血清2型鸭疫里默氏杆菌铁载体受体蛋白突变体的构建及生物学特性研究

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鸭疫默里氏杆菌的分离鉴定及其部分生物学特性研究

鸭疫默里氏杆菌的分离鉴定及其部分生物学特性研究汪招雄; 范旭强; 杨玉莹; 程太平【期刊名称】《《长江大学学报（自然版）理工卷》》【年(卷),期】2008(005)004【总页数】3页(P32-34)【关键词】鸭疫默里氏杆菌(Riemerella anatipesti fer); 分离; 生化鉴定; 耐药谱【作者】汪招雄; 范旭强; 杨玉莹; 程太平【作者单位】长江大学动物科学学院湖北荆州 434025【正文语种】中文【中图分类】S852.61鸭传染性浆膜炎是由鸭疫默里氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)所引起的败血性疾病，本病的传播途径通常为呼吸道感染，幼鸭较具感受性，初呈忧郁，流鼻水，食欲减退，排出绿色或黄色下痢便，病重时脚麻弊，有时候头部震颤，有斜颈或回旋等神经症状。

病鸭在眼窝下窦有囊样肿胀，眼结膜充血，脚足关节或趾关节呈现肿胀，幼鸭发病病程短，剖检可见显著的纤维性心包膜炎、肝包膜炎，肝及脾肿大，气囊增厚及浑浊。

该病在世界范围内广泛流行，发生率甚高，死亡率为10%～50%[1]。

在我国，由于饲养技术的调整不当以及大量耐药性菌株的出现，每年都给养殖户带来较大的经济损失[2,3]。

鸭疫默里氏杆菌血清型比较复杂，根据菌体抗原的不同，将该菌分为21个血清型(1～21)；各国各地流行的血清型也不一致，我国以1型为主，也存在2型的报道[4～6]。

分离地方株、了解地区流行血清型，对预防和控制RA有重大的现实意义,同时也可为该菌毒力基因的研究奠定基础。

基于此，本研究采集了湖北省不同地区鸭传染性浆膜炎疑似病例的血液、脑、心脏和肝脏进行了细菌分离与鉴定，并对其生物学特性进行了初步研究。

1 材料与方法1.1 材料病料来源于湖北荆州、潜江、荆门等地规模化鸭场的鸭疫默里氏杆菌病疑似病例。

生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司，药敏片购自中国药物研究所，健康小白鼠购自湖北省武汉市生物制品所实验动物中心，胰蛋白大豆琼脂(Tryptic Soy Agar,TSA)购自B.D公司。

2型鸭疫里默氏菌42000外膜蛋白的克隆与表达

2型鸭疫里默氏菌42000外膜蛋白的克隆与表达刘文华;苏敬良;王晓雷【期刊名称】《中国兽医学报》【年(卷),期】2008(28)4【摘要】利用PCR技术扩增了标准血清2型鸭疫里默氏菌的42000外膜蛋白基因片段(OmpA-2)1045bp,将其克隆到pGM-T-Easy克隆载体和pGEX-4T-1原核表达载体中,分别构建了pGM-OmpA-2和GST-OmpA1-2重组子,并进行了测序和表达。

对表达产物做了SDS-PAGE和Western-blotting检测。

结果表明,扩增获得的外膜蛋白基因序列与Gen-Bank中已发表的鸭疫里默氏菌外膜蛋白序列的同源性为95.4%,氨基酸序列间仅存在点置换,无插入或缺失变异,证明重组子构建正确。

SDS-PAGE和Western-blotting检测表明,获得的融合表达蛋白GST-OmpA1-2的相对分子质量约为65000。

【总页数】5页(P379-382)【关键词】鸭疫里默氏菌;外膜蛋白;克隆;表达【作者】刘文华;苏敬良;王晓雷【作者单位】中国农业大学动物医学院;莱阳农学院动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】Q78;S852.61【相关文献】1.1、2型鸭疫里默氏菌外膜蛋白分析 [J], 程龙飞;施少华;李文杨;傅光华;彭春香;黄瑜2.鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A克隆表达及纯化 [J], 李富祥;王传禹;胡骑;苗海生;李华春3.鸭疫里默氏菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达 [J], 高云航;刘佳丽;王巍;李秋菊;张福君;马红霞4.16S rRNA基因及外膜蛋白基因分析在鸭疫里默氏菌鉴定中的应用 [J], 刘文华;苏敬良;刘颖;许秀梅;金鑫;吴培福5.鸭C4BPα的克隆、表达及其与鸭疫里默氏菌的互作 [J], 李德龙; 谭理娟; 谷九龙; 王思媛; 刘婷; 陈思怀; 高继业; 唐发书; 李继祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

