌.本试验以禽源大肠杆菌,沙门菌以及环境水体中分离的1株大肠杆菌为宿主菌,采用双层琼脂培养法成功地从环境水体中分离到3株噬菌蛭弧菌,分别命名为BDD,BDE,BDH.电镜观察证明菌体大小约0.33/am×0.78/am,单个弧形,一端有一根长鞭毛.基因序列分析表明,分离株与已发表的噬菌蛭弧菌属其他菌株16SrRNA基因序列的同源范围分别为96.0,99.9.通过对不同细菌的裂解试验证明,3个分离株对大肠杆菌,沙门菌,摩根摩根氏菌,变形杆菌和阴沟肠杆菌等均具有裂解作用,但对铜绿假单胞菌,鸭疫里默氏菌和金黄色葡萄球菌不敏感.关键词:噬菌蛭弧菌;分离;鉴定中图分类号:$852.61文献标识码:A文章编号:0529—6005(2010)11—0006—03 Isolationandidentificati0nofBdellovibrio6ncfrfo1,orllfromriverwaterYUXue—zhi,ZHANGLi—jiao,KANGDong—liu,HEWei—yong,HANBo,SUJing—liang(1.KeyIaboratoryofZoonosisofMinistryofAgriculture,CollegeofVeterinar yMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China;2.AnimalHusbandryandVeter inaryBureauofJianinJiangxiProvince,Jian343000,China)Abstract:BdellovibriobacteriovorusareGramnegative,small,arc—shaped,motilebacteria.Theyin—vadetheperiplasmofotherlargergram—negativebacteria,killinganddigestingthem.ThiscapabilitymakesBdellovibrioapotentialtherapeuticagentforsomebacteriainfections .Inthisstudy,threeBdellov—ibriostrainsdesignatedasBDD,BDEandBDHwereisolatedfromriverwatersampl esusingSalmonellaandEscherichiacoliaspreycells.A1lisolatesshowedtypicalmorphologyunde relectronmicroscopewiththesizeof0.33m×0.78/*mandapolarflagellum.Genesequenceanalysisshowedthatthe16SrRNA genesoftheseisolatesshared96.0to99.9homologywithotherBdellovibriostrains publishedinGenBank.BacterialysistestdemonstratedthattheseisolatescouldlyseE.col i,Salmonellaentgritidis,Morganellamorganii,Proteusspp.andEnterobactercloacae,butnotsensitive forPseudomonasaerugi—nosa,RiemerellaanatipestiferandS,aph,OcOccusaureus.Keywords:Bdellovibriobacteriovorus;isolation;identificationCorrespondingauthor:SUJing—liang噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio(teriovorus,Bd)是一类体形较小,广泛分布于土壤,海水,污水等环境中,运动极活泼的革兰阴性菌.该菌具有"寄生"和"裂解(溶菌)"宿主菌的生物学特性,最早是由Stopl等在菜豆枯萎病假单胞菌体中发现.