3T3-L1诱导分化成熟脂肪细胞方案

3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。

100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。

保存温度我记不清了，你自己查一下。

Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。

最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。

一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。

未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。

许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。

提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。

3T3-L1细胞诱导分化首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX 是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO 溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。

这是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。

一般说不能超过20代，最好在10代以内。

诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。

诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。

DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。

可用2年。

Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。

4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX （储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

中国畜牧兽医2022,49(7):2631-2644C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n em i R-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究原佳慧,张鹏翔,吉树森,卢嘉茵,罗小毛,闫艺,王海东(山西农业大学动物医学学院,太谷030801)摘要:ʌ目的ɔ研究m i R-140-5p在前脂肪细胞(3T3-L1)成脂分化过程中的功能及其作用机制㊂ʌ方法ɔ待3T3-L1细胞汇合度达100%时诱导其成脂分化,收集分化第―1(诱导分化前1d)㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天的细胞,用实时荧光定量P C R检测m i R-140-5p相对表达量;将m i R-140-5p m i m i c s㊁N C转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,实时荧光定量P C R检测成脂标志基因C A A T增强子结合蛋白β(C/E B Pβ)㊁C A A T增强子结合蛋白δ(C/E B Pδ)与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(P P A Rγ)相对表达量;利用m i R a n d n和T a r g e t S c a n在线网站预测m i R-140-5p的靶基因;通过对比序列差异分析P300/C B P相关因子(P C A F)的3'-U T R序列中与m i R-140-5p的结合位点序列在小鼠㊁人等不同物种间的序列保守性㊂将m i R-140-5p m i m i c s㊁i n h i b i t o r㊁N C转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,实时荧光定量P C R检测m i R-140-5p㊁P C A F相对表达量,W e s t e r nb l o t t i n g检测P C A F蛋白水平;将P E G F P-N1-P C A F㊁P E G F P-N1转染3T3-L1细胞,油红O染色观察脂滴形成情况,实时荧光定量P C R检测P C A F㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因相对表达量,W e s t e r nb l o t t i n g检测C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ蛋白表达水平㊂将3条P C A F s i R N A(s i R N A1㊁s i R N A2㊁s i R N A3)㊁s i R N A N C转染3T3-L1细胞,W e s t e r nb l o t t i n g法检测P C A F蛋白水平,筛选最佳P C A Fs i R N A㊂将最佳P C A Fs i R N A和s i R N A N C转染3T3-L1细胞,油红O染色观察脂滴形成情况,实时荧光定量P C R检测P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ与P P A Rγ基因相对表达量,W e s t e r nb l o t t i n g检测C/E B Pβ㊁P P A Rγ蛋白表达水平㊂分别将m i R-140-5p m i m i c s㊁N C与P G L0-P C A F3'-U T R载体和P G L O空载体共转染293T细胞,用双荧光素酶报告试验检测m i R-140-5p与P C A F的靶向关系㊂ʌ结果ɔ在诱导3T3-L1细胞成脂分化过程中,与诱导分化前1d相比,在细胞成脂分化第1㊁2天时m i R-140-5p相对表达量极显著升高(P<0.01),在分化第3天时显著升高(P<0.05)㊂与N C组相比,m i R-140-5p m i m i c s组脂滴数量明显增加,m i R-140-5p m i m i c s组成脂标志基因C/E B Pδ与P P A Rγ相对表达量均极显著升高(P<0.01)㊂靶基因预测结果表明,m i R-140-5p与P C A F存在预期结合位点;保守性分析结果表明,靶基因P C A F结合位点序列在不同物种间具有高度保守性㊂与N C组相比, m i m i c s组m i R-140-5p和P C A F相对表达量均极显著升高(P<0.01),i n h i b i t o r组m i R-140-5p极显著降低(P<0.01)㊁P C A F显著降低(P<0.05),P C A F蛋白表达量显著升高(P<0.05)㊂与P E G F P-N1组相比,P E G F P-N1-P C A F组脂滴数量增多,P C A F㊁P P A Rγ基因相对表达量和C/E B Pβ㊁C/E B Pδ蛋白水平极显著升高(P<0.01), P P A Rγ蛋白水平显著升高(P<0.05)㊂P C A Fs i R N A1㊁s i R N A2与s i R N A3均极显著抑制P C A F蛋白的表达(P<0.01),s i R N A3的效果最显著,因此选择s i R N A3进行后续试验㊂与N C组相比,P C A Fs i R N A3组3T3-L1细胞中脂滴数量较少,P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因相对表达量和C/E B Pβ蛋白水平均极显著下降(P<0.01)㊂双荧光素酶报告试验结果显示,m i R-140-5p与P C A F基因之间无靶标关系㊂ʌ结论ɔ内源性m i R-140-5p在3T3-L1细胞分化过程中表达升高,m i R-140-5p可能通过间接上调P C A F基因表达促进3T3-L1细胞成脂分化㊂关键词:m i R-140-5p;P300/C B P相关因子;3T3-L1细胞;成脂分化中图分类号:Q254文献标识码:AD o i:10.16431/j.c n k i.1671-7236.2022.07.021开放科学(资源服务)标识码(O S I D):收稿日期:2021-12-31基金项目:山西省留学人员科技活动择优资助项目;山西省优秀人才科技创新项目(201805D211012)联系方式:原佳慧,E-m a i l:187********@163.c o m㊂通信作者王海东,E-m a i l:w a n g h a i d o n g@s x a u.e d u.c n2362中国畜牧兽医49卷M e c h a n i s mo fm i R-140-5p o nA d i p o g e n i cD i f f e r e n t i a t i o no f P r e a d i p o c y t e s3T3-L1 Y U A NJ i a h u i,Z H A N GP e n g x i a n g,J I S h u s e n,L UJ i a y i n,L U O X i a o m a o,Y A N Y i,WA N G H a i d o n g(C o l l e g e o f A n i m a lM e d i c i n e,S h a n x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,S h a n x i P r o v i n c e,T a i g u030801,C h i n a)A b s t r a c t:ʌO b j e c t i v eɔT h ea i m o f t h i ss t u d y w a st o i n v e s t i g a t et h ef u n c t i o na n d m e c h a n i s m o f m i R-140-5p i nt h ed i f f e r e n t i a t i o n o f p r e a d i p o c y t e s3T3-L1.