环氧化酶22中的作用
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Role of P38 m itogen2activa ted prote in k ina se in expressing of cyclooxygena se22 in human um b ilica l ve in endothelia l cells
L I Yan2bo1 , L IW ei2m in2 , HAN Jun2yong 3 ( 1. D epa rtm en t of Endocrinology, 2. D epa rtm en t of Ca rd iology, the F irst A ffilia ted Hospita l of Haerbin M ed ica l U n iversity, Haerbin 150001, Heilong jiang, Ch ina; 3. D epa rtm en t of Ca rd iology, the F ifth A ffil2 ia ted Hospita l of Z hongshan M ed ica l U n iversity, Z huha i 519000, Guangdong, Ch ina)
0. 1%十二烷基硫酸钠 ( SDS) , 1%非离子去活剂 (Nonidet P240, NP240 ) , 0. 5% 去 氧 胆 酸 钠 , 0. 1 mmol/L 钒 酸 钠 , 1 mmol/L 氟 化 钠 , 400 μmol/L PM SF和 40 ng /L亮抑制素 (Leupep tin) ] 裂解 ,提取 物在冰上孵育 30 m in,然后以 4℃、12 000 g离心 20 m in;上清液中的蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量 。磷 酸化 P38MAPK和 COX22 表达量采用 W estern2blot 法检测 ,上清液加入等 体积 2 ×上 样缓 冲液 ( 114 mmol/L Tris, pH 6. 8, 9%甘油 , 2. 7% SDS, 0. 02% 溴芬蓝 , 4. 5%巯 基乙 醇 ) 煮 沸 5 m in。进行 10% SDS2PAGE,将蛋白转至 PVDF膜后 ,用 5% B SA [以 TB ST (10 mmol/L Tris, pH 8. 0, 150 mmol/L NaC l 和 0. 05% 吐 温 ) 稀 释 ]室 温 下 封 闭 2 h, 分 别 用 1 ∶2 000抗磷酸化 P38MAPK和 1 ∶200 COX22 兔多 克隆抗体 4℃孵育过夜 ,用 TBST充分洗涤 ,再用碱 性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG (1 ∶5 000) , 37℃孵育 1 h后再用 TBST充分洗涤 ,化学发光试剂显色 。结果 经北航 CM - 2000B 生物医学图像分析系统对目的 条带进行扫描和密度分析 。 1. 3 统 计 学 方 法 所 有 数 据 用 均 数 ±标 准 差 ( x ±s)表示 ,以 SPSS统计分析软件包的方差分析 (ANOVA )进行多组间均数比较 ,两两组间比较用 t 检验 。以 P≤0. 05为差异有显著性意义 。
第 6期 李艳波 ,等 P38信号通路在人脐静脉内皮细胞表达环氧化酶 22中的作用
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0 引 言
P38信号通路 (m itogen2activated p rotein kinase, P38MAPK)是丝裂素活化蛋白激酶 (m itogen2activated p rotein kinase,MAPK)家族的一个成员 ,通过对细胞 内信号的传递 ,参与细胞对许多外界刺激的调节反 应 [1 ] 。研 究 表 明 , 环 氧 化 酶 22 ( cyclooxygenase22, COX22)在动脉粥样硬化的发生中起重要作用 [ 2, 3 ] 。 我们在体外模拟糖尿病状态 ,探讨糖尿病时存 在的各种 应 激 反 应 , 如 高 葡 萄 糖 、糖 基 化 终 产 物 ( advanced glycosylation end p roducts, AGE) 生成增 多 、高胰岛素和过氧化氢对人脐静脉内皮细胞 ( hu2 man umbilical vein endothelial cells, HUVEC ) 中 P38MAPK、COX22 蛋白表达的影响及 P38MAPK在 表达 COX22中的作用 ,进一步揭示 P38MAPK在糖 尿病动脉粥样硬化中的作用 。
