单染色
1、涂片：
用接种环沾取细菌培养液，在玻片上涂成直径约为1.0cm 的菌膜。
（Tip:菌量不宜过多，以免标本过厚，影响染色结果）
2、干燥：
最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微微烘干，但切勿靠近火焰以免烤焦标本。
（注意：如烘干，以玻片不烫手为宜。
）
3、固定：
火焰固定。
将标本涂片在火焰外层内来回通过3次。
固定的作用一是杀死细菌，同时可改变对染料的通透性（因为活的细菌一般不让各种染料进入细胞内）。
再者使细菌与玻片粘附牢固，三是使细菌蛋白凝固后保持其固有的外形。
4、染色：
滴加结晶紫、稀释复红或碱性美兰液1～2滴，使染液盖满涂膜，1～2分钟后，用细小流水洗去多余的染液，在空气中自然干燥或用吸水纸轻轻吸干（切忌拖、拉）。
5、镜检
结果：
用结晶紫染色的细菌葡萄球菌、大肠杆菌呈紫色；用复红染色者均为红色；用碱性美兰染色者均为蔚蓝色。
复染
革兰染色法
过程：
初染：结晶紫1分钟
媒染：碘液1分钟
脱色：95%酒精半分钟
复染：稀释复红半分钟
每步染色完后均需水洗。
葡萄球菌的革兰染色
变形杆菌的革兰染色
链球菌的革兰染色
紫碘酒红一一半半
球阳杆阴阳紫阴红
注：脑淋卡白抗孢除外
过程
1、涂片：用棉签或接种环沾取细菌培养液，在玻片上涂成直径约为1.0cm 的菌膜。
2、干燥：最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微微烘干。
但切勿靠近火焰以免烤焦标本。
3、固定：火焰固定。
4、革兰染色过程：
初染：结晶紫1分钟
媒染：碘液1分钟
脱色：95%酒精半分钟
复染：稀释复红半分钟
5、镜检：球阳杆阴阳紫阴红
化脓性球菌分离鉴定
化脓性球菌主要有葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。
触酶实验
原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧分子-出现气泡。
操作步骤：在洁净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与生理盐水中乳磨均匀，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。
结果观察：有大量气泡产生者为阳性。
不产生气泡者为阴性。
G+球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于G+球菌的初步分群。
血浆凝固酶试验
原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，导致血浆凝固；而非致病性葡萄球菌由于不产生此酶，故不能凝固血浆，二者可据此予以区别。
操作：玻片法——取干净玻片一块，血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端；用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血浆充分混匀。
结果观察：30秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑浊，而兔血浆则呈块状或颗粒状者为阳性。
甘露醇发酵试验
接种甘露醇单糖管，观察颜色改变及气体产生情况。
发酵甘露醇产酸者，使酸碱指示剂（溴麝香草酚蓝）
在酸性环境下由蓝色转变为黄色（阳性）。
肠道菌分离鉴定
肠道杆菌是一大群寄居在人类和动物的肠道中的生物学性状近似的革兰阴性的杆菌，该类细菌无芽胞，多数有周鞭毛。
需氧或兼性厌氧，能分解葡萄糖及其他碳水化合物，产酸、有些产气。
多数肠道菌是肠道的正常菌群，当宿主免疫力降低或侵入肠道外等部位时，也可成为条件致病菌引起疾病。
有的肠道杆菌例如伤寒沙门菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌等，是肠道致病菌，可导致人类某些肠道传染病。
本次试验以粪便为标本进行肠道菌的分离鉴定。
粪便标本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以及大肠杆菌等肠道菌，要求从标本中分离出单一的致病菌，并通过后续的试验鉴定出致病菌。
S.S琼脂培养基(Salmonella Shigella agar)中含有胆盐、煌绿、枸橼酸钠、中性红指示剂（菌落是否产酸——酸红碱黄）等成分，不仅能抑制G+菌的生长，也能部分抑制某些G-菌的生长。
大肠杆菌（非致病性肠道菌）在此平板上生长，可分解培养基中乳糖产酸，与胆盐作用形成胆酸沉淀，使中性红指示剂变红，形成红色浑浊不透明菌落，如大肠埃希菌。
肠道致病菌则不分解乳糖，形成无色或淡黄色菌落（因分解蛋白质产生碱性物质），如志贺菌。
黑色，产生H2S，如志贺菌。
克氏双糖铁培养基（鉴别培养基）
组成及作用
葡萄糖、乳糖（1：10）：可被细菌分解产酸产气
蛋白胨：细菌分解可产生H2S
硫酸亚铁：与H2S结合形成FeS黑色沉淀
酚红指示剂: pH范围(酸黄碱红)
→以克氏双糖铁培养基的斜面部分代表是否发酵乳糖，底层部分代表是否发酵葡萄糖。
→当细菌分解糖类产气时，培养基中还会有气泡或裂隙出现。
→培养基中含有的硫酸亚铁，可用于检查细菌能否分解蛋白胨中含硫氨基酸生成H2S，如果有H2S产生，在酸性环境下，则能与硫酸亚铁反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀，培养基中出现黑色物质。
取克氏双糖铁培养基斜面上的菌苔，分别接种
▲半固体培养基观察细菌有无动力。
▲蛋白胨水培养基用于观察细菌能否分解色氨酸产生吲哚。
▲尿素培养基是根据酚红指示剂变色来判断细菌是否分解尿素产碱。
▲斜面培养基是为下一次血清学鉴定提供菌种。
血清学鉴定——玻片凝集试验
根据前几次实验结果综合判定自己所接种的肠道菌可能属于哪种肠道病原菌。
枯草芽孢杆菌芽胞染色
原理：利用细菌的芽胞和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽胞和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽胞壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或石碳酸复红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽胞，进入菌体的染料可经95%乙醇脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液，如稀释复红液或碱性美蓝处理，则菌体和芽孢易于区分。
步骤
（1）制片：涂片、自然干燥、固定
（2）染色：
石碳酸复红或孔雀绿（加热3-5 min）芽胞染色
95%乙醇（0.5-1 min）背景脱色
碱性美蓝液或稀释复红（0.5-1 min）菌体着色
（3）结果观察
镜检：芽胞呈红色，菌体呈蓝色。
结核分枝杆菌抗酸染色
结核分枝杆菌
→细长微弯杆菌，分枝状排列或聚集成团;
→G+，抗酸染色阳性;
→专性需氧，营养要求高（L-J培养基）;
→生长缓慢（18h/代）；
→菌落呈乳白或淡黄色，菜花状;
→液体培养时形成粗糙的皱纹菌膜。
结核杆菌抗酸染色原理
结核杆菌体内含有大量脂质（尤其分枝菌酸），不易着色，经加热和延长染色时间着色后，又能抵抗强脱色剂-盐酸酒精的脱色，使细菌保持染上的红色。
而非抗酸菌脱色后再被碱性美兰液复染成为蓝色。
步骤：
注意事项：
▲加热出现蒸汽后，脱离火焰，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸。
▲流水自涂片部位上端清洗。
▲每个样本观察100-300视野。
▲注意污物消毒和处理。
▲石炭酸具有刺激性和腐蚀性，需注意安全。
抗酸染色结果：
结核分枝杆菌：红色
背景及非抗酸细菌：蓝色。