ʌM e t h o dɔW h e nt h ec o n v e r g e n c e d e g r e eo f3T3-L1c e l l sr e a c h e d100%,t h ea d i p o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n w a s i n d u c e d.T h ec e l l so f d i f f e r e n t i a t i o nd a y―1(t h ed a y b e f o r ed i f f e r e n t i a t i o ni n d u c t i o n),d a y s0,1,2,3,5a n d7w e r e c o l l e c t e d,a n d t h e e x p r e s s i o n o fm i R-140-5p w a s d e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R.m i R-140-5p m i m i c s a n dN Cw e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s t o i n d u c e a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n.O i l r e d Os t a i n i n g w a su s e dt oo b s e r v e t h e f o r m a t i o no f l i p i dd r o p l e t s.R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R w a s u s e dt o d e t e c tt h er e l a t i v ee x p r e s s i o n so fa d i p o g e n i c m a r k e r g e n e s C A A T e n h a n c e rb i n d i n g p r o t e i nβ(C/EB Pβ),C A A Te n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i nδ(C/E B Pδ)a n d p e r o x i s o m e p r o l i f e r a t o r-a c t i v a t e d r e c e p t o rγ(P P A Rγ).T h et a r g e t g e n eo f m i R-140-5p w a s p r e d i c t e db y m i R a n d na n d T a r g e t S c a no n l i n ew e b s i t e s,t h e s e q u e n c e c o n s e r v a t i o no f t h e b i n d i n g s i t e s e q u e n c e o f P300/C B P-r e l a t e d f a c t o r(P C A F)3'-U T Rs e q u e n c ea n d m i R-140-5p i nd i f f e r e n ts p e c i e ss u c ha s m i c ea n d h u m a n sw a sa n a l y z e db y c o m p a r i n g t h es e q u e n c ed i f f e r e n c e s.m i R-140-5p m i m i c s,i n h i b i t o ra n d N Cw e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s a n d t h e c e l l sw e r e i n d u c e d t o d i f f e r e n t i a t e i n t o a d i p o c y t e s. T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o fm i R-140-5p a n dP C A Fw a s d e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R,a n d t h e p r o t e i n l e v e l o fP C A F w a sd e t e c t e db y W e s t e r nb l o t t i n g.P E G F P-N1-P C A Fa n dP E G F P-N1 w e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s.O i l r e dOs t a i n i n g w a su s e d t oo b s e r v e t h e f o r m a t i o no f l i p i d d r o p l e t s.R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R w a s u s e dt o d e t e c tt h er e l a t i v ee x p r e s s i o n o f P C A F, C/E B Pδa n d P P A Rγg e n e s.W e s t e r n b l o t t i n g w a s u s e d t o d e t e c tt h e e x p r e s s i o nl e v e l s o f C/E B Pβ,C/E B Pδa n dP P A Rγp r o t e i n s.T h r e eP C A Fs i R N A s(s i R N A1,s i R N A2a n ds i R N A3) a n d s i R N A N C w e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s.T h e p r o t e i nl e v e l o fP C A F w a sd e t e c t e db y W e s t e r nb l o t t i n g t os c r e e nt h eb e s tP C A Fs i R N A.O p t i m a lP C A Fs i R N Aa n ds i R N A N C w e r e t r a n s f e c t e d i n t o3T3-L1c e l l s,a n dt h ef o r m a t i o no fl i p i dd r o p l e t s w a so b s e r v e d b y o i lr e d O s t a i n i n g.T h e r e l a t i v ee x p r e s s i o no f P C A F,C/E B Pβ,C/E B Pδa n d P P A Rγg e n e sw e r ed e t e c t e d b y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R,a n d t h e e x p r e s s i o no fC/E B Pβa n dP P A Rγp r o t e i nw e r ed e t e c t e d b y W e s t e r n b l o t t i n g.m i R-140-5p m i m i c s,N C,P G L0-P C A F3'-U T R v e c t o ra n d P G L O e m p t y v e c t o rw e r e c o-t r a n s f e c t e d i n t o293Tc e l l s,r e s p e c t i v e l y.T h e t a r g e t i n g r e l a t i o n s h i p b e t w e e n m i R-140-5p a n d P C A F g e n ew a s d e t e c t e db y d o u b l e l u c i f e r a s e r e p o r t t e s t.