１４株鸭疫里默氏杆菌的部分生物学特性分析

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［Ｊ］．分析测试学报，２００１，２０（２）：５５－５７．［９］张治安，陈展宇．植物生理学实验技术［Ｍ］．长春：吉林大学出版社，２００８：１１１．［１０］彭张林．综合评价过程中的相关问题及方法研究［Ｄ］．合肥：合肥工业大学，２０１５．［１１］洪永辉，陈天增，王如均，等．金花茶组植物品种选择与评价［Ｊ］．林业勘察设计，２０１８，３８（２）：１－７．［１２］ＨｕａｎｇＬＰ，ＺｈａｎｇＱＲ，ＺｈａｎｇＺ，ｅｔａｌ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｉｎｅｒａｌｎｕｔｒｉｅｎｔｅｌｅｍｅｎｔｓａｎｄｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｒｕｉｔｔｒｅｅｓ［Ｊ］．ＡｓｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，９（１０）：７５－７６，８１．［１３］ＷｏｊｃｉｋＰ，ＷｏｊｃｉｋＭ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｏｒｏｎｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｎ‘Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ’ｐｅａｒｔｒｅｅｖｉｇｏｒ，ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ａｎｄｆｒｕｉｔｙｉｅｌｄａｎｄｓｔｏｒａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．ＰｌａｎｔａｎｄＳｏｉｌ，２００３，２５６（２）：４１３－４２１．［１４］ＲｅｅｄＢＭ，ＷａｄａＳ，ＪｅａｎｉｎｅＤ，ｅｔａｌ．Ｍｉｎｅｒａｌｎｕｔｒｉｔｉｏｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｐｅａｒｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＩｎＶｉｔｒｏＣｅｌｌｕｌａｒ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ－Ｐｌａｎｔ，２０１３，４９（６）：６９９－７０９．［１５］位　杰，马建江，陈久红，等．库尔勒香梨叶片营养元素含量的年变化规律及相关性研究［Ｊ］．河南农业科学，２０２０，４９（３）：１２１－１２８．［１６］华雅洁，胡甜甜，王良桂，等．不同苗龄楸树叶片营养成分的季节性变化［Ｊ］．西南大学学报（自然科学版），２０１９，４１（３）：４９－５７．　［１７］翟晓巧，曾　辉，刘艳萍，等．构树不同无性系间叶片营养成分及叶形的变化［Ｊ］．东北林业大学学报，２０１２，４０（１１）：３８－３９，５２．左春生，李迎晓，徐光科，等．１４株鸭疫里默氏杆菌的部分生物学特性分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２０，４８（１５）：２２１－２２５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２０．１５．０４０１４株鸭疫里默氏杆菌的部分生物学特性分析左春生，李迎晓，徐光科，李　洵，饶　丹，吴海港，刘锦妮，黄　立，赵　聘，焦凤超（信阳农林学院／河南省水禽资源开发利用与疫病防控工程技术研究中心，河南信阳４６４０００）摘要：为了解鸭疫里默氏杆菌的流行情况，对信阳地区疑似鸭疫里默氏杆菌感染病料进行病原分离和鉴定。