Abstract: O b jec tive: To investigate the ro le of P38 m itogen2activated p ro tein kinase ( P38MAPK) in exp ressing cyclooxygenase22 (COX22) in human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC) , in order to study the role of P38MAPK on diabetic atherosclerosis. M e thods: HUVEC are separately stimula2 ted w ith high glucose, advanced glycosylation end p roducts (AGE) , high insulin and H2 O2 , the ex2 p ression of phospho2P38MAPK and COX22 is detected; Sim ultaneously, HUVEC p re2treated w ith SB203580 ( P38MAPK special inhibitor) are stim ulated w ith above stim ulating factors, the exp ression of COX22 is detected. R esu lts: H igБайду номын сангаас glucose, AGE, high insulin and H2O2 can activate P38MAPK and increase the exp ression both of phospho2P38MAPK and COX22 significantly; B ut the exp ression of COX22 is inhibited by SB203580. C on c lu sion: P38MAPK regulates the exp ression of COX22; P38MAPK is a up stream signal molecule of COX22 and P38MAPK m ay be one of initial signals on ather2 osclerosis occurrence. Key words: P38 m itogen2activated p rotein kinase; Cyclooxygenase22; D iabetes; A therosclerosis
3 收稿日期 : 2004212221; 修订日期 : 2005201231 基金项目 : 中国博士后基金资助项目 (批准号 : 2004035537) ;黑龙江省博士后基金资助项目 (批准号 : LRB03143) 作者简介 : 李艳波 (19652) ,女 ,黑龙江哈尔滨人 ,教授 ,医学博士 ,从事内分泌专业 。
1 材料和方法
1. 1 材料 人脐静脉内皮细胞系 (HUVEC,中国科 学院上海细胞生物学研究所细胞库提供 ) ; 新生牛 血清及 RPM I21640 培养液 ( Hyclone 公司产品 ) ; 蛋 白质相对分子质量标记物 (B io2Rad 公司产品 ) ; 磷 酸化 P38MAPK兔多克隆抗体 ( Promega公司产品 ) ; COX22兔多克隆抗体 ( Santa Cruz公司产品 ) ; W est2 ern2blot检测试剂盒 ( Promega公司产品 ) ; P38MAPK 特异性抑制剂 SB203580 ( Prom ega公司产品 ) 。 1. 2 方法 1. 2. 1 HUVEC的培养 HUVEC培养于 10%灭活 新生牛血清的 RPM I21640 培养液中 , 培养条件 为 37℃、饱和湿度和 5% CO2 ,每 2～3天用 0. 02%乙二 胺四乙酸 ( EDTA )消化传代 。 1. 2. 2 体外制备 AGE 参照文献 [ 4 ] ,按牛血清清 蛋白 (BSA ) 50 g/L与葡萄糖 90 g /L ,在体外于 37℃孵 育 60天 ;制备结束后用考马斯亮蓝法测定 AGE蛋白 含量 ,并测定其荧光强度 ; - 20℃避光保存备用 。 1. 2. 3 实验分组 实验分为 9 组 : ①对照 ( CON ) 组 ,无刺激因素孵育 HUVEC; ②高糖 ( HG) 组 ,加 入葡萄糖 25 mmol/L 后 ,孵育 72 h; ③ AGE组 ,加入 AGE 100 mg /L 后 ,孵育 6 h; ④高胰岛素 (H I) 组 , 加入胰岛素 100 nmol/L 后 ,孵育 24 h; ⑤过氧化氢 ( H2 O2 ) 组 ,加入 H2O2 100μmol/L 后 ,孵育 1 h。 ⑥ SB 2HG组 ; ⑦ SB 2AGE 组 ; ⑧ SB 2H I组 ; ⑨ SB 2H2 O2 组 ; ⑥～⑨是在 ②～⑤的各组基础上先分别加入 5 μmol/L SB203580,培养 30 m in 后 ,再加入葡萄糖 、 AGE、胰岛素及 H2 O2 ,浓度和孵育时间与相应刺激 组一致 [ 5 ] 。 1. 2. 4 W estern2blot法检测 P38MAPK和 COX22 蛋 白表达 培养的 HUVEC,经 R IPA 细胞裂解液 [ ( 50 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 ( Tris·Cl) , pH 8. 0, 150 mmol/L 的 NaC l, 0. 02%叠氮钠 (NaN3 ) ,
(哈尔滨医科大学第一临床医学院 , 11内分泌科 ; 2. 心内科 ,黑龙江哈尔滨 150001; 3. 中山医科 大学附属五院心内科 ,广东珠海 519000)
摘要 : 目的 : 探讨 P38信号通路 ( P38MAPK)在人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)表达环氧化酶 22 ( COX22)的作用 , 从而研究 P38MAPK在糖尿病动脉粥样硬化中的作用 。 方法 :分别以高葡萄糖 、糖基化终产物 (AGE) 、高胰岛 素和过氧化 氢 刺 激 HUVEC; 检 测 P38MAPK 和 COX22 在 HUVEC 的 蛋 白 表 达 。以 P38MAPK 特 异 性 抑 制 剂 SB203580预处理 HUVEC后 ,再用上述四种因素刺激 HUVEC,检测 COX22在 HUVEC的蛋白表达 。 结果 :高葡 萄糖 、AGE、高胰岛素和过氧化氢均可独立激活 P38MAPK,使磷酸化 P38MAPK表达量增加 , COX22蛋白表达量也 增加 ; SB203580预处理后 , COX22表达被显著抑制 。 结论 : P38MAPK调控 COX22的表达 ,它是 COX22的上游信 号分子 ,可能是动脉粥样硬化发生的始动信号之一 。 关键词 : P38信号通路 ; 环氧化酶 22; 糖尿病 ; 动脉粥样硬化 中图分类号 : R587. 2 文献标识码 : A 文章编号 : 100828199 (2005) 06204902033
L I Yan2bo1 , L IW ei2m in2 , HAN Jun2yong 3 ( 1. D epa rtm en t of Endocrinology, 2. D epa rtm en t of Ca rd iology, the F irst A ffilia ted Hospita l of Haerbin M ed ica l U n iversity, Haerbin 150001, Heilong jiang, Ch ina; 3. D epa rtm en t of Ca rd iology, the F ifth A ffil2 ia ted Hospita l of Z hongshan M ed ica l U n iversity, Z huha i 519000, Guangdong, Ch ina)
0. 1%十二烷基硫酸钠 ( SDS) , 1%非离子去活剂 (Nonidet P240, NP240 ) , 0. 5% 去 氧 胆 酸 钠 , 0. 1 mmol/L 钒 酸 钠 , 1 mmol/L 氟 化 钠 , 400 μmol/L PM SF和 40 ng /L亮抑制素 (Leupep tin) ] 裂解 ,提取 物在冰上孵育 30 m in,然后以 4℃、12 000 g离心 20 m in;上清液中的蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量 。磷 酸化 P38MAPK和 COX22 表达量采用 W estern2blot 法检测 ,上清液加入等 体积 2 ×上 样缓 冲液 ( 114 mmol/L Tris, pH 6. 8, 9%甘油 , 2. 7% SDS, 0. 02% 溴芬蓝 , 4. 5%巯 基乙 醇 ) 煮 沸 5 m in。进行 10% SDS2PAGE,将蛋白转至 PVDF膜后 ,用 5% B SA [以 TB ST (10 mmol/L Tris, pH 8. 0, 150 mmol/L NaC l 和 0. 