ʌR e s u l tɔI nt h e p r o c e s so f i n d u c i n g a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n o f3T3-L1c e l l s,c o m p a r e d w i t h t h e d a y b e f o r ei n d u c i n g d i f f e r e n t i a t i o n,t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no fm i R-140-5p w a s e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e do n t h e d a y1a n d d a y2o f a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n(P<0.01)a n dw a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d o n t h e d a y 3d a y o fd i f f e r e n t i a t i o n(P<0.05).C o m p a r e d w i t h N C g r o u p,t h en u m b e ro f l i p i dd r o p l e t s i n m i R-140-5p m i m i c s g r o u p w a s i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y,a n d t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f l i p i dm a r k e r g e n e s C/E B Pδa n d P P A Rγi n m i R-140-5p m i m i c s g r o u p w e r ee x t r e m e l y i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y (P<0.01).T h e r e s u l t o f t a r g e t g e n e p r e d i c t i o n s h o w e d t h a tm i R-140-5p h a d t h e e x p e c t e d b i n d i n g s i t ew i t hP C A F.T h er e s u l t so fc o n s e r v a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a t t h eb i n d i n g s i t es e q u e n c eo f t a r g e t g e n e P C A F w a sh i g h l y c o n s e r v e da m o n g d i f f e r e n t s p e c i e s.C o m p a r e dw i t h N C g r o u p,t h e7期原佳慧等:m i R-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究r e l a t i v e e x p r e s s i o n s o fm i R-140-5p a n d P C A F g e n e i nm i m i c s g r o u p w e r e e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d(P<0.01),w h i l e t h o s e i n i n h i b i t o r g r o u p w e r e e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P<0.01),P C A F w a ss i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P<0.05),a n dt h ee x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05).C o m p a r e dw i t hP E G F P-N1g r o u p,t h e n u m b e r o f l i p i dd r o p l e t s i nP E G F P-N1-P C A F g r o u p w a s i n c r e a s e d,a n d t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f P C A F a n d P P A Rγg e n e sa n dt h el e v e l so fC/E B Pβ,C/E B Pδp r o t e i n w e r ee x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.01),P P A Rγp r o t e i n w a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05).P C A F s i R N A1,s i R N A2a n d s i R N A3a l l e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n(P<0.01),a n d s i R N A3h a d t h em o s t s i g n i f i c a n t e f f e c t,s o s i R N A3w a s s e l e c t e d f o r t h e f o l l o w-u p t e s t.C o m p a r e d w i t hN C g r o u p,t h e n u m b e r o f l i p i d d r o p l e t s i n3T3-L1c e l l s i nP C A Fs i R N A3g r o u p w a s l e s s,t h e e x p r e s s i o no f P C A F,C/E B Pβ,C/E B Pδa n d P P A Rγg e n e s a n d t h e l e v e l o f C/E B Pβp r o t e i nw e r e e x t r e m e l y d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.01).T h e r e s u l t so f d o u b l e l u c i f e r a s e r e p o r t t e s t s h o w e d t h a t t h e r e w a sn ot a r g e tr e l a t i o n s h i p b e t w e e n m i R-140-5p a n d P C A F g e n e.ʌC o n c l u s i o nɔT h e e x p e r i m e n t p r o v e dt h a tt h ee x p r e s s i o n o fe n d o g e n o u s m i R-140-5p w a si n c r e a s e d d u r i n g t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f3T3-L1c e l l s.m i R-140-5p m i g h t p r o m o t e t h e a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n o f3T3-L1c e l l s b y i n d i r e c t l y u p-r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o no f P C A F g e n e.K e y w o r d s:m i R140-5p;P300/C B P-r e l a t e d f a c t o r s;3T3-L1c e l l s;a d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n肌内脂肪是反映动物肉品质的重要指标,其含量直接影响动物肉的风味㊁嫩度㊁多汁性及大理石花纹的分布[1]㊂脂肪组织是动物体内重要的分泌组织,脂肪细胞会分泌瘦素㊁脂联素等[2-3]㊂哺乳动物脂肪组织主要分为白色脂肪组织㊁棕色脂肪组织和米色脂肪组织㊂3种脂肪组织来源不同,功能也各不相同㊂白色脂肪组织内含有较多的甘油三酯,可以储存机体多余的能量㊂由于白色脂肪细胞中线粒体含量较低,所以其虽储存能量能力较强,但脂肪消耗能量的能力较差[4-5]㊂因此,脂肪干细胞的形成及代谢过程的直接或间接调控因子已成为研究热点㊂多种m i R N A可直接或间接参与脂肪细胞分化的转录与翻译过程,且其可通过与下游靶基因结合的方式参与调控脂肪干细胞的分化及发育[6]㊂研究表明,内源性m i R-140-5p在小鼠骨髓基质细胞(S T2)分化过程中表达较高,m i R-140-5p可靶向转化生长因子β受体Ⅰ(T G F B R1)调节脂肪细胞分化[7],m