间接ELISA方法检测血清2型鸭疫里默氏杆菌的研究

摘要：应用超声波裂解法制备的血清２型鸭疫里默氏杆菌裂解物作为抗原包被酶标板．以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭ＩＧ抗体为第二抗体，Ｔｇ以ＭＢ为显色剂，功地建立了检测鸭血成
清２型鸭疫里默氏杆菌抗体的间接Ｅ１Ａ方法。特异性试验和重复性试验证明此方法的特异性ＬＳ
调查，我国目前主要流行血清型为１２、型。我们在做
山东省鸭疫里默氏杆菌的血清流行病学调查时发
现，分离的鸭疫里默氏杆菌以血清２型较多。本研究
针对我省主要流行的２型Ｒ建立检测其抗体的间Ａ．接ＥＩＡ方法，ＬＳ并将此方法与间接血凝试验、片凝玻
５１ＭＨＳ４０ｌ２终止反应，ｘ２Ｏ测定Ａ２ ∞ｎｍ值。每块板都设立阴、阳性血清对照孔。试验完成后置酶标仪中读取４２ｍ的吸光度。同时以鸭阴性血清为阴性对照．９ｎ以强阳性血清为阳性对照，以抗体稀释液代替待检血清为空白对照，所有值必须减去空白对照的Ａ值。１２２包被抗原的制备将过夜培养的２型Ｒ．．Ａ离心得沉淀，用灭菌生理盐水洗涤直至上清液完全透明，新离心后用少量包被液重悬，重再用超声波裂解
蛋白质稀释倍数来测定蛋白含量，将制备好的抗原分装，２￣下保存备用。一０２１１．包被抗原最佳浓度的确定．３２
网
，
采用棋盘滴定法
１．血清制备．３１性血清。
收稿日期：０８６１２０— —０

鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定及耐药性分析

鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定及耐药性分析作者：蔡丙严王涛吴植李巨银来源：《江苏农业科学》2014年第01期摘要：从泰州地区疑似鸭疫里默氏杆菌感染鸭场采集病料，经细菌分离培养得到2株菌株，通过细菌形态、培养特性、生化试验等方法鉴定为鸭疫里默氏杆菌，分别命名为TY1株和TY2株。

采用玻片凝集试验对2个分离株进行血清型鉴定、K-B 纸片扩散法进行12种常用抗菌药物的药敏试验，结果显示，TY1和TY2株均为血清1型，对头孢吡肟、环丙沙星高度敏感，对复方新诺明、阿米卡星、庆大霉素、青霉素、链霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平耐药。

关键词：鸭疫里默氏杆菌；血清型；鉴定；药敏试验中图分类号： S858.322.61文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0168-02收稿日期：2013-05-09基金项目：江苏省高等学校大学生实践创新训练计划（编号：2012JSSPITP3463）；江苏农牧科技职业学院科技资助项目（编号：YB1204）。

作者简介：蔡丙严（1980—），男，河南濮阳人，硕士，讲师，主要从事动物防疫与检疫专业的教学及科研工作。

E-mail：caibingyan20@。

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一种革兰氏阴性、无鞭毛、无芽孢的棒状杆菌，瑞氏染色呈两极着色。

鸭疫里默氏杆菌所引起的传染病称为鸭传染性浆膜炎，该病呈世界范围分布，给养鸭业带来了巨大的经济损失[1]。

RA对营养要求较高，在普通营养琼脂和麦康凯琼脂上不生长，在胰酶大豆琼脂（TSA）、血液琼脂、巧克力琼脂上生长良好。

RA在初次分离培养时对CO2依赖性强，一般在烛罐或CO2培养箱中，提高CO2浓度和湿度，37 ℃培养 48～72 h，RA生长最佳[2]。

RA 血清型众多且非常复杂，现在国际上报道的血清型共有21 种，其中优势血清型为 1 型和 2 型[3]，在我国，程安春等在此基础上又发现了4 个新的血清型[4]。

鸭疫里默氏杆菌基因组文库的构建及免疫原性基因初步筛选

鸭疫里默氏杆菌基因组文库的构建及免疫原性基因初步筛选朱德康;程安春;汪铭书;丁轲【期刊名称】《中国兽医学报》【年(卷),期】2007(27)6【摘要】以血清1型鸭疫里默氏杆菌（RA）CH-1株为材料提取基因组DNA，采用限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切消化，纯化回收1．0～6．5kb片段，用T4DNA连接酶将回收片段与经BamHI酶切并去磷酸化的ZAP Express载体进行连接，用噬菌体包装蛋白包装。

经测定包装滴度为5.23×10^6pfu／mL，蓝白斑筛选重组率为96．8％，表明已成功构建血清1型RA CH-1株部分基因组文库。

在此基础上以RA抗血清为抗体探针进行免疫筛选，获得3个阳性克隆，经多次重复筛选后再体内删除，得到含有插入片段的质粒并测序。

生物信息学分析结果显示，该序列（GenBank登录号：DQ151838）含有1个编码369个氨基酸的完整开放阅读框架，是尚未见报道的RA基因序列，并且存在多个预测的抗原表位。