05% 吐 温 ) 稀 释 ]室 温 下 封 闭 2 h, 分 别 用 1 ∶2 000抗磷酸化 P38MAPK和 1 ∶200 COX22 兔多 克隆抗体 4℃孵育过夜 ,用 TBST充分洗涤 ,再用碱 性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG (1 ∶5 000) , 37℃孵育 1 h后再用 TBST充分洗涤 ,化学发光试剂显色 。结果 经北航 CM - 2000B 生物医学图像分析系统对目的 条带进行扫描和密度分析 。 1. 3 统 计 学 方 法 所 有 数 据 用 均 数 ±标 准 差 ( x ±s)表示 ,以 SPSS统计分析软件包的方差分析 (ANOVA )进行多组间均数比较 ,两两组间比较用 t 检验 。以 P≤0. 05为差异有显著性意义 。
第 6期 李艳波 ,等 P38信号通路在人脐静脉内皮细胞表达环氧化酶 22中的作用
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0 引 言
P38信号通路 (m itogen2activated p rotein kinase, P38MAPK)是丝裂素活化蛋白激酶 (m itogen2activated p rotein kinase,MAPK)家族的一个成员 ,通过对细胞 内信号的传递 ,参与细胞对许多外界刺激的调节反 应 [1 ] 。研 究 表 明 , 环 氧 化 酶 22 ( cyclooxygenase22, COX22)在动脉粥样硬化的发生中起重要作用 [ 2, 3 ] 。 我们在体外模拟糖尿病状态 ,探讨糖尿病时存 在的各种 应 激 反 应 , 如 高 葡 萄 糖 、糖 基 化 终 产 物 ( advanced glycosylation end p roducts, AGE) 生成增 多 、高胰岛素和过氧化氢对人脐静脉内皮细胞 ( hu2 man umbilical vein endothelial cells, HUVEC ) 中 P38MAPK、COX22 蛋白表达的影响及 P38MAPK在 表达 COX22中的作用 ,进一步揭示 P38MAPK在糖 尿病动脉粥样硬化中的作用 。
Abstract: O b jec tive: To investigate the ro le of P38 m itogen2activated p ro tein kinase ( P38MAPK) in exp ressing cyclooxygenase22 (COX22) in human umbilical vein endothelial cells ( HUVEC) , in order to study the role of P38MAPK on diabetic atherosclerosis. M e thods: HUVEC are separately stimula2 ted w ith high glucose, advanced glycosylation end p roducts (AGE) , high insulin and H2 O2 , the ex2 p ression of phospho2P38MAPK and COX22 is detected; Sim ultaneously, HUVEC p re2treated w ith SB203580 ( P38MAPK special inhibitor) are stim ulated w ith above stim ulating factors, the exp ression of COX22 is detected. R esu lts: H igБайду номын сангаас glucose, AGE, high insulin and H2O2 can activate P38MAPK and increase the exp ression both of phospho2P38MAPK and COX22 significantly; B ut the exp ression of COX22 is inhibited by SB203580. C on c lu sion: P38MAPK regulates the exp ression of COX22; P38MAPK is a up stream signal molecule of COX22 and P38MAPK m ay be one of initial signals on ather2 osclerosis occurrence. Key words: P38 m itogen2activated p rotein kinase; Cyclooxygenase22; D iabetes; A therosclerosis