i R-140-5p能够靶向且正调控长链非编码R N A核副斑点装配转录物1(L n o R N A N E A T1)促进脂肪衍生干细胞(A D S C s)成脂分化[8]㊂此外,研究表明,C C A A T增强子结合蛋白家族(C/E B P s)与m i R-140-5p的近端启动子结合正调控m i R-140-5p 的表达[7],表明m i R-140-5p与C/E B P s可能是正反馈模式,m i R-140-5p可能在脂肪分化过程中发挥着重要的作用㊂通过查找m i R B a s e等网站发现了可能靶向m i R-140-5p的基因,一部分已经被验证参与脂肪干细胞的分化过程,其中P300/C B P相关因子(P C A F)又名K A T2B,是组蛋白乙酰转移酶,具有乙酰转移活性,能通过乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因的转录调控[9]㊂P300/C B P与细胞周期调控㊁细胞凋亡和癌症的发生有着直接的关系[10]㊂研究表明,P C A F基因在3T3-L1细胞成脂分化过程中具有重要作用[11],同时关于P C A F基因在成脂分化方面相关文献较少,P C A F基因影响成脂分化的具体机制还不清晰㊂过氧化物酶体增殖物激活受体(P P A R)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员㊂P P A R可分为α㊁β(或δ)和γ3种类型,其中P P A Rγ主要表达于脂肪组织及免疫系统,与脂肪细胞分化㊁机体免疫及胰岛素抵抗关系密切,是一种可由多种脂肪酸及其衍生物激活的核转录因子[12]㊂P P A Rγ参与脂肪细胞分化,并与肥胖密切相关,是公认的脂肪分化的标志因子[13]㊂C/E B P s家族是碱性亮氨酸拉链蛋白家族的一个亚家族,具有多种功能,在细胞增殖㊁分化㊁信号传导㊁肿瘤发生及机体的免疫㊁应激反应㊁能量代谢㊁血液生成等方面发挥着重要的作用[14-15]㊂目前发现的C/E B P s家族有C/E B Pα㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pγ㊁C/E B Pδ㊁C/E B Pε㊁C/E B Pζ6类,且C/E B P s家族是第一个被证明在脂肪细胞分化过程中起重要作用的家族[16]㊂研究表明,在前脂肪细胞3T3-L1分化过程中C/E B Pβ的表达在脂肪分化初期瞬时增强,而后C/E B Pα与P P A Rγ转3362中国畜牧兽医49卷录激活[17]㊂基于P P A R s与C/E B P s家族互相影响且在细胞成脂分化中起到重要的作用,本试验选择C/E B Pβ㊁C/E B Pδ与P P A Rγ作为3T3-L1细胞成脂分化机制的下游基因进行深入研究,探索m i R-140-5p对3T3-L1细胞成脂分化的调控作用㊂1材料与方法1.1材料高糖D M E M购自上海帝博思生物科技有限公司;胎牛血清(F B S)购自S c i e n c e l l公司;P r o m e g a D u a l-L u c i f e r a s e R e p o r t e rA s s a y S y s t e m E1910购自A b c a m公司;L i p o f e c t a m i n e 2000转染试剂㊁质粒中提试剂盒均购自T h e r m o公司;P G L O载体㊁P G L O-P C A F3'-U T R载体㊁P E G F P-N1载体㊁P E G F P-N1-P C A F载体均购自武汉淼灵生物科技有限公司;R N A i s oP l u s,P r i m e S c r i p t T M R TR e a g e n t K i t㊁S Y B R P r i m i xE x T a qⅡ均购自T a K a R a公司;B C A蛋白浓度检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司;P r i m e S c r i p t T M R T R e a g e n tK i tw i t h g D N A E r a s e r㊁A d i p o g e n e s i s A s s a y试剂盒均购自A b c a m公司;P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ抗体购自P r o t e i n t e c hG r o u p公司;限制性内切酶X h oⅠ㊁K p nⅠ㊁N h eⅠ均购自N E B公司;大肠杆菌D H5α感受态细胞购自深圳康体生命科技有限公司㊂1.2分子材料的设计及合成1.2.1 m i R-140-5p模拟物㊁抑制物的合成根据m i R B a s e网站m i R-140-5p全序列(登录号: K T921569.1),由吉玛基因公司设计并合成m i R-140-5p 的模拟物㊁抑制物及对照序列(m i R-140-5p m i m i c s㊁i n h i b i t o r㊁N C)(表1)㊂表1模拟物㊁抑制物及s i R N A信息T a b l e1m i m i c s,i n h i b i t o r a n d s i R N Ai n f o r m a t i o n名称N a m e序列S e q u e n c e s(5'ң3') m i R-140-5p m i m i c s S:C A G U G G U U U U A C C C U A U G G U A GA:A C C A U A G G G U A A A A C C A C U G U U m i R-140-5p i n h i b i t o r S:C U A C C A U A G G G U A A A A C C A C U G s i R N A1S:G C A G A G G A G U C C U G U A A A U T TA:A U U U A C A G G A C U C C U C U G C T T s i R N A2S:G U G U A C U U C U A C C U A U U C A T TA:U G A A U A G G U A G A A G U A C A C T T s i R N A3S:G G U U G U G C U A C U G C A A U G U T TA:A C A U U G C A G U A G C A C A A C C T T N C S:U U C U C C G A A C G U G U C A C G U T TA:A C G U G A C A C G U U C G G A G A A T T1.2.2 s i R N A设计及合成根据G e n B a n k中P C A F基因完整C D S区序列(登录号:NM_ 001190846.1),由吉玛基因公司设计并合成P C A F 基因的3条s i R N A(s i R N A1㊁s i R N A2㊁s i R N A3) (表1)㊂1.2.3载体构建根据G e n B a n k中P C A F基因完整C D S区序列(登录号:N M_001190846.1),采用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计P C A F过表达引物,以3T3-L1细胞c D N A为模板进行P C R扩增㊂P C R反应体系50μL:c D N A5μL,2ˑT a q M a s t e r M i x 25μL,上㊁下游引物各1.5μL,d d H2O17μL㊂P C R 扩增程序:95ħ预变性3m i n;95ħ变性30s,60ħ退火30s,72ħ延伸15s,共35个循环;72ħ终延伸5m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后胶回收,与P E G F P-N1空载体同时使用限制性内切酶X h oⅠ㊁K p nⅠ双酶切,将二者双酶切产物连接,连接产物转入大肠杆菌D H5α感受态细胞中,对转化后的大肠杆菌进行摇菌㊁涂板㊁挑单克隆菌㊁摇菌,将得到的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序成功后对菌液进行质粒提取,重组质粒命名为P E G F P-N1-P C A F㊂根据m i R D B网站得到P C A F基因的3'-U T R序列,采用P r i m e r P r e m i e r5.0软件设计P C A F3'-U T R引物(表2),其中包含m i R-140-5p与P C A F基因预测结合位点,使用上述方法构建P G L O-P C A F3'-U T R 载体㊂43627期原佳慧等:m i R-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究1.2.4引物设计及合成根据m i R B a s e㊁G e n B a n k 中m i R-140-5p㊁P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因序列,利用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计实时荧光定量P C R引物,引物信息见表2㊂引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂表2引物信息T a b l e2P r i m e r i n f o r m a t i o n引物P r i m e r