【总页数】4页(P834-837)【关键词】鸭疫里默氏杆菌;免疫筛选;抗原表位【作者】朱德康;程安春;汪铭书;丁轲【作者单位】四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心【正文语种】中文【中图分类】S852.61;Q78【相关文献】1.应用抑制性差减杂交筛选鸭疫里默氏杆菌强弱菌株基因组的差异片段 [J], 俞慧;胡青海;邢林林;祁晶晶;倪欣涛;姜盼;孙冰清;崔俊生;欧长灿;于圣青2.血清Ⅱ型鸭疫里默氏杆菌基因组文库的构建 [J], 林树乾;何元龙;赵增成;李峰3.RAPD用于鸭疫里默氏杆菌鸭源致病性大肠杆菌和鸭沙门氏菌的遗传相似性及聚类分析的初步研究 [J], 汪铭书;程安春;李淑梅;朱德康;陈孝跃4.1型鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及基因组文库的构建 [J], 齐冬梅;袁建丰;覃宗华;吴彩艳;谢明权5.鸭疫里默氏杆菌免疫原性研究Ⅱ.荚膜提取物免疫原性测定 [J], 苏敬良;郭玉璞;吕艳丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

鸭疫里默氏杆菌分子生物学研究进展

纹图谱技术进行其亚型的确定研究。
Ｒｍｅ等利用１限制性核酸内切酶对鸭疫里默氏ｉｌｒ７种
４个长的可阅读框架。其中２个被命名为ＶａＤ１Ｖｐｐ和ａＤ２的可测读框架所编码的蛋白质可被认为与毒力蛋白相关。ｐＦ含有的被命名为ＲｐＣＣ１ｅＡ１的可阅读框架所编码的蛋白质，与奈瑟双球菌（ｉｅｉｇｎｒｅｅ、肠弯曲杆菌Ｎｅｓｒｏｏｒａ）ｓａｈ
中图分类号：￥５．１８２６
文献标识码：Ｂ
文章编号：１０．５９２０）２０５．４０８０８（０８０．１７０
鸭疫里默氏杆菌（ｅｒｌｎｔｅｔｅ，Ｒ是一种ＲｉｅａａａｐｓｆｒＡ）ｍｅｌｉｉ
毒力基因之一。
１Ｒ分子生物学研究概况Ａ
１１Ｄ．ＮＡ指纹图谱技术的应用ＤＮＡ指纹技术以ＤＡＮ
一
Ｃａｇ等对从台湾分离的６ｈｎＯ株Ｒ菌株研究后表明大Ａ部分菌株含有质粒 …】。其中６Ｏ％的分离株（６６）３／０中含有个３９ｋ．ｂ的质粒，１２％的分离株（／０中含６５ｋ７６）．ｂ和１ｂ的质粒，５％的分离株（／０含有２９ｋ６ｋ３６）．ｂ、１ｂ和６ｋ１ｂ的质粒，１８ｋ３％的分离株（４６）含有质粒。３９ｋ１／０不．ｂ
的质粒，被命名为ｐＦ，经测序获得了全序列，包含了ＣＣ１

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的克隆及序列分析

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的克隆及序列分析万春和;程龙飞;陈红梅;傅光华;施少华;黄瑜【摘要】本研究根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,利用PCR方法从已鉴定为2型鸭疫里默氏菌RA-FJ株的基因组DNA中扩增目的基因片段,胶回收PCR扩增片段,克隆到pMD18-T载体后进行序列测定.采用生物信息学软件对测序结果进行分析,结果表明所获得的Ra DtxR基因编码完整的开放阅读框,全基因长度为654 bp,编码217个氨基酸.所编码的蛋白大小为24.82 ku,理论等电点为5.69,不稳定系数为38.45,属于稳定蛋白质类.将其与GenBank中已发表的RaDtxR基因序列进行核苷酸同源性比对分析,结果显示其与鸭疫里默氏菌疫苗株RA-CH-1株(GenBank登录号:CP003787)的核苷酸同源性为100.0％,与其他4株核苷酸同源性均为99.8％,仅在186位处存在无义突变.利用该基因对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的鸭大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌进行扩增,结果显示均未扩增到条带,对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的1型、2型、3型、11型和13型鸭疫里默氏菌均可扩增出特异性目的条带,表明RaDtxR基因可作为鸭疫里默氏菌鉴别诊断的靶基因.试验结果表明,本研究成功克隆到鸭疫里默氏菌RaDtxR基因,为研究其功能奠定基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)012【总页数】5页(P85-89)【关键词】鸭疫里默氏菌;铁依赖抑制子基因;克隆;生物信息学分析【作者】万春和;程龙飞;陈红梅;傅光华;施少华;黄瑜【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨 150001;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013【正文语种】中文【中图分类】Q78鸭疫里默氏菌病是由鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一种接触性、传染性疾病，又称鸭传染性浆膜炎（infectious serositis of duck）。

