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体内药物分析(2)
生物样品的前处理方法
(一)去除蛋白质
在测定血样时，首先应去除蛋白质。
去除蛋白质可使结合型的药物游离出来，以便测定药物的总浓度;去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能(如保护HPLC柱不被沾污)，延长使用期限。
去除蛋白法有以下几种。
1.加入与水相混溶的有机溶剂
可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。
常用的水溶性有机溶
剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
2.加入中性盐
使溶液的离子强度发生变化。
中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。
常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。
体内药物分析实验体内药物分析实验是一项非常重要的技术，它可以帮助研究人员了解药物在动物或人体内的代谢动力学和药物毒性，这对于药物的研发和使用都有非常重要的意义。
在本文中，我们将对体内药物分析实验进行详细的介绍，包括实验的原理、方法和应用等方面。
一、实验原理体内药物分析实验的原理是通过对药物在动物或人体内的代谢动力学和药物毒性进行分析，了解药物在体内的作用机制和性质。
通常，实验分析的对象是药物在动物或人体中的含量、代谢产物及毒性反应等，这些分析结果可以帮助研究人员判断药物是否安全和有效，从而指导其研发和使用。
二、实验方法体内药物分析实验是一个复杂的过程，需要涉及各种实验方法，下面我们将对这些方法进行介绍：1. 动物模型的制备在体内药物分析实验中，研究人员首先需要选择一个适当的动物模型，并对其进行制备。
动物模型可以是小鼠、大鼠、猪、狗甚至人类等，不同的模型在药物代谢和毒性方面具有不同的特点，因此需要选择合适的模型来进行研究。
同时，为了保证实验结果的可靠性，研究人员还需要对动物进行控制，包括饲养、喂食、运动、病理等方面的控制。
2. 药物给药药物给药是体内药物分析实验的关键步骤，研究人员需要确定合适的剂量和给药方式。
给药方式通常有静脉注射、腹腔注射、口服、皮下注射等。
药物的剂量需要根据动物体重和药物的药动学特性来确定。
3. 体内药物分析在药物给药后，研究人员需要采集动物的生物样本，如血液、尿液、粪便等，对其中的药物代谢产物等指标进行分析。
分析方法可以是生化分析、药物浓度测定、毒性指标检测等。
4. 数据处理和统计分析实验结束后，研究人员需要对采集的数据进行处理和统计分析，包括平均值、标准差、方差等的计算和统计推断。
三、实验应用体内药物分析实验的应用非常广泛，主要包括以下方面：1. 药物代谢动力学研究通过体内药物分析实验，研究人员可以了解药物在动物或人体内的代谢过程和代谢产物，从而对其药物动力学特性进行研究和评价。
体内药物分析中的样品预处理技术体内药物分析是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢产物或内源性生物活性物质的定量分析。
通常药物进入体内后，其化学结构与存在状态就可能发生显著变化。
在体液中，药物的存在形式多样化，除游离型的原料药物或其代谢物，也有原形药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等内源性小分子经共价结合的结合物（或缀合物），还有与蛋白质分子经氢键及其他分子间力结合的结合型药物；而且药物及其代谢物的浓度通常很低、干扰物质多。
因此，在测定时，除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理，从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境和条件。
常用的样品前处理方法有：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集及微波萃取和微透析技术等。