s序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物长度P r o d u c ts i z e/b p退火温度A n n e a l i n gt e m p r e t u r e/ħG e n e B a n k登录号G e n e B a n ka c c e s s i o nN o.m i R-140-5p F:G A G T G T C A G T G G T T T T A C C C T2260K T921569.1 R:G C A G G G T C C G A G G T A T T CU6F:C G C T T C G G C A G C A C A T A T A C8760N C_030814.1 R:T T C A C G A A T T T G C G T G T C A TP P A RγF:G G G C C A A G G A T T C A T G A C C A28860NM_001308354.1 R:A T C T T C T G G A G C A C C T T G G CC/E B PβF:G A A G A C G G T G G A C A A G C T G A16560NM_001287739.1 R:T G C T C C A C C T T C T T C T G C A GC/E B PδF:C A T C G A C T T C A G C G C C T A C A10360NM_007679.4 R:C G C T T T G T G G T T G C T G T T G AP C A F F:A C A G C A C C C T C A A G A A C A T C14360NM_001190846.1R:G C G T T C A C T C A T G G T T T T C A G P C A F3'-U T R F:T A G T T G T T T A A A C G A G C T C G G C G-G C T G C T A T G A C T C C T A A G 20060NM_001190846.1R:C A G G T C G A C T C T A G A C T C G A G C T-A A C A C C T T T G T G G C C T G1.3m i R-140-5p对3T3-L1细胞成脂分化的影响1.3.13T3-L1细胞转染及分化3T3-L1细胞解冻后用含10%胎牛血清的D M E M高糖培养基培养,按照2ˑ105/m L接种到6孔板中,待汇合度达到70%左右时进行细胞转染㊂用250μL D M E M 培养基(不含血清和双抗)分别稀释m i R-140-5p m i m i c s(m i m i c s)㊁N C和L i p o f e c t a m i n e 2000转染试剂,室温静置5m i n,将N C与m i R-140-5p m i m i c s 分别与转染试剂混匀后静置20m i n;静置期间,将6孔板里的旧培养基弃掉,用P B S清洗细胞2次,加入800μL新鲜D M E M培养基(不含血清和双抗);静置结束后将500μL转染混合液均匀滴加到培养板中,轻轻晃动培养板使溶液混合均匀;培养箱中静置6h,更换为含10%胎牛血清的D M E M培养基(不含双抗)继续培养㊂待细胞汇合度达70%时进行诱导分化,将完全培养基换为诱导培养基(将胰岛素㊁I B MX㊁地塞米松试剂按照说明书1000倍稀释, 1m L完全培养基加入1μL各试剂配制诱导培养基),诱导3d后换为分化培养基(将胰岛素试剂按照说明书1000倍稀释,1m L完全培养基加入1μL 配制分化培养基)继续培养,2d换1次分化液㊂1.3.2油红O染色鉴定在诱导分化第7天进行油红O染色㊂将3T3-L1细胞每孔加入100μL 稀释的脂滴分析固定剂,并孵育15m i n;用100μL 洗涤液洗2次,每次5m i n;干燥培养板;将75μL油红O工作液添加到所有孔中,包括不含细胞的空白孔,并孵育20m i n;移除所有油红O溶液,用蒸馏水清洗细胞数次,至蒸馏水清澈;用100μL洗涤液洗2次,每次5m i n㊂显微镜下观察并拍照㊂1.3.3实时荧光定量P C R检测基因的表达在诱导分化的第―1(分化前1d)㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天收集3T3-L1细胞,用于实时荧光定量P C R检测m i R-140-5p m R N A相对表达量;在诱导分化第7天收集细胞进行C/E B Pβ㊁C/E B Pδ和P P A Rγm R N A相对表达量检测㊂用T R I z o l提取诱导分化第―1㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天的3T3-L1细胞㊁转染m i R-140-5p m i m i c s和N C组诱导分化7d的3T3-L1细胞总R N A并反转录合成c D N A㊂P C R反应体系10μL: 2ˑT a q M a s t e rM i x5μL,上㊁下游引物各0.4μL, c D N A200n g,d d H2O补足10μL㊂P C R反应程序:5362中国畜牧兽医49卷95ħ预变性30s;95ħ变性10s,60ħ退火30s, 72ħ延伸15s,共40个循环;72ħ延伸5m i n㊂1.4m i R-140-5p靶基因筛选及靶基因序列保守性分析采用m i R a n d n(h t t p:ʊm i r d b.o r g/)和T a r g e t S c a n(h t t p:ʊw w w.t a r g e t s c a n.o r g/v e r t_ 70/)2个m i R N A数据库预测m i R-140-5p的靶基因,在数据库中挑选与脂肪分化相关的靶基因作为潜在靶基因㊂通过在m i R B a s e(h t t p s:ʊw w w. m i r b a s e.o r g/)数据库得到小鼠㊁人㊁黑猩猩㊁恒河猴㊁松鼠㊁大鼠㊁兔子㊁猪㊁牛㊁猫㊁犬㊁棕蝠㊁大象㊁负鼠㊁金刚鹦鹉和鸡的m i R-140-5p及其靶基因结合位点序列,通过比对各物种m i R N A序列,分析其结合位点序列的保守性㊂1.5m i R-140-5p对其预测靶基因表达的影响1.5.13T3-L1细胞培养㊁细胞转染及细胞分化将m i R-140-5p m i m i c s(m i m i c s)㊁m i R-140-5p i n h i b i t o r(i n h i b i t o r)与N C按照1.3.1方法转染到3T3-L1细胞中,细胞培养与诱导分化方式同1.3.1㊂1.5.2实时荧光定量P C R检测靶基因的表达在诱导的第2天收集1.5.1各组细胞进行实时荧光定量P C R㊂试验方法同1.3.3,检测m i m i c s㊁i n h i b i t o r与m i m i c sN C组的m i R-140-5p的靶基因m R N A相对表达水平㊂1.5.3 W e s t e r n b l o t t i n g检测蛋白的表达在诱导的第2天收集1.5.1各组细胞进行W e s t e r nb l o t t i n g 检测㊂用蛋白裂解液收集m i m i c s㊁i n h i b i t o r与m i m i c s N C组的细胞后,冰上裂解40m i n,13000r/m i n离心15m i n,吸取上清液,检测蛋白浓度后进行S D S-P A G E凝胶电泳,经过转膜㊁室温封闭1h㊁孵育一抗(4ħ孵育过夜)㊁洗膜㊁孵育二抗(37ħ孵育1h)㊁洗膜后,涂抹发光液后在凝胶成像系统中曝光㊂检测m i R-140-5p靶基因的蛋白表达水平㊂1.6过表达或敲低P C A F对3T3-L1细胞成脂分化的影响1.6.13T3-L1细胞培养㊁细胞转染及细胞分化将P E G F P-N1-P C A F载体㊁P E G F P-N1载体㊁N C㊁P C A F s i R N A1㊁P C A F s i R N A2和P C A F s i R N A3㊁P C A F N C与P C A Fs i R N A3按照1.3.1的方法转染到3T3-L1细胞,细胞培养与诱导分化方式同1.3.1㊂在诱导第2天时收集各组细胞进行实时荧光定量P C R和W e s t e r nb l o t t i n g检测,在诱导分化第7天进行油红O染色鉴定㊂1.6.2油红O染色试验方法同1.3.2,观察P E G F P-N1-P C A F与P E G F P-N1组及P C A Fs i R N A 与N C组细胞中脂滴的染色情况㊂1.6.3实时荧光定量P C R检测基因的表达试验方法同1.3.3,检测P E G F P-N1-P C A F㊁P E G F P-N1组细胞P C A F㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因的相对表达水平;检测P C A Fs i R N A㊁N C组P C A F㊁C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ基因的相对表达水平㊂1.6.4 W e s t e r nb l o t t i n g检测蛋白的表达试验方法同1.5.3,检测P E G F P-N1-P C A F㊁P E G F P-N1组细胞C/E B Pβ㊁C/E B Pδ㊁P P A Rγ与G A P D H蛋白表达水平;检测P C A Fs i R N A1㊁P C A Fs i R N A2㊁P C A Fs i R N A3和N C组细胞中P C A