我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性_程安春

我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性程安春1,汪铭书1,陈孝跃1,朱德康1,黄　城1,刘　菲1,周　毅1,郭宇飞1,刘兆宇1,2,方鹏飞1,3　(1.四川农业大学动物科技学院禽病防治研究中心,四川雅安625014;2.深圳市进出口检验检疫局,广东　深圳518000;3.四川省精华企业集团有限责任公司,四川简阳641400)摘要:从全国29个省(市、自治区)不同代次(原种、祖代、父母代和商品代)的5～90日龄患有典型鸭传染性浆膜炎的病死鸭分离到1842株鸭疫里默氏杆菌,血清型分布为1(638株)、2(367株)、3(102株)、4(146株)、5(89株)、6(49株)、7(87株)、8(68株)、10(43株)、11(35株)、13(56株)、14(61株),另有101株不属于1～21血清型,而分属于4个相同的抗原型,被命名为22(21株)、23(18株)、24(34株)和25(28株)血清型。

各血清型对雏鸭均具有较强致病性和免疫原性关键词:鸭疫里默氏杆菌;新血清型;致病性;免疫原性中图分类号:S 852.61 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2003)04-0320-04 收稿日期:2003-01-09 基金项目:教育部重点项目(01102);四川省“十五”攻关项目(010*******) 作者简介:程安春(1965-),男,教授,博士。

鸭疫里默氏杆菌(Riemer ella anatip estif er ,RA )病是目前造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一,广泛分布于世界上各养鸭国家[1]。

使用疫苗进行免疫接种是控制该病非常有效的措施,但RA 的血清型较多,到目前为止,共报道有21个血清型(1～21型)[2～9],各血清型之间又没有交叉保护[2],这就要求使用疫苗的抗原血清型必须与生产中流行菌株的血清型一致。

所以,对RA 在鸭群中的流行情况进行分离鉴定非常必要,它将有利于研制具有很强针对性的疫苗[7]。

鸭疫里默氏杆菌病研究进展

76 XIANGCUN KEJI 2022年2月（下）乡科技村XIANGCUN KEJI乡村科技·畜牧兽医鸭疫里默氏杆菌病研究进展孙　瑜（西藏职业技术学院，西藏拉萨 850000）［摘　要］　鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种接触性传染性疾病，具有发病率高、死亡率高的特点，会给养鸭业带来严重的经济损失。

为了有效防治鸭疫里默氏杆菌病，养殖人员和兽医需要了解其流行情况、病原、血清型、耐药性等，结合疫病发生情况采取防治措施。

［关键词］　鸭疫里默氏杆菌；血清型；防治措施［中图分类号］　S858.32 ［文献标志码］　A ［文章编号］　1674-7909（2022）04-76-30　引言鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer ，RA ）引起的急性或慢性以败血症为主要症状的接触性传染病，主要侵害家鸭和火鸡，发病率高，死亡率也较高，易导致二三周龄家禽染病。

在病变上，鸭疫里默氏杆菌病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎为特征，部分病例出现关节炎，还可发现共济失调、生长发育迟缓等症状。

1　鸭疫里默氏杆菌病流行情况鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎，主要侵害家鸭，鹅和火鸡也易感病［1-3］。

自美国学者首次报道鸭传染性浆膜炎后，鸭疫里默氏杆菌病呈世界性流行，英国、澳大利亚、泰国、德国和新加坡等均有该病的相关报道［4］。

我国自1982年在广东省首次报道该病以来，北京、上海、海南、江苏、河南和广西等省（自治区、直辖市）相继报道了鸭传染性浆膜炎的发生［5］。

鸭疫里默氏杆菌病是危害养鸭业最为严重的疾病之一，发病率高，一般为70%～80%，有时高达90%；死亡率高低受多种因素影响，一般为10%～20%，有的高达90%［6］。

