人MTERF3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

人MTERF3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

杨勇琴;张成桂;孙美涛;王昀;杨泽芳;张晓娟;熊伟

【摘 要】Objective Human mitochondrial transcription termination factor 3

( MTERF3 ) is a negative regulator of mito⁃chondrial gene expression and

energy metabolism. This study was to construct a prokaryotic expression

system for MTERF3 in Esche⁃richia coli ( E. coli ) and prepare its

mouse⁃anti⁃human polyclonal antibody. Methods The complete open

reading frame ( ORF) of human MTERF3 cDNA was amplified by RT⁃PCR

and subcloned into prokaryotic expression vector pET28b. Then the

recombinant plasmid pET28b⁃MTERF3 was transformed into competent

E.coli BL21(DE3) and IPTG induced the expression of 6×his fusion protein.

The recom⁃binant human MTERF3 protein was purified through Ni2+⁃NTA

agar⁃ose gel column affinity chromatography and the purified

recombinant protein was used as immunogen to immunize the BALB/c

mice to pre⁃pare its specific polyclonal antibody. The titer and specificity of

the antibody were analyzed by ELISA, Western blot and cellular

immuno⁃fluorescence, respectively. Results The recombinant

human MTERF3 protein was successfully expressed in E. coil and the

mouse⁃anti⁃human MTERF3 polyclonal antibody with high quality was

successfully prepared. ELISA showed that the titer of the antibody was

1:105 . Western blot and immunofluorescence detection revealed that the

mouse⁃anti⁃human MTERF3 antibody could recognize the native MTERF3

antigen specifically. Conclusion Human MTERF3 expressed in the prokaryotic system has strong immunogenicity and the polyclonal

antibody obtained from immunizing mice has high titer and specificity. The

prokaryotic expression of human MTERF3 and the preparation of its

antibody lay the foundation for further function research of human

MTERF3.%目的：人线粒体转录终止因子3（ mitochondrial transcription

termination factor 3， MTERF3）是线粒体基因表达及能量代谢的负调控因子。文中旨在研究大肠埃希菌中原核表达MTERF3蛋白及制备鼠抗人MTERF3多克隆抗体。方法RT⁃PCR扩增人MTERF3基因 cDNA的完整开放阅读框，克隆至原核表达载体 pET28b，转化大肠埃希菌感受态细胞 BL21（ DE3），IPTG诱导6×his融合蛋白质表达，Ni2＋⁃NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组人MTERF3蛋白，以纯化的重组蛋白为免疫原免疫BALB／c小鼠制备其特异性多克隆抗体，用ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测抗体的效价和特异性。结果成功在大肠埃希菌细胞中原核表达重组人MTERF3蛋白，并获得高质量的鼠抗人MTERF3多克隆抗体。 ELISA结果显示抗体的效价为1∶105，Western blot 和免疫荧光结果显示鼠抗人MTERF3能特异性识别天然的MTERF3抗原。结论原核表达的重组人MTERF3蛋白具有良好的免疫原性，其免疫小鼠后获得的多克隆抗体具有高效价和高度的特异性。人MTERF3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备为进一步研究人MTERF3的功能奠定了实验基础。

【期刊名称】《医学研究生学报》

【年(卷),期】2016(029)010

【总页数】6页(P1020-1025)

【关键词】人线粒体转录终止因子3;原核表达;纯化;多克隆抗体 【作 者】杨勇琴;张成桂;孙美涛;王昀;杨泽芳;张晓娟;熊伟

【作者单位】671000大理，大理大学基础医学院;671000大理，云南省昆虫生物医药研发重点实验室;671000大理，大理大学基础医学院;671000大理，大理大学基础医学院;671000大理，大理大学基础医学院;671000大理，大理市第一人民医院呼吸内科;671000大理，大理大学基础医学院

【正文语种】中 文

【中图分类】Q786

[DOI] 10.16571/ki.1008-8199.2016.10.003

线粒体转录终止因子(mitochondrial transcription termination factor, MTERF)蛋白家族是一类能够与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)特异结合的单体蛋白质，广泛存在于后生动物与植物中[1]。该蛋白家族共有4个成员，分别是线粒体转录终止因子1-4(mitochondrial transcription termination factor 1-4，