F蛋白表达水平;检测P C A F s i R N A组与N C组C/E B Pβ㊁P P A Rγ与G A P D H蛋白表达水平㊂1.7m i R-140-5p与P C A F靶向关系验证将293T细胞分为m i m i c s+P C A F3'-U T R㊁N C+ P C A F3'-U T R㊁m i m i c s+P G L O空载(m i m i c s+ v e h i c l e)和空白+P C A F3'-U T R(B l a n k+3'-U T R P C A F)4组,待293T细胞汇合度达到70%~80%进行转染,用125μLD M E M培养基(不含血清和双抗)分别稀释P C A F3'-U T R质粒㊁m i m i c s,用250μL D M E M培养基稀释L i p o2000转染试剂(6μL/孔),室温静置5m i n,将质粒和m i m i c s与转染试剂分别混匀再静置20m i n,按照1.3.1的方法进行转染,培养72h后收集细胞,用于双荧光素酶报告试验检测㊂试验前需按照P r o m e g a D u a l-L u c i f e r a s e R e p o r t e rA s s a y S y s t e mE1910试剂盒说明书制备裂解液1ˑP L B㊁L A RⅡ㊁S t o p&G l o试剂㊁1ˑS t o p&G l oR a e g e n t㊂除去培养基,用P B S清洗细胞后,将1ˑP L B加入到培养孔中㊂在室温轻缓晃动培养板15m i n,将裂解液转移到检测板中,加入20μL P L B裂解液/孔,加入100μLL A RⅡ,检测样本荧火虫荧光素酶活性;加入100μLS t o p&G l o试剂,检测样本海肾荧光素酶活性㊂1.8数据统计分析用2-әәC t法计算各基因相对表达量,采用I m a g e J1.48软件计算蛋白灰度值,用G r a p h P a d P r i s m8.0软件绘图,用S P S S26.0软件进行单因素方差分析,组间差异采用t检验,结果用平均值ʃ标准差表示㊂P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著㊂2结果2.1m i R-140-5p对3T3-L1细胞成脂分化的影响在3T3-L1细胞分化过程中,m i R-140-5p的表63627期原佳慧等:m i R -140-5p 对前脂肪细胞3T 3-L 1成脂分化的机制研究达量有明显变化趋势㊂与诱导分化前1d (-1d)相比,在细胞汇合至100%时m i R -140-5p 表达水平极显著上升(P <0.01),在添加诱导培养基第1天时,m i R -140-5p 表达水平极显著上升(P <0.01),而后在分化过程中下降,分化至第3天m i R -140-5p 表达水平显著上升(P <0.05),分化至第5天后m i R -140-5p表达水平已降低到未分化之前的水平(图1A )㊂油红O 染色发现,m i m i c s 组脂滴明显多于N C 组(图1B )㊂与N C 组相比,m i m i c s 组成脂标志性基因C /E B P δ㊁P P A R γ转录水平极显著升高(P <0.01),C /E B P β基因的转录水平有升高趋势,但差异不显著(P >0.05)(图1C ~1E )㊂①A ,3T 3-L 1细胞分化第-1㊁0㊁1㊁2㊁3㊁5㊁7天m i R -140-5p 表达水平;B ,m i R -140-5p NC 组与m i m i c s 组油红O 染色结果(40ˑ);C ~E ,C /E B P β㊁C /E B P δ㊁P P A R γm R N A 相对表达量㊂②与―1d 相比,#,差异显著(P <0.05);##,差异极显著(P <0.01);无#,差异不显著(P >0.05)㊂③与N C /P E G F P -N 1组相比,*,差异显著(P <0.05);**,差异极显著(P <0.01);无*,差异不显著(P >0.05)㊂下同①A ,T h e e x p r e s s i o n l e v e l o fm i R -140-5p o n -1,0,1,2,3,5a n d7d a y so f 3T 3-L 1c e l l d i f f e r e n t i a t i o n ;B ,O i l r e dOs t a i n i n gr e s u l t s o fm i R -140-5p N C g r o u p a n dm i m i c s g r o u p (40ˑ);C ~E ,T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f C /E B P β,C /E B P δa n d P P A R γg e n e s ,r e l a t i v e l y .②C o m p a r e dw i t h ―1d ,#,S i g n i f i c a n td i f f e r e n c e (P <0.05);##,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e (P <0.01);N o#,N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05).③C o m p a r e dw i t hN C /P E G F P -N 1g r o u p ,*,S i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);**,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01);N o *,N o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05).T h e s a m e a sb e l o w 图1 过表达m i R -140-5p 对3T 3-L 1细胞成脂分化的影响F i g .1 T h e e f f e c t s o f o v e r e x p r e s s i o no fm i R -140-5p on3T 3-L 1c e l l s d i f f e r e n t i a t i o n 2.2 m i R -140-5p 靶基因预测及PC A F 序列保守性分析利用T a r g e t S c a n 网站预测发现,m i R -140-5p与P C A F3'-U T R 区含有预测结合位点,在674-681b p 处(图2A )㊂预测结合位点在小鼠㊁人㊁黑猩猩㊁恒河猴㊁松鼠㊁大鼠㊁兔子㊁猪㊁牛㊁猫㊁犬㊁棕蝠㊁大象㊁负鼠㊁金刚鹦鹉和鸡物种间的保守性比对发现,在不同物种间此结合位点保守性较高(图2B )㊂7362中 国 畜 牧 兽 医49卷A ,m i R -140-5p 和P C A F3'-U T R 区的预测结合位点;B ,PC A F3'-U T R 区序列保守性分析A ,P r e d i c t e db i n d i n g s i t e o fm i R -140-5p a n dP C A F3'-U T Rr e g i o n ;B ,C o n s e r v a t i v e a n a l y s i s o f P C A F3'-U T Rr e g i o n s e qu e n c e 图2 m i R -140-5p 靶基因预测及PC A F3'-U T R 区序列保守性分析F i g .2 P r e d i c t i o no fm i R -140-5p t a r g e t g e n e a n d c o n s e r v a t i o na n a l y s i s o fP C A F3'-U T Rr e g i o n s e qu e n c e 2.3 m i R -140-5p 对PC A F 表达的影响 由图3可知,与N C 组相比,m i m i c s 组m i R -140-5p㊁P C A F 的表达量均极显著增加(P <0.01),i n h i b i t o r 组m i R -140-5p 的表达量极显著降低(P <0.01)㊁P C A F 的表达量显著降低(P <0.05)㊂由图4可知,与N C 组相比,m i m i c s 组P C A F 蛋白的表达量显著增加(P <0.05),i n h i b i t o r 组P C A F 蛋白的表达量无显著变化(P >0.05)㊂图3 各组m i R -140-5p(A )与P C A F (B )基因的相对表达量F i g .3 T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n s o fm i R -140-5p (A )a n d P C A F (B )g e n e i n e a c h g r o u p83627期原佳慧等:m i R -140-5p 对前脂肪细胞3T 3-L 1成脂分化的机制研究图4 各组P C A F 蛋白表达量F i g .4 T h e e x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n i n e a c h g r o u p2.4 过表达P C A F 对3T 3-L 1细胞成脂分化的影响由图5可知,与P E G F P -N 1组相比,P E G F P -N 1-P C A F 组细胞脂滴明显增加㊂由图6可知,与P E G F P -N 1组相比,P C A F ㊁P P A R