鸭疫里默氏杆菌病多见于1～8周龄的小鸭，二三周龄最易感，种鸭和成年鸭不易感。

感染病鸭主要以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎为特征，部分病例出现关节炎。

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血清2型鸭疫里默氏杆菌铁载体受体蛋白突变体的构建及生物学特性研究董嘉文;孙敏华;李林林;马海彬;龚凤平;罗梦萍;王贵平;袁建丰【摘要】Iron is an important growth factor of pathogenic bacterium, the research shows that the iron uptake system regulates Riemerella anatipestifer iron metabolism and is one of the important pathogenic factor of Riemerella anatipestifer. In this study, the relationship between Riemerella anatipestifer ATP dependent outer membrane siderophore receptor protein(SRP) and iron metabolism, bacterial virulence factor was investigated. The mutant of SRP protein was constructed and the growth curve test showed that the growth of the mutant strain was slower about 10 hours than that of wild type strain in the iron limited environment, it indicated that SRP protein was one of the essential factors of Riemerella anatipestifer infection and had a vital role in maintaining Riemerella anatipestifer iron metabolism in vivo . The animal experiment showed that the dead time of duck infected the mutant was later 24 hours than that of the wild type strain. It showed that the growth rate of mutant strain and the speed reaching lethal number was obviously later than the wild type. Thus it indicated that SRP was one of the important virulence factor in Riemerella anatipestifer.%铁离子是致病菌重要的生长因子,研究表明铁离子摄取系统调控鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)铁离子的代谢,是鸭疫里默氏杆菌重要的致病因子之一.为了研究RA外膜ATP依赖的铁载体受体蛋白(siderophore receptor protein, SRP)在铁离子代谢中的作用,以及SRP与细菌毒力之间的关系,本研究构建了SRP基因的突变株,通过TSB培养基和限铁环境中的生长曲线比较,结果显示突变株在限铁环境中比TSB培养基生长慢约10 h,表明SRP基因是鸭疫里默氏杆菌在体内维持铁离子代谢至关重要的成份.动物试验表明突变菌株比野生型菌株晚24 h开始死亡,说明突变菌株在体内增殖并达到致死数量的速度明显要晚于野生型,从而提示SRP是鸭疫里默氏杆菌重要的毒力因子之一.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)003【总页数】6页(P45-50)【关键词】鸭疫里默氏杆菌;铁离子摄取系统;铁载体受体蛋白;毒力因子【作者】董嘉文;孙敏华;李林林;马海彬;龚凤平;罗梦萍;王贵平;袁建丰【作者单位】广东省农业科学院动物卫生研究所,广州510640;广东省兽医公共卫生公共实验室,广州510640;广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广州 510640;农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广州510640;广东省农业科学院动物卫生研究所,广州510640;广东省兽医公共卫生公共实验室,广州510640;广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广州 510640;农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广州510640;广东省农业科学院动物卫生研究所,广州510640;广东省兽医公共卫生公共实验室,广州510640;广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广州510640;农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广州510640;广东海大畜牧兽医研究院有限公司,广州 511400;广东海大畜牧兽医研究院有限公司,广州511400;广东海大畜牧兽医研究院有限公司,广州 511400;广东海大畜牧兽医研究院有限公司,广州 511400;广东海大畜牧兽医研究院有限公司,广州 511400【正文语种】中文【中图分类】S852.617鸭疫里默氏杆菌病是一种高致病性、接触性传染病，其病原体为鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）[1,2]，主要侵害1~8 周龄（尤其2～3周龄）雏鸭、雏鹅及雏火鸡等。

鸭疫里默氏杆菌病病程多呈急性或慢性败血症，主要以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，发病率90%以上，死亡率高达75%，耐过的病鸭常长成残次鸭或僵鸭，饲料转化率降低，生长发育迟缓，由RA引起的输卵管炎严重影响鸭成年后产蛋率[3-5]。

因此鸭疫里默氏杆菌病的广泛流行给养鸭业带来了严重的经济损失。

铁是生命系统所必需的分子。

在脊椎动物体液中，铁绝大部分与转铁蛋白和乳铁蛋白结合在一起。

致病菌要想在宿主体内建立感染，很大程度上依赖于其利用宿主铁复合物的能力，因此微生物的铁载体运输系统，是致病菌战胜宿主非特异性防御机制，进而在宿主体内繁殖的关键。

在铁限制的环境中，绝大多数致病菌已经进化出一套非常精密的方法来获取铁离子，即产生特殊的铁螯合剂——铁载体。

遗传检测显示铁获取机制在细菌基因组中占据很重要的地位，进一步说明铁获取机制的重要性。

致病菌中铁摄取系统由功能上高度相关的不同种分子构成。

铁载体即是一种铁结合分子，包括分枝杆菌中的mycobactin和exochelin、李斯特单核杆菌中的TF样分子以及革兰氏阴性菌中的enterobactin[6]。

