大鼠视神经切断后视网膜Muller细胞及小胶质细胞变化特点

大鼠视神经切断后视网膜Muller 细胞及小胶质细胞变化特点唐茂丹1），陈家波1），孙永芳1），童世琼1），武丽红2），吴春云2）（1）昆明医学院05级临床医学（眼视光学专业）；2）组织胚胎学教研室，云南昆明650031）［摘要］目的观察视网膜M uller 细胞和小胶质细胞在大鼠视神经切断后的变化特点．方法应用大鼠视神经完全横断模型，随机分为术后1d 、3d 、7d 、14d 4个损伤组和假手术组（每组n ＝5）；分别用M uller 细胞和小胶质细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶（GS ）和OX-42，进行免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP ）法染色，以显示视网膜M uller 细胞和小胶质细胞的变化．结果在视神经切断后，大鼠视网膜M uller 细胞GS 阳性产物立即增粗、深染，并与周围细胞紧密联系在一起，3d 达高峰，14d 明显减弱；小胶质细胞OX-42的阳性产物表达在视神经切断后7d 明显增强，14d 达高峰．结论视神经切断后大鼠视网膜M uller 细胞反应性增生，小胶质细胞被激活，但反应高峰晚于M uller 细胞，其作用有待进一步研究．［关键词］视神经切断；M uller 细胞；小胶质细胞；大鼠［中图分类号］R774；R779.12［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2010）01－0001－05Immunohist ochemical St udy of Muller Cells and Micr ogliaCells Responses t o Opt ic Ner ve Tr ansect ion in Rat sTANG Mao －dan 1），CHEN Jia －bo 1），SUN Yong －fang 1），TONG Shi －qiong 1），WU Li －hong 2），WU Chun －yun 2）（1）2005Year of Clinical Medicine （Ophthalmology and Optometry ）；2）Dept.of Histology andEmbryology ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan 650031，China ）［Abstract ］Objective To study features of the retinal M uller cells and microglia cells in rats after opticnerve transection ．Methods We built the optic nerve transection model which was randomly divided into five groups ：four injury groups （n ＝5in each group ：the 1，3，7，and 14day groups post optic nerve injury ），control group （n ＝5）．Then we observed the changes of M uller cells and glial cells which is immunohistochemically streptavidin-perosidase stainned by using anti-GS （glutamine synthetase ）and anti-OX-42antibody （amoeba-like glial cell line-specific marker ）．Results The expression of （GS ）-immunoreaction （GS-IR ）increased significantly compared to the control group ．The most significant change occurred in the 3-day group ．the expression of GS-IR had a descending tendency in the 7-day and 14-day groups compared to the 3-day group ．And immunoreaction of 0X-42increased significantly compared to the control group ，at day 7post-axotomy were markedly expressed ，and in 14day group reached the peak ．Conclusions Rat retinal M uller cells are reactive gliosis after optic nerve transection and have roles of protecting the retinal neurons and repairing the injury retina ；The response of microglial cell are the same as M uller cells basically with the exception昆明医学院学报2010，（1）：1～4Journal of Kunming Medical UniversityCN 53-1049/R［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30760093）［作者简介］唐茂丹（1985～），女，云南昆明市人，在读本科生，昆明医学院2005级临床医学（眼视光学专业）.［通讯作者］吴春云．E-mail:wuchunyunkm@第31卷昆明医学院学报2视神经损伤是临床上的常见多发病，常引起视力降低或丧失，严重影响病人的工作、生活和学习．