γ基因相对表达量均极显著增加(P <0.01),C /E B P δ基因相对表达量有上升趋势,但差异不显著(P >0.05)㊂由图7可知,与P E G F P -N 1组相比,P E G F P -N 1-P C A F 组C /E B P β㊁C /E B P δ蛋白表达水平极显著上升(P <0.01),P P A R γ蛋白表达水平显著上升(P <0.05)㊂图5 油红O 染色结果(40ˑ)F i g .5 O i lOs t a i n i n g re s u l t s (40ˑ)图6 各组P C A F (A )㊁C /E B P δ(B )和P P A R γ(C )基因相对表达量F i g .6 R e l a t i v e e x p r e s s i o no f P C A F (A ),C /E B P δ(B )a n d P P A R γ(C )g e n e s i n e a c h g r o u p9362中 国 畜 牧 兽 医49卷A ,C /EB P β㊁C /E B P δ和P P A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 条带;B ~D ,C /E B P β㊁C /E B P δ和P P A R γ蛋白灰度值A ,W e s t e r n b l o t t i n g b a n d o fC /E B P β,C /E B P δa n d P P A R γp r o t e i n s ;B -D ,G r a y v a l u e so f C /E B P β,C /E B P δa n d P P A R γp r o t e i n s ,r e s p e c t i v e l y图7 各组C /E B P β㊁C /E B P δ和P P A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 结果F i g .7 W e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s o fC /E B P β,C /E B P δa n dP P A R γp r o t e i n s i n e a c h g r o u p 2.5 敲低P C A F 基因对3T 3-L 1细胞成脂分化的影响由图8可知,与N C 组相比,3条s i R N A 均极显著抑制P C A F 蛋白的表达水平(P <0.01),由于s i R N A 3组P C A F 蛋白水平降低最显著,所以选用s i R N A 3进行后续P C A F 敲低试验㊂由图9可知,s i R N A 3组脂滴明显少于N C 照组㊂与N C 组相比,s i R N A 3组C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ基因相对表达量均极显著下降(P <0.01)(图10);与N C 组相比,s i R N A 3组C /E B P β蛋白表达水平极显著降低(P <0.01),P P A R γ蛋白表达水平无显著变化(P >0.05)(图11)㊂A ㊁B ,在3T 3-L 1细胞中分别转染3条P C A Fs i R N A 后P C A F 蛋白的表达水平Aa n dB ,T h e e x p r e s s i o no fP C A F p r o t e i n i n3T 3-L 1c e l l s a f t e r t h r e eP C A Fs i R N A s t r a n s f e c t i o n r e s p e c t i v e l y 图8 s i R N A 敲低效果对比F i g .8 C o m p a r i s o no f s i R N Ak n o w i n g do w n e f f e c t s 04627期原佳慧等:m i R -140-5p 对前脂肪细胞3T 3-L 1成脂分化的机制研究图9 油红O 染色结果(40ˑ)F i g .9 O i lOs t a i n i n g re s u l t s (40ˑ)图10 各组P C A F (A )㊁C /E B P β(B )㊁C /E B P δ(C )和P P A R γ(D )基因相对表达量F i g .10 R e l a t i v e e x p r e s s i o no f P C A F (A ),C /E B P β(B ),C /E B P δ(C )a n d P P A R γ(D )g e n e s 2.5 m i R -140-5p 与PC A F 基因靶向关系验证双荧光素酶报告试验结果显示,与B l a n k+P C A F3'-U T R ㊁m i m i c s +v e h i c l e 和N C+P C A F3'-U T R 相比较,m i m i c s +P C A F3'-U T R 组中双荧光素酶活性均无显著差异(P >0.05)(图12),说明m i R -140-5p 与PC A F 基因无靶标关系㊂1462中 国 畜 牧 兽 医49卷A ,C /EB P β和P P A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 条带;B ㊁C ,C /E B P β和P P A R γ蛋白灰度值A ,W e s t e r nb l o t t i n g b a n do fC /E B P βa n dP P A R γp r o t e i n ;Ba n dC ,G r a y v a l u e s o fC /E B P βa n dP P A R γp r o t e i n 图11 各组C /E B P β和PP A R γ蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 结果F i g .11 W e s t e r nb l o t t i n g r e s u l t s o fC /E B P βan dP P A R γp r o t e i n s i n e a c h g r o up 图12 各组双荧光素酶相对活性F i g .12 R e l a t i v e a c t i v i t y o f d u a l l u c i f e r a s e i n e a c h g r o u p3 讨 论脂肪代谢及分化与动物的生长发育息息相关,m i R N A 在脂肪分化过程中的作用与功能具有重要意义㊂研究表明,在S T 2细胞成脂分化过程中,在细胞汇合至100%的第2天添加诱导分化液,m i R -140-5p 的表达水平在诱导分化前1d 升高,在诱导分化后第1天达到最高值[7]㊂本研究在细胞汇合至100%当天添加诱导分化液,结果显示,3T 3-L 1细胞在诱导分化当天m i R -140-5p 表达水平极显著升高,在诱导后第1天m i R -140-5p 表达量达到峰值,与S T 2细胞的研究结果基本一致㊂其原因可能在于:当细胞汇合100%时,3T 3-L 1细胞达到了细胞接触抑制时期,这时期为前体脂肪细胞分化第一阶段(克隆增殖阶段),且细胞在接触抑制后很快进入第二阶段(终末分化阶段),为了避免错过分化第一阶段,所以本研究中诱导分化时间选择在这一时期㊂但本试验结果显示,在诱导分化后第1天m i R -140-5p 水平达到峰值,与上述文献一致,这个峰值可能代表着细胞进入了分化的第二阶段,而造成细胞分化第一阶段到第二阶段的原因可能是添加诱导分化试剂引起的㊂m i R -140-5p 在细胞分化第一阶段与第二阶段均显著增高,这说明m i R -140-5p 在3T 3-L 1细胞分化过程中扮演重要角色㊂本研究通过过表达m i R -140-5p ,发现m i R -140-5p 能够促进3T 3-L 1细胞的成脂分化,并且上调成脂分化相关基因P P A R γ㊁C /E B P β和C/E B P δ的表达㊂为了探究m i R -140-5p 的成脂调控作用,利用T a r ge t S c a n 与m i R B a s e 等靶基因预测网站预测m i R -140-5p 的下游靶基因,从中选择与脂肪分化相关的P C A F 基因作为研究对象㊂有研究表明,P C A F 基因在3T 3-L 1细胞分化中发挥重要作用[11]㊂本研究结果证明,与N C 组相比,m i R -140-5p mi m i c s 组P C A F 基因的表达量上调,m i R -140-5pi n h i b i t o r 组P C A F 基因表达量下降,说明m i R -140-5p 可影响P C A F 基因的表达㊂与转染空载体对照组相比,P C A F 基因高表达后脂滴明显增多,且C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ的转录与蛋白表达水平均上升;相反,敲低P C A F 抑制3T 3-L 1细胞分化为脂滴,且C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ的转录与蛋白表达水平均不同程度地下降,说明P C A F 是通过正调控C /E B P β㊁C /E B P δ与P P A R γ基因促进3T 3-L 1细胞成脂分化的㊂尽管组蛋白乙酰化对脂肪细胞分化调控的研究较少,但目前的文章显示组蛋白乙酰化修饰水平与成脂分化水平呈正相关[18]㊂J i n 等[19]研究发现,P C A F 通过调节P P A R γ的表达来促进脂肪的发生,并通过影响P r d m 16的2462。