在显收稿日期:20100520基金项目:中国农业大学2009URP计划资助作者简介:于雪芝(1986一),女,本科牛,从事动物医学专业学习,Email:yu51422396@126.corn;章丽娇(1987),女,本科生,从事动物医学专业学习,Email:zhang62810003@126.CO1TI通讯作者:苏敬良,Email:jinglsu@yahoo.COlll注:第1作者与第2作者对本文同等贡献微镜下观察表明,噬菌蛭弧菌呈弧形,杆状或逗点状,大小为0.3,0.6/am×0.8m,1.2m.单极端生一根长而粗的鞭毛通常呈波状,由鞭毛鞘和轴心组成,与菌体运动和侵袭功能直接相关,被认为是噬菌蛭弧菌的重要特征之一.在环境中一般不利用周围的营养物质,必须依赖宿主细胞进行生长,发育和繁殖,最后使宿主菌细胞裂解_2].蛭弧菌在河口,海洋,河水,生活污水,鱼塘和灌溉用水等环境系统中分布广泛.在螃蟹腮上,江河湖泊的沉积物,土壤,水稻田和植物根围均可分离到蛭弧菌,同时在动物肠道中也能分离得到蛭弧菌l_3]. 因为噬菌蛭弧菌对革兰阴性细菌具有很强的裂解能中国兽医杂志2010年(第46卷)第1】期7力,而且试验证明,其对致病菌肠道病原菌的裂解能力明显大于非致病菌,越来越多的科研人员试图开发利用噬菌蛭弧菌作为微生态制剂用于水体及环境病原菌净化,病原菌感染的预防和治疗等一.随着养殖业的发展,养殖水体污染许多革兰阴性病原菌, 如嗜水气单胞菌等,对水产动物造成了越来越严重的危害,以噬菌蛭弧菌为基础的微生态制剂在该病的预防控制中显示了良好的应用前景.本研究通过对环境水体中噬菌蛭弧菌进行分离和鉴定,旨在获得对常见肠道病原菌具有广谱裂解作用的分离株, 以期为后续高效优质噬菌蛭弧菌的筛选和相应生物制剂的开发奠定基础.1材料与方法1.1菌株大肠杆菌YZ株(分自河水),大肠杆菌 lxq050,沙门菌lxq033,摩根摩根氏菌,鸭疫里默氏菌为本实验室分离鉴定.大肠杆菌CVCC1450,沙门菌肠炎亚种CMCC50094,铜绿假单胞菌CM— CC10104,变形杆菌CMCC49027,阴沟肠杆菌阴沟亚种CMCC45301,金黄色葡萄球菌金黄亚种CM— CC26003购自中国兽医药品监察所.1.2噬菌蛭弧菌的分离和纯化1.2.1宿主菌悬液的制备分别将大肠杆菌 lxq050,大肠杆菌YZ株和肠炎沙门菌lxq033接种于IB培养基中,37?振荡培养约10h,取培养物经 5000r/min,(4?)离心10min,取沉淀,用25mL 的HM缓冲液悬浮沉淀,重复离心1次,用1mI HM缓冲液悬浮沉淀:.1.2.2样品的处理以及稀释液制备取河水样品约250mL低速离心(500r/min离心5min),除弃大颗粒杂质后,上清液高速(27000r/rain,4?)离心20rain,再用3mIHM缓冲液悬浮沉淀,经过 1.2m孔径无菌滤膜过滤收集滤液,并用HM缓冲液作10倍系列稀释.1.2.3噬菌蛭弧菌的分离和纯化取1mL宿主菌悬液加入到含有6mI融化的HM 上层琼脂试管中快速摇晃混匀,迅速加入200I稀释的样品滤液,摇匀后迅速倒人HM下层培养基上,待上层琼脂在室温下凝固后将平板倒置,28?培养,待噬斑形成后,挑取单个噬斑至1.5mL无菌离心管中,加入 1mLHM缓冲液,然后在振荡器上振动3min,使蛭弧菌充分释放,经稀释后采用上述方法经过连续4 代噬斑筛选获得纯的噬斑培养物.1.3噬菌蛭弧菌的鉴定1.3.1革兰染色挑取培养基上的噬斑置于载玻片上,滴一滴无菌水覆盖,涂布后弃去噬斑残存琼脂,进行革兰染色.1.3.2透射电镜观察挑取培养基上的3个噬斑置于1.5mL离心管中,加60LHM缓冲液于 28?浸泡约17h,取菌液,醋酸铀负染后在透射电子显微镜(JEM1230)下观察细菌的形态. 1.3.3PCR鉴定参照文献E73合成噬菌蛭弧菌 16SrRNA基因的特异性引物842R:5r_CGW CACTGAAGGGGTCAA一3和63F:5一CAGGC— CTAACACATGCAAGTC 一3.挑取培养基上的分离菌株噬斑置于1.5mL离心管中,加入1mI无菌水后振荡3min使其充分释放.