一、体内样品种类：体内药物分析采用的体内样品包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。
这些大都具有：①采样量少；②待测物浓度低；③干扰物质多的特点。
二、体内样品预处理的目的：⑴使待测药物游离，以便测定药物或代谢物的总浓度；⑵满足测量方法的要求，纯化浓集样品；⑶保护仪器性能、改善分析环境。
三、常用生物样品预处理技术：⒈有机破坏法：湿法破坏：电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化法干法破坏：高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法氧瓶燃烧法⒉去蛋白质法：溶剂解法（加入与水相混溶的有机溶剂）、加入中性盐、加入强酸、加入含锌盐或铜盐的沉淀剂、超滤法、酶水解法、加热法⒊分离、纯化和浓集法：液﹣液萃取法、固相萃取法⒋缀水物的水解法：酸水解法、酶水解法⒌化学衍生化发：硅烷化、酰化、烷基化、紫外衍生化、荧光衍生化、点化学衍生化、生成非对映异构体衍生化发四、新兴生物样品预处理技术：⒈微波消解⒉自动化固相萃取⒊固相微萃取⒋液相微萃取⒌微透析技术⒍超临界流体萃取⒎分子印迹固相萃取这里就固相微萃取技术和超临界流体萃取技术进行简单说明：⑴固相微萃取固相微萃取( Solid phase micro2-extraction,SPME) 是80年代末发展起来的样品预处理方法, 其装置简单, 操作方便, 已实现自动控制, 适用于现场分析。
2012年1月内蒙古科技与经济Januar y 2012 第2期总第252期Inner Mongolia Science T echnology &Economy No .2Total No .252体内药物分析测定前样品的处理以及测定的基本程序X侯海玲,郭宝凤(内蒙古医学院,内蒙古呼和浩特 010059) 摘 要:本文综述了体内药物分析测定前样品的处理方法选择的一般原则、预处理的一般方法和预处理新技术的应用进展,以及体内药物分析测定的基本程序和分析技术,为体内药物的分析提供依据。
关键词:体内药物分析;预处理;基本程序 中图分类号:T Q 460.7+2 文献标识码:A 文章编号:1007—6921(2012)02—0125—02 体内药物分析是指通过采用不同的分析技术,对体内不同体液和组织的药物进行分离和分析,从分子、细胞水平来探索药物的体内动力学过程、药效学和毒理学机制[1]。
1 体内药物分析测定前样品的处理1.1 体内药物分析测定前样品处理方法选择的一般原则[2]生物样品的前处理方法涉及许多方面,但主要应考虑生物样品的种类、被测定药物的性质、浓度和所采用的测定方法等三方面的问题。
1.2 体内药物分析测定前样品的处理方法1.2.1 蛋白质的去除[2]。
蛋白质的去除方法包括加入与水混溶的有机溶剂、加入沉淀剂、酶解法等。
1.2.2 有机破坏[3]。
生物样品中的金属离子常与蛋白结合且难用溶剂萃取,所以当测定生物样品中的金属离子时,多采用有机破坏的方法进行前处理。
1.2.3 分离、纯化与浓集。
对于浓度较高的样品,或检测方法基于足够的灵敏度时,生物药品在经过去除蛋白质或缀合物等前处理步骤后即可直接用于测定。
但当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时,生物样品需进行分离、纯化与浓集处理[3]。
萃取法是应用最多的分离、纯化方法。
萃取法包括液-液萃取法(LLE)和固相萃取法(SP E)。
其中,LLE 的优点在于它的选择性,这是依赖于有机溶剂的选择;其缺点在于乳化现象的产生[4]。
2012年1月内蒙古科技与经济Januar y2012 第2期总第252期Inner M o ngo lia Science T echnolo gy&Economy N o.2T o tal N o.252体内药物分析测定前样品的处理以及测定的基本程序X侯海玲,郭宝凤(内蒙古医学院,内蒙古呼和浩特 010059) 摘 要:本文综述了体内药物分析测定前样品的处理方法选择的一般原则、预处理的一般方法和预处理新技术的应用进展,以及体内药物分析测定的基本程序和分析技术,为体内药物的分析提供依据。