3 收稿日期 : 2004212221; 修订日期 : 2005201231 基金项目 : 中国博士后基金资助项目 (批准号 : 2004035537) ;黑龙江省博士后基金资助项目 (批准号 : LRB03143) 作者简介 : 李艳波 (19652) ,女 ,黑龙江哈尔滨人 ,教授 ,医学博士 ,从事内分泌专业 。
1 材料和方法
1. 1 材料 人脐静脉内皮细胞系 (HUVEC,中国科 学院上海细胞生物学研究所细胞库提供 ) ; 新生牛 血清及 RPM I21640 培养液 ( Hyclone 公司产品 ) ; 蛋 白质相对分子质量标记物 (B io2Rad 公司产品 ) ; 磷 酸化 P38MAPK兔多克隆抗体 ( Promega公司产品 ) ; COX22兔多克隆抗体 ( Santa Cruz公司产品 ) ; W est2 ern2blot检测试剂盒 ( Promega公司产品 ) ; P38MAPK 特异性抑制剂 SB203580 ( Prom ega公司产品 ) 。 1. 2 方法 1. 2. 1 HUVEC的培养 HUVEC培养于 10%灭活 新生牛血清的 RPM I21640 培养液中 , 培养条件 为 37℃、饱和湿度和 5% CO2 ,每 2～3天用 0. 02%乙二 胺四乙酸 ( EDTA )消化传代 。 1. 2. 2 体外制备 AGE 参照文献 [ 4 ] ,按牛血清清 蛋白 (BSA ) 50 g/L与葡萄糖 90 g /L ,在体外于 37℃孵 育 60天 ;制备结束后用考马斯亮蓝法测定 AGE蛋白 含量 ,并测定其荧光强度 ; - 20℃避光保存备用 。 1. 2. 3 实验分组 实验分为 9 组 : ①对照 ( CON ) 组 ,无刺激因素孵育 HUVEC; ②高糖 ( HG) 组 ,加 入葡萄糖 25 mmol/L 后 ,孵育 72 h; ③ AGE组 ,加入 AGE 100 mg /L 后 ,孵育 6 h; ④高胰岛素 (H I) 组 , 加入胰岛素 100 nmol/L 后 ,孵育 24 h; ⑤过氧化氢 ( H2 O2 ) 组 ,加入 H2O2 100μmol/L 后 ,孵育 1 h。 ⑥ SB 2HG组 ; ⑦ SB 2AGE 组 ; ⑧ SB 2H I组 ; ⑨ SB 2H2 O2 组 ; ⑥～⑨是在 ②～⑤的各组基础上先分别加入 5 μmol/L SB203580,培养 30 m in 后 ,再加入葡萄糖 、 AGE、胰岛素及 H2 O2 ,浓度和孵育时间与相应刺激 组一致 [ 5 ] 。 1. 2. 4 W estern2blot法检测 P38MAPK和 COX22 蛋 白表达 培养的 HUVEC,经 R IPA 细胞裂解液 [ ( 50 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 ( Tris·Cl) , pH 8. 0, 150 mmol/L 的 NaC l, 0. 02%叠氮钠 (NaN3 ) ,
(哈尔滨医科大学第一临床医学院 , 11内分泌科 ; 2. 心内科 ,黑龙江哈尔滨 150001; 3. 中山医科 大学附属五院心内科 ,广东珠海 519000)
摘要 : 目的 : 探讨 P38信号通路 ( P38MAPK)在人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)表达环氧化酶 22 ( COX22)的作用 , 从而研究 P38MAPK在糖尿病动脉粥样硬化中的作用 。 方法 :分别以高葡萄糖 、糖基化终产物 (AGE) 、高胰岛 素和过氧化 氢 刺 激 HUVEC; 检 测 P38MAPK 和 COX22 在 HUVEC 的 蛋 白 表 达 。以 P38MAPK 特 异 性 抑 制 剂 SB203580预处理 HUVEC后 ,再用上述四种因素刺激 HUVEC,检测 COX22在 HUVEC的蛋白表达 。 结果 :高葡 萄糖 、AGE、高胰岛素和过氧化氢均可独立激活 P38MAPK,使磷酸化 P38MAPK表达量增加 , COX22蛋白表达量也 增加 ; SB203580预处理后 , COX22表达被显著抑制 。 结论 : P38MAPK调控 COX22的表达 ,它是 COX22的上游信 号分子 ,可能是动脉粥样硬化发生的始动信号之一 。 关键词 : P38信号通路 ; 环氧化酶 22; 糖尿病 ; 动脉粥样硬化 中图分类号 : R587. 2 文献标识码 : A 文章编号 : 100828199 (2005) 06204902033