经过0.45m滤膜过滤后,取滤液于98?水浴加热10rain,冰浴3min 制备基因组DNA模板.PCR扩增热循环条件为: 94?热变性4rain;之后94?1min,54?退火 1rain,72?延伸90S,35个循环,最后72?延伸 10rain.PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳观察记录结果并进行序列测定(北京三博远志科技有限公司).1.4噬菌蛭弧菌宿主范围的测定分别以1.1所列出的菌株为宿主菌,加入所分离噬菌蛭弧菌,采用 HM双层琼脂平板培养法28?培养观察2周以上, 监测和记录蛭弧菌菌株对选定宿主菌的裂解情况, 以形成肉眼可见的噬斑作为裂解阳性判定标准.1.5噬菌蛭弧菌的简单保存将分离菌株在4?HM双层琼脂平板中保存,分别放置1周,1个月,2 个月,3个月检测活性.此外,刮取双层培养基中含有噬菌蛭弧菌使其充分释放到HM缓冲液分装到 1.5mL冻存管中,于液氮中迅速冷冻,保藏于一8O?,1个月和3个月分别检测其活性. 2结果与分析2.1噬菌蛭弧菌的分离与纯化以大肠杆菌或沙门菌作为宿主菌,采用双层琼脂平板培养,28?培养 3d出现肉眼可见透明噬斑,7d后噬斑直径约2, 4mm.经过噬斑纯化传代后各分离株形成比较均一的噬斑.2.2噬菌蛭弧菌的鉴定2.2.1形态学观察样品经革兰染色后,在光学显微镜下可见两种大小的革兰阴性菌,其中大杆菌为宿主菌,小杆菌为噬菌蛭弧菌.样品经过醋酸铀负染后,在电镜下可见有大量噬菌蛭弧菌(见图1),菌体有单个弯曲,大小约为0.33mX0.78m,菌体一端有一根长鞭毛,少量噬菌蛭弧菌附着于宿主菌体上. 2.2.2PCR鉴定以及基因测序分析采用噬菌蛭弧菌16SrRNA基因特异性引物,以3个分离株的基因组DNA为模板成功地扩增出预期的基因片段,而宿主菌基因组DNA对照结果为阴性.基因序列分析结果证明BDD(GenBankAccessionNo.:HM219227),BDE(GenBankAccessionNo.:HM219228),BDH(Gent~nkAccessionNo.:HM219229).分离株与 8中国兽医杂志2010年(第46卷)第1I期图1噬菌蛭弧菌BDE负染透射电镜照片1:大肠杆菌宿主菌;2:噬菌蛭弧菌BDE分离株mCm.凸噬菌蛭弧菌属其他菌株16SrRNA基因序列的同源范围分别为96.5,99.9Yo,96.0,99.3,96.3,99.4,同源性比较见表1.其中,与噬菌蛭弧菌DSM50705株和ARL一12株同源性最高,为99.2,99.9;与标准菌株HD100的同源性达97.9,98.6;与BEP2和BEP4同源性差异最大.2.2.3噬菌蛭弧菌宿主范围的测定在28?的环境下培养2周后观察噬斑的生长情况见表2,结果发现噬菌蛭弧菌分离株对不同宿主菌的敏感性有一定的差异.BDD和BDH对各宿主菌的裂解能力相似,但BDD对沙门菌肠炎亚种CMCC50094裂解力表1BDD,BDE,BDH分离株与噬菌蛭弧菌属部分菌株16SrRNA序列的同源性比较PercentIdentity12345678910"12131啊_l9929999g6986g9.496596598698.798.6987986'BDD.seq 20.9艚l{993992g7998796096097998.097.99809e02BDEseq 3010.7粗一;99498499:396396398.498698.488688.43BDHseq404080.8}I{986996g71971g8698698.69869884BDARL_1216Sseq 514211614啊?{99096896.8100.099.8100O99898.95BDHD'00(AJ292759".seq6061307041.0{??