摄取系统还包括铁载体受体和细菌外膜上ATP依赖的铁载体受体蛋白（siderophore receptor protein，SRP）。

SRP在细菌铁离子摄取机制中起着至关重要的作用，是细菌重要的毒力因子和潜在的疫苗靶分子。

目前国内外关于鸭疫里默氏杆菌SRP的研究尚未见报道，因此鸭疫里默氏杆菌SRP基因工程突变菌株的构建将有助于为鸭疫里默氏杆菌的毒力研究和防控开辟新的思路。

1 材料和方法1.1 菌株和载体血清2型RA GDGZ菌株、大肠杆菌SM10pir、大肠杆菌β2155、pDS132载体均由本实验室保存。

1.2 突变株构建引物的设计根据SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段以及氨苄抗性基因设计PCR扩增引物，引物序列如表1所示。

表1 突变株构建的引物设计Table1 Primer design of the mutant construction 引物序列Primer sequence左臂上游引物 5'-GCGGTCGACCGCTTTATTTTTGT TTGCAG-3'左臂延伸引物 5'-C C G C A A A A A A G G G A A T A A G G G C G A C A C G G A A A T G T T G A A T A C T C A T TAGTTAAATCTACATTAGGG-3'右臂下游引物 5'- GCGGTCGACGAAGCCCTAACTGA TAGATTGG-3'右臂延伸引物 5'-TAGACAGATCGCTGAGATAGGTG CCTCACTGATTAAGCATTGGTAAGCG GTTGGGGATAGGTTG-3'氨苄基因上游引物5'-GTAGGAGAAGCCAGTTGTATATTA ACCCTAATGTAGATTTAACTAATGAG TATTCAACATTTCCG-3'氨苄基因下游引物5'-TCATTAAAATATTATTTTCCATAA AACCAACCTATCCCCAACCGCTTACC AATGCTTAATCAGTG-3'引物名称Primer name1.3 RA基因组的提取基因组提取方法参考文献[7]进行。

1.4 RA△SRP突变株的构建14.1 SRP左、右臂基因片段及氨苄抗性基因的扩增用SRP左臂基因片段的上、下游引物扩增SRP左臂基因片段，SRP右臂基因片段的上、下游引物扩增SRP右臂基因片段，氨苄基因的上、下游引物扩增氨苄抗性基因。

PCR扩增体系：PreMixTaq 10 μL、GDGZ菌株基因组DNA 1 μL、上下游引物各1 μL，加灭菌水至50 μL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火1min，72℃延伸2 min，进行35个循环；循环结束后，72℃延伸10 min；4℃+∞。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果产物，并送上海生工测序。

1.4.2 △SRP基因片段的扩增 SRP左臂序列、SRP右臂序列和氨苄基因序列经测序正确后，以SRP左臂上游引物、SRP右臂下游引物和氨苄基因的引物用重叠延伸PCR（SOE-PCR）将左臂基因、右臂基因和氨苄抗性基因序列按左臂-AMP-右臂串联，构建ΔSRP基因片段，即为缺失SRP基因的基因片段。

SOE-PCR扩增体系：PreMixTaq 10 μL、左臂上游引物1 μL、右臂下游引物1 μL、氨苄基因上下游引物各1 μL、左臂基因片段1 μL、右臂基因片段1 μL、氨苄基因片段1 μL，加灭菌水至50 μL。

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，进行35个循环；循环结束后72℃延伸10 min；4℃+∞。

1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

1.4.3 pDS132::ΔSRP自杀性质粒的构建将自杀性质粒pDS132和ΔSRP基因片段分别用Sal Ⅰ酶切，并将酶切的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸化后，pDS132 2 μL、ΔSRP基因片段4 μL、T4 DNA连接酶1 μL、T4连接酶缓冲液1 μL，4℃连接16 h，得到pDS132::ΔSRP自杀性质粒，转化大肠杆菌SM10pir，菌落经PCR鉴定正确后，提取阳性克隆质粒酶切鉴定，用SalⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。