3T3诱导分化1.实验用液的配置（1）地塞米松储备液配制取3.29mg地塞米松粉末于1.5ml PE管中，加无水乙醇1ml，涡旋至完全溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

储备液最终浓度为10mM/mL，于-20℃避光保存。

（2）胰岛素储备液的配置取10mg胰岛素粉末于2ml EP管中，加双蒸水500μl，涡旋，再加0.02Mm HCL(100-200μl),涡旋，最后加双蒸水至1ml，0.22μl微孔滤膜过滤除菌。

储备液最终浓度为5mg/ml，4℃避光短期保存（1周），-20℃避光长期保存（1个月）。

（3）IBMX储备液配制取11.5mg胰岛素粉末于2ml EP管中，加双蒸水500μl，涡旋，再加1N NaOH(100-200μl),涡旋，最后加双蒸水至1ml，0.22μl微孔滤膜过滤除菌。

储备液最终浓度为51.8mM/ml，最好现用现配。

（4）诱导分化液A诱导液一加以下试剂至10ml 含10%FBS的DMEM培养液中，混匀，现用现配。

B诱导剂二加20μl胰岛素贮备液（5mg/ml）于10ml含10%FBS的DEME培养液中，配制成含胰岛素1 0μg/ml的溶液。

2.实验流程2.1诱导分化1)d1-d2天：待细胞长至100%时加诱导剂一，培养52-58h2)d3-d4天：换成诱导液二，培养2天3)d5-d6天：更换诱导液二，培养2天4)d7天：换成含10%FBS的培养液5)d8天：细胞固定染色2.2.固定和染色:1)细胞固定：取出培养皿，弃培养液，加PBS 3ml润洗两遍,再加10%甲醛固定30min，弃固定液，晾干。

2)细胞染色A油红配置：将0.6g油红溶于200ml异丙醇中，过滤，配制成油红贮备液，染色前取一定量油红贮备液加双蒸水以3：2的比例混匀，过滤，静置10minB油红染色：取配制好的油红上清液2ml于培养皿中，染色30min。

弃油红染液，双蒸水洗三遍，至倒置显微镜下观察分化结果。

3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。

Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。

加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。

诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。

使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。

诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。

Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。

Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。

这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。

Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。

细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。

固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。

Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。

取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。

Step8: 获得结果并进行后期处理。

Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexamethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The media will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。

3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。

100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。

保存温度我记不清了，你自己查一下。

Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。

最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。

一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。

未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。

许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。

提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。

3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。

Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。

加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。

诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。

使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。

诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。

Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。

Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。

Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。

这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。

Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。

细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。

固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。

Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。

取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。

Step8: 获得结果并进行后期处理。

Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexam ethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (becom e more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The m edia will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。

3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5 mmol/L IBMX（储存液浓度0.5 mmol/L）、终浓度为1 umol/L(储存液浓度为1 mg/ml (2.5 mmol/L)) DEX和终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48 h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）加入aspirin(5 mM)，salsalate(1、5 mM)3)48 h后换含终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天，3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

油红O染色1）先小心轻缓倒去培养夜。

2）用pbs轻缓漂洗。

3）加10%多聚甲醛固定30 min。

4）用60％异丙醇洗涤5）油红O母液现用现配：称取0.5g油红O粉末，以异丙醇溶解并定容至100 ml，4℃避光贮存。

稀释油红O母液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10 min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。

6）油红O染色10 min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1. 5 ml，24孔加0.5-1 ml（实际染色时间1小时都可以）。

7）脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。

8）甘油明胶封片。

9）显微镜观察拍照。

3t3-l1细胞诱导分化原理
3T3-L1细胞是一种常用的成纤维细胞株，可通过特定的诱导条件转分化为脂肪细胞。

其诱导分化的原理是通过连续培养和控制细胞外
环境，使细胞经历特定的分化过程。

首先，3T3-L1细胞会被培养在含有高营养的培养基中，其中含有高浓度的葡萄糖和羊血清。

这一步骤有助于细胞增殖和发育。

接下来，在细胞生长至达到密度的时候，减少培养基中营养物的浓度，同时添
加较低浓度的羊血清。

这种改变细胞外环境的操作有助于减少细胞增殖，促进细胞向分化方向发展。

然后，在细胞进入密集生长阶段之后，可以应用一种称为诱导剂
的物质来促使细胞向脂肪细胞分化。

常用的诱导剂有一种混合物，包
括二甲苯和异丙基甲基酰胺(DMI)。

这种物质可以诱导细胞内的转录因
子PPARγ和C/EBPα的表达，这两个转录因子在脂肪细胞分化中起到
关键作用。

最后，在细胞处于诱导剂作用下，可以观察到细胞的形态和特征
从成纤维样逐渐转变为脂肪细胞特征。

这包括细胞膜的变化、细胞内
脂滴的积聚以及与脂肪细胞相关的基因表达的增加。

综上所述，3T3-L1细胞的诱导分化原理主要包括通过调节细胞外环境和应用特定的诱导剂，促使细胞向脂肪细胞方向分化，并最终表
现出脂肪细胞特征。