{9729729g099098.999.088.86BDDSMSOT05(AJ278145.1).seq 7364.2382.93.32.8糖?IIoo096896g97.298796.37BDBEP2(^FI48938.1).seq 8364238293329nnIi9RR96997.29679638BDBRP4(AF1489391)seq 9142116140O10333.3}9980009g89999BDHDI27(AJ292760.1).seq10132014140210323202溷—雕99.8g989g710BDSRE7(AF2638321).seq "1421161400112.9290.0一一ll|簟l99899911BDTu?113(AY0941221).seq 12132014140210343402020.299712BDJeF1(EU884925.1)seq13142.01613011238380103010.3龋量{13BDVletnam(AY094123.1)seq12345678910"1213要弱于BDH.BDE对大肠杆菌lxq050,肠炎沙门菌lxq033的裂解力稍弱于其他两株.3株分离菌株均不能裂解铜绿假单胞菌,鸭疫里默氏菌,金黄色葡萄球菌金黄亚种.BDE不能裂解变形杆菌.表2分离菌株BDD,BDE,BDH的宿主范围"+":噬菌蛭弧菌对宿主菌有裂解作用;"+"数量:噬菌斑大小;"2.2.4噬菌蛭弧菌的简单保存经检测,噬菌蛭弧菌在HM双层琼脂平板中,4?保存2个月后仍能存活,3个月后活性明显降低,部分菌株失活.在一80?冻存至少可保藏3个月以上,但保存的噬菌蛭弧菌在初代复苏过程中,噬斑增长速度减缓.":蛭弧菌对该宿主菌不裂解,无噬斑3讨论本试验采用双层琼脂平板法从水体环境中成功地分离到3株噬菌蛭弧菌.试验过程参照Varon和Shilo等的方法引,使用低速离心去较大颗粒中国兽医杂志2010年(第46卷)第11期9J]l一甘露聚糖酶对鸡血浆中1一酸性糖蛋白的影响梁增成,刘盼琦,诸葛增玉,高浩嵩,马金磊,颜晓冬,孙艳争(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)摘要:本论文研究了在正常养殖状况下于饲料中添加药物和p一甘露聚糖酶后对肉鸡血浆酸性糖蛋白(AGP)水平,生产性能的影响.试验选择健康肉鸡1500只,随机分为3组:一个对照组和两个试验组,每组500只.各个组都添加盐霉素(60g/t饲料)防球虫感染.第1组为对照组(CONTR),不添加杆菌肽锌和口一甘露聚糖酶,第2组添加杆菌肽锌(5Og/t饲料,ZINEB)而不添加B一甘露聚糖酶,第3组添加p一甘露聚糖酶(100g/t饲料,MANNS)而不加杆菌肽锌.整个试验期为42d.试验过程中肉鸡自由采食,自由饮水.结果表明,与对照组相比,两个试验组鸡只血浆中的AGP均明显降低,且p一甘露聚糖酶对成鸡比杆菌肽锌更有效.在肉鸡生产性能水平方面,添加杆菌肽锌和添加pI甘露聚糖酶对降低料肉比,提高饲料效率均具有明显的作用,且甘露聚糖酶更有效.关键词:甘露聚糖酶;el一酸性糖蛋白;肉鸡中图分类号:$852.2文献标识码:A文章编号:05296005(2010)11—0009,03 Effectof~-mannanaseonplasmaAGPlevelofbroilersLIANGZeng—cheng,LIUPan—qi,ZHUGEZeng—yu,GAOHao—song, MAJin—lei,YANXiao—dong.SUNYan—zheng(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing1001 93,China)Abstract:ThisstudyW3StOinvestigatetheeffectof—mannanasesupplementationtodietonbroiler plasma1-acidglyeoprotein(AGP)levelandperformance.Onethousandandfivehundredbr oilerswere收稿日期:200909—07作者简介:梁增成(1965一),男.兽医师,博士,主要从事兽医微生物与肠道营养研究,Email:liangzch@263.eom 通讯作者:孙艳争,Email:sunyanzheng258O@ 的杂质,然后用高速离心法收集浓缩菌体并尽可能[2]秦巨生.