MTERF1-F4)[2]。其中，MTERF3是MTERF家族中最保守的成员，从低等的果蝇到高等的哺乳动物中都存在[3]。人MTERF3基因定位于人类第8号染色体8q22.1，编码1个相对分子质量为47 000的蛋白质，该蛋白质包含5个保守的MTERF基序，其中3个均含有亮氨酸拉链结构[4]。

Park等[5]首次报道MTERF3是哺乳动物线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。MTERF3通过结合mtDNA启动子区而抑制转录过程，缺失MTERF3的细胞mtDNA的2条链的转录起始活性增强，尤其是对启动子附近的基因转录具有积聚效应。心脏、骨骼肌等特异性组织中MTERF3的失活，会导致异常的mtDNA转录，严重的呼吸链缺陷和氧化磷酸化活性降低等现象[6]。此外，研究还发现MTERF3可特异性结合到16S核糖体RNA，调控核糖体的生物合成，缺失MTERF3的小鼠组装线粒体核糖体大亚基的水平呈明显降低趋势[7]。可见，MTERF3这一因子主要抑制mtDNA的表达，通过减少呼吸链酶复合体的酶活性而降低细胞能量的合成，关于MTERF3的研究可为恶性肿瘤、糖尿病、心脏病和帕金森病等疾病的治疗开辟新的思路。

本研究将人MTERF3基因cDNA的完整开放阅读框(open reading frame, ORF)序列克隆到原核表达载体pET28b中，将经筛选和鉴定正确的阳性重组表达载体转化至大肠埃希菌感受态细胞BL21(DE3)，在IPTG 诱导下进行表达，并对其表达产物包涵体进行纯化，利用纯化的包涵体免疫小鼠制备相应的多克隆抗体，制备的抗体通过ELISA、Western blot和细胞免疫荧光技术进行鉴定，为下一步研究人MTERF3的生物学功能奠定良好的实验基础。

1.1 材料

1.1.1 细胞株、质粒及实验动物 pET28b载体购于Novagen公司；人宫颈癌HeLa细胞、人胚肾HEK293细胞购自上海细胞库，大肠埃希菌感受态细胞DH5α、BL21(DE3)为本实验室保存；BALB/c小鼠购自昆明医科大学实验动物中心。

1.1.2 试剂 Oligo(dT)、Random Primer购于Sangan公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、RNasin、逆转录酶MMLV购于Promega公司；PCR产物回收及质粒提取试剂盒购于Omega公司；TRIzol RNA提取试剂、DL2000 DNA maker、pMD18T-vector、限制性内切酶、T4 DNA ligase购于Takara公司；Ni2+-NTA Agrose层析柱购于Invitrogen公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购于Sigma公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG购于Santa Cruz Biotechnology公司；预染蛋白分子量标准购于Fermantas公司；BeyoECL Plus购于碧云天公司；常规试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 pET28b-MTERF3原核表达载体的构建 根据已报道的人MTERF3基因的DNA序列，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计人MTERF3基因的扩增引物，Primer-F(带NdeI酶切位点)：5′-CCGCATATGATGGCTTTGTCAGCCCA-3′)；Primer-R(带HindIII酶切位点)：5′-CCGAAGCTTTCTAAAGCGTTTTTAAGA-3′)，由上海生工生物工程技术有限公司完成。用含10%小牛血清的RPMI1640培养基于5%CO2，37 ℃培养HEK293细胞，待细胞生长到铺满培养瓶(25 cm2)80%时，加入1 mL TRIzol提取总RNA，以此为模板合成cDNA后进行PCR反应，反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃

30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行35个循环，72 ℃再延伸10 min；扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定回收后TA克隆至pMD18T载体，将该重组质粒命名为pMD18T-MTERF3，NdeI、HindⅢ双酶切pMD18T-MTERF3及pET28b空载体，凝胶回收MTERF3目的片段及pET28b载体，并用T4DNA

ligase连接并转化到大肠埃希菌DH5α，阳性克隆接种于5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养液，37 ℃振荡培养过夜，收集细菌提取质粒，酶切鉴定正确后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。