由于中枢神经损伤或病理改变后神经元不易再生，许多机制还有待揭示，且在视神经损伤后会出现胶质细胞活化、增殖，一方面起着隔离、清洁、营养和支持等抗损伤作用，但另一方面胶质瘢痕的形成又阻碍了损伤后的修复以及神经元轴突再生，并能明显改变局部正常结构及神经元的生存环境，因此胶质细胞对神经元的作用具有利弊双重性[1]．为了探索视神经完全损伤后视网膜神经胶质细胞的变化及作用，为视神经、视网膜相关疾病的发病机制的研究提供新的思路．本实验将Muller 细胞的特异性标志物谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase ，GS ）和小胶质细胞的特异性标志物OX-42抗体，用免疫组织化学染色的方法对视网膜神经胶质细胞进行研究．1材料与方法1.1实验动物、分组健康成年雌性S-D 大鼠25只，体重（240±30）g ，购自昆明医学院实验动物供应中心．用随机数字法分为5组：假手术组、单纯性视神经横断术后1d 、3d 、7d 、14d 组，每组5只．1.2视神经切断模型制作用雷季良等[2]研制的视神经完全横断模型标准复制动物模型．1.3免疫组织化学样品制备及染色各组大鼠定时用30g/L 戊巴比妥钠（50mg/kg ）腹腔注射麻醉，并用4g/L 盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天制药株式会社）表面麻醉大鼠角膜，20g/L 多聚甲醛缓冲液灌注固定取眼球，进行石蜡包埋和连续切片，切片厚7μm ，每只大鼠切片间隔5片取2片，每只大鼠5张切片．用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase ，SP ）法染色进行免疫组织化学染色，一抗分别为兔抗GS （1:500）和鼠抗OX-42（1:400），4℃，24h ；生物素标记的二抗（羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG ，1:150，福州迈新公of peak of the response which is later than Muller cells ．and microglial cells with releasing inflammatory mediator and phagocytosis.［Key words ］Optic nerve transection ；Muller cells ；M icroglia cells ；Rats 司），室温30min ；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液（SP ，1:150，福州迈新公司），室温12min ；二氨基联苯胺（DAB ）显色，室温8min （避光进行），光镜观察染色情况．梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片．阴性对照用0.01mol/L 的PBS 代替一抗，其余步骤不变．2结果2.1GS 的免疫组织化学表达变化在假手术组大鼠视网膜上（见图1），M uller 细胞的特异性标记物GS 免疫阳性产物（棕色）显示出M uller 细胞的整体结构，细胞多呈细长状或丝状．它自外界膜（ELM ）纵向伸展，穿过整个视网膜至内界膜（ILM），其胞核位于内核层（INL ），几乎与视网膜内所有的神经元发生接触．视神经切断后1d 组（见图2），视网膜GS 阳性纤维立即增粗、深染，并与周围细胞紧密联系在一起．视神经切断后3d 组（见图3），GS 免疫的阳性产物在内丛状层（IPL ）表达增强，着色更加深和密集．虽然视神经切断后7d 组阳性纤维还呈丝条状贯穿于ILM 、ELM 之间，但是表达开始减弱，直至切断后14d 组（见图4），M uller 细胞特异性标记产物表达明显减弱，并在ILM 表面发现有少量阳性产物表达．2.2OX-42的免疫组织化学表达变化在假手术组的大鼠视网膜上（见图5），小胶质细胞特异性标志物OX-42免疫阳性产物（棕色）呈弱阳性表达，主要见于神经节细胞层（GCL ）、INL ，呈分支状，染色深．视神经切断后1d 组、3d 组，OX-42阳性产物少量表达在GCL 、INL 和外丛状层（OPL ）．但视神经切断后7d 组OX-42阳性产物表达明显增强，细胞呈卵圆形或阿米巴状（椭圆形），着色深，无突起，胞体明显增大，且数量增多．在视神经切断后14d 组小胶质细胞特异性标记产物表达达到高峰，可见视野下视网膜GCL 至ELM 之间有大量小胶质细胞浸润，阳性产物表达非常唐茂丹，等．大鼠视神经切断后视网膜M uller 细胞及小胶质细胞变化特点3第1期强，胞体肥大而深染（见图6）．图1假手术组，Muller 细胞的整体结构（SP ×200）Fig.1Cont r ol Gr oup ，t he st r uct ur e of Muller eclls（SP ×200）A ：内界膜；B ：视神经节细胞层；C ：内丛状层；D ：内核层；E ：外界膜.E-A-B-C-D -图3视神经切断后3d 组，GS 免疫阳性反应增强（SP ×200）Fig.3GS-IR immunor eact ivit y incr eased in t he in-ner plexifor m layer 3days aft er opt ic ner ve t r ansect ion （SP ×200）图5假手术组，OX-42免疫阳性反应呈弱阳性表达，甲基绿复染（SP ×200）Fig.5Cont r ol Gr oup ，OX-42immunor eact ivit y wasweakly posit ive expr ession Met hyl gr een-st a -ined （SP ×200）图6视神经切断后14d 组，OX-42阳性，甲基绿复染（SP ×200）Fig.6OX-42immunor eact ivit y dist r ibut ed in t heganglion cell layer and ext er nal limit ing membr ane Met hyl gr een-st ained 14daysaft er opt ic ner ve t r ansect ion （SP ×200）图2视神经切断后1d 组，GS 免疫阳性反应增强（SP ×200）Fig.2GS-IR immunor eact ivit y incr eased in inner n-uclear layer 1day aft er opt icner ue t r ansec-t ion （SP ×200）内核层显示细胞核表达增强、深染（箭头示）.