噬菌蛭弧菌及其微生物生态制剂在水生动物养殖上除去较小的噬菌体,用孔径为1.2m的滤膜过滤[.]竿需:菌的抑制作除去宿主菌,取得了较好的效果,大大提高了目标菌用lD]. 扬州:扬州大学硕士学位论文,2()(]7.的分离率.[4]李戈强,章勇趣,徐伯亥.不同条件下蛭弧菌裂解河弧菌的研 ,, 等.电镜观竺毫噬菌弧菌5,等..噬菌蛭弧菌的分离及初步鉴定?.单弧状,端生单鞭毛,这与郑英珍等运用扫佃44b吧,4~镜水生生物学抿29, ,3319(68),:22(3).:2.65-271.oolO83lO87….,观察到的形态相似.基因序列分析证明,所分离的[6]李楠,倪学勤,潘康成.鸡源蛭弧菌的分离及其对鼠伤寒沙菌株与所报道的噬菌蛭弧菌具有高度同源性,裂解门氏菌病的治疗作用[J]_中国兽医杂志,2..,3(1):宿主范围与Pineiro等报道基本相似,只是对铜绿E7]JkevitchE.I.1ti.d.1iti..fBzz.拍.d假单胞菌的裂解性有差异,这可能与噬菌蛭弧菌菌likeorganismsEJ].cu"ProtocMicrobio1,2005,7B1—17.株及宿主菌种的不同有关.初步保存试验结果表E8]Var0l1M,shiloM?Meth.dforseparati.n.fBd.ribri.明,4~CHM双层琼脂平板法操作简便,蛭弧菌的活i三i.o.nbyffiltrai.tionrtIh]ro.gRh.m性好,适用于短期保存.O..1970,18—19:145151. 参考文献:PineirodSAh,lS.ah.aniui.kGEl,iRo.mfbBergE1,ebtal.Predafr0tionpahtEliStoplH,StarrMP.Bdellovibriobacterioworusgen.etsp.n.,GreatSaltLake ,Utah[J].CurrMicrobio1,2004,48(2):apredatory,ectoparasiticandbacteriolyticmicroorganism[J].1I3-I17.。
弧菌的观察实验报告实验目的本实验旨在通过观察和研究弧菌的生长过程，了解其形态特征、生长条件以及对人体的影响，为进一步研究弧菌的生态学和病原学提供参考。
实验原理弧菌（Vibrio）是一类革兰氏阴性菌，常见于水环境中，其中某些种类是人类和动物肠道感染的致病菌。
实验中我们将通过培养观察的方法，研究弧菌的生长过程及其形态变化。
实验材料和方法实验材料：- 弧菌培养基- 无菌平皿- 实验手套- 滤纸实验方法：1. 取一块无菌滤纸，用无菌夹子夹住，浸入弧菌培养基中，确保滤纸完全湿润。
2. 用无菌酒精灯烧热实验夹子，将夹子对准培养皿的中心，将浸有弧菌培养基的滤纸夹起。
3. 将夹有滤纸的实验夹子，快速平行放置在无菌平皿上，等待培养基凝固。
4. 取一支无菌的钢针，蘸取已有弧菌培养基的菌落，均匀涂抹在培养基上。
5. 在标准实验室温度（28-30）下，将培养皿放置于恒温箱中，观察培养基上弧菌的生长情况。
6. 每隔一段时间，使用显微镜对培养皿中的弧菌进行观察和记录。
实验结果通过实验观察，我们得到了以下结果：1. 弧菌在培养基上生长迅速，一般在2-8小时内就可以观察到明显的生长现象。
2. 初始阶段，菌液呈透明或微浑浊状态，菌落大小较小。
3. 随着时间的推移，菌液呈现出浑浊状态，菌落逐渐增大并形成不规则形状。
4. 培养皿表面出现较多的菌落，呈黄绿色或蓝绿色。
实验讨论通过观察实验结果，我们可以得出以下结论：1. 弧菌对温度和湿度要求较高，适宜的生长温度为28-30，适宜的湿度为60-70%。
2. 弧菌在富含有机物质、微量元素和适宜酸碱度的培养基中生长得更好。
3. 弧菌的生长周期较短，可能与其较高的代谢活性有关。
4. 弧菌的生长过程中可能会产生一些代谢产物，如海藻酸等，对人体可能具有一定的致病作用。
实验结论通过本次实验，我们对弧菌的形态特征、生长条件以及对人体的影响有了初步了解。
我们发现，弧菌对温度和湿度要求较高，适宜的生长温度为28-30，适宜的湿度为60-70%。