→图4视神经切断后14d 组，GS 免疫阳性反应减弱（SP ×200）Fig.4GS-IR immunor eact ivit y decr eased 14daysaft er opt ic ner ve t r ansect ion （SP ×200）ILM 表面发现有少量阳性产物表达.3讨论在脊椎动物的视网膜中主要有3种不同的神经胶质细胞：Muller 细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞[3]．M uller细胞的分布则是从外界膜到内界膜，其突起与各种神经元密切接触，并且形成视网膜内毛细血管的基底膜．本研究中发现，Muller细胞的阳性纤维产物从GCL开始表达到在ILM、ELM之间都存在，其突起与各种神经元密切接触，并有少许产物在视网膜ILM表面表达．这可能提示了新近的一些研究，Muller细胞是可以作为一种潜在的细胞来源来修复死亡的神经元[4，5]．M uller细胞的功能目前尚未完全了解，以往人们认为Muller细胞主要在视网膜中起支持和营养作用，如保持视网膜的完整性，对神经元起支架作用，储存大量的糖原，为神经元提供能量等．但是随着对胶质细胞研究的深入，人们发现Muller 细胞具有更深刻的生理功能和病理意义[6]．有研究表明，M uller细胞外谷氨酸浓度升高是导致神经元死亡的一个重要原因．在视网膜中Muller细胞表达高亲和力的谷氨酸转运体，将细胞外高浓度的谷氨酸转运至细胞内，并通过谷氨酰胺合成酶（GS）将其转化为谷氨酰胺，消除高浓度的谷氨酸对神经元的毒性作用[7]，从而减轻对视网膜的毒性．同时M uller细胞还可合成谷胱甘肽，消除自由基对神经元的损伤作用[8]．在本研究中，视神经切断后1d组GS阳性纤维产物表达就增强，在视神经切断后3d组GS免疫阳性产物表达达到高峰，着色深，排列更加密集．这可能提示其能合成和分泌多种细胞因子与神经营养因子，通过GS 将其转化为谷氨酰胺，消除高浓度的谷氨酸对神经元的毒性作用并减轻自由基对神经元的损伤作用，从而对视网膜神经元起到保护作用．视神经切断后14d组，M uller细胞特异性标志物减弱，而在视神经切断后7d组、14d组小胶质细胞OX-42免疫阳性产物表达才增强，这也许跟Harada[9]和Walsh[10]等研究的，“小胶质细胞-M uller细胞”、“胶质细胞-光感受器”网络在视网膜退变过程中充当了营养因子控制系统，并参与了相关的免疫调节．小胶质细胞占胶质细胞总数的20％，常位于血管附近，是胶质细胞中最小的一种，被认为是正常中枢神经系统中最有代表性的免疫细胞[11]．它对胚胎视网膜的正常发育十分重要，具有支持、营养、保护和修复等作用[12]．在发育过程中，一些神经细胞的功能衰退、凋亡，视网膜内的小胶质细胞被激活以清除细胞碎片．在视网膜发育成熟后，神经细胞数目处于稳定状态，这时小胶质细胞分化为高度分支的静息状态，以确保视网膜的健康[1]．以上说明，小胶质细胞的形态具有可塑性，在静止状态为分支状;接受损伤信号刺激后细胞体积增大，数量增多，呈阿米巴型，快速的应答视网膜各种损伤变化，利于维护视网膜的结构和功能．所以可以根据细胞形态的改变协助判断小胶质细胞是否处有激活状态[13]．本研究发现视神经切断后，视网膜中有肥大或阿米巴状的小胶质细胞出现，且数量逐渐增多，证明小胶质细胞被激活后形态发生改变，转化为具有吞噬功能的细胞．小胶质细胞反映高峰略晚于M uller细胞可能提示当随着时间的推移，Muller细胞对神经元的保护作用减弱，一些神经元毒性因子的释放使得视锥、视杆细胞变性，导致神经节细胞死亡从而激活小胶质细胞，使它清除细胞的碎片．这些细胞碎片可能来自衰退的M uller细胞，变性后的视锥、视杆细胞，神经节细胞．同时，小胶质细胞在被激活的过程中可能释放一些炎性因子，加速视网膜神经细胞的变性和坏死．据研究要成功的治疗视神经损伤，最关键的一步就是要挽救损伤视网膜神经节细胞的存活，这样就必须诱导存活的视网膜节细胞轴突再生，让一个突触重建和重塑，使得视网膜可以和正确的中枢靶区建立联系，恢复正确的视路拓扑投射．因此，深入研究小胶质细胞和Muller细胞的机能活动，对视神经、视网膜相关疾病的防治有着非常重要的意义．通过以上对Muller细胞和小胶质细胞的免疫化学组织观察，提示：（1）视神经切断后大鼠视网膜Muller细胞反应性增生，对视网膜神经元可能起保护作用，并参与视网膜损伤后的修复；（2）视神经切断后小胶质细胞被激活，但反应高峰晚于Muller细胞．激活的小胶质细胞一方面释放炎性因子，可能加速视网膜神经细胞的变性和坏死；另一方面又继续清除细胞死亡后留下的细胞碎片．［参考文献］［1］廖宇，刘金华．胶质细胞与视神经损伤［J］．医学综述，2008，7（l4）：967－969.［2］雷季良，陈白羽，栾丽菊．视神经损伤动物模型的建（下转第18页）Semin Neonatal ，2001，6（2）：121－133.［2］M ARRET S ，M UKENDI R ，GADISSEUX J F ，et al ．Ef-fect of ibotenate on brain development:an excitotoxic mouse model of microgyria and posthypoxic-like lesions ［J ］．J Neuropathol Exp Neurol ，1995，54（3）：358－370.［3］OLNEY J W ．Excitotoxicity apoptosis and neuropsychi-atric disorders ［J ］．Curr Opin Pharmacol ，2003，3（1）：101－109.［4］ROGIDO M ，HUSSON I ，BONNIER C ，et al ．Fructose-1,6-biphosphate prevents excitotoxic neuronal cell death in the neonatal mouse brain ［J ］．Brain 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