关键词:体内药物分析;预处理;基本程序 中图分类号:T Q460.7+2 文献标识码:A 文章编号:1007—6921(2012)02—0125—02 体内药物分析是指通过采用不同的分析技术,对体内不同体液和组织的药物进行分离和分析,从分子、细胞水平来探索药物的体内动力学过程、药效学和毒理学机制[1]。
1 体内药物分析测定前样品的处理1.1 体内药物分析测定前样品处理方法选择的一般原则[2]生物样品的前处理方法涉及许多方面,但主要应考虑生物样品的种类、被测定药物的性质、浓度和所采用的测定方法等三方面的问题。
1.2 体内药物分析测定前样品的处理方法1.2.1 蛋白质的去除[2]。
蛋白质的去除方法包括加入与水混溶的有机溶剂、加入沉淀剂、酶解法等。
1.2.2 有机破坏[3]。
生物样品中的金属离子常与蛋白结合且难用溶剂萃取,所以当测定生物样品中的金属离子时,多采用有机破坏的方法进行前处理。
1.2.3 分离、纯化与浓集。
对于浓度较高的样品,或检测方法基于足够的灵敏度时,生物药品在经过去除蛋白质或缀合物等前处理步骤后即可直接用于测定。
但当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时,生物样品需进行分离、纯化与浓集处理[3]。
萃取法是应用最多的分离、纯化方法。
萃取法包括液-液萃取法(LL E)和固相萃取法(SP E)。
其中, L LE的优点在于它的选择性,这是依赖于有机溶剂的选择;其缺点在于乳化现象的产生[4]。
SP E是将待测样品加入一根常压色谱柱中,然后用不同强度的溶剂洗脱,以达到纯化样品的目的。
SP E的填料种类繁多,其中以聚合物应用更广[5]。
样品在萃取过程中,虽然被测组分得到了纯化,但因微量的组分分布在较大体积的萃取溶剂中,萃取往往还不能直接供分使用。
因此,常需要使被测组分浓集后再测定[3]。
1.3 体内药物分析测定前样品的先进预处理技术近年来,采用固相微萃取技术及超临界流体萃取技术处理生物样品具有快速简便,选择性好、回收率高、无需使用大量有机溶剂等优点,因此成为当今体内药物分析中最有发展潜力的两种样品预处理技术[6]。
1.3.1 固相微萃取技术。
传统的液-液提取、固相提取方法均较复杂、费时且选择性差[7]。
20世纪90年代初产生的固相微萃取(SPM E)技术是较佳的样品预处理方法,其装置简单,操作方便,已实现自动控制,适用于现场分析。
它用一个类似于气相色谱微量进样器的萃取装置,从样品中萃取出待测物质,并直接与气相色谱(GC)或高效液相色谱(HP L C)联用,在进样口(GC即为气化室)将萃取的组分解吸附后进行色谱分离检测[6]。
1.3.2 超临界流体萃取技术。
超临界流体(SF)是指温度与压力均在其临界点之上的流体。
在研究过的超临界流体体系中,CO2因其价廉无毒,应用最为广泛。
超临界流体具有很高的溶解能力和良好的流动、传递性能,可代替传统的有毒、易挥发、易燃的有机溶剂[8]。
2 体内药物分析测定的基本程序生物样品的分析过程包括采样、样本贮存、样本制备、待测物的分离和鉴别以及最后的定量分析[9]。
2.1 样品的采集2.1.1 样品的种类。
常用的样品的种类包括血样,唾液和尿液。
血样是指全血、血浆或血清,一般情况下血浆分离快、易得,故最常用。
唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺及口腔黏膜内腺体分泌的。
尿药浓度测定主要用于剂量回收、药物代谢和生物利用度等研究[10]。
2.1.2 样品的采集方法。
目前的采集样品多为血液和尿液。
为了采集到各部位有价值的数据,所用方法有室灌流法、灌流引流法、皮层造室灌流法等,但是这些方法有一个共同的缺点,就是对组织和器官有明显的损伤,并需在麻醉的状态下试验[11]。
近年来,出现微透析法采集样品,微透析可应用于任何组织和器官,对组织无明显的伤害,可以研究在非麻醉状态下动物体内各种微环境的变化[12]。
2.2 样品的贮藏血样、唾液取样后最好立即进行分析,如不能立即测定时,短期保存时可置冰箱(4℃)、长期保存时需在-20℃或-80℃冷藏。
注意全血未经分离时,不宜直接冷藏保存[13]。
尿液若需收集24小时或更长时间的样品或不能立即测定的,应加入防腐剂后置冰箱中冷藏保存[3]。
2.3 样品的制备,即样品的预处理除少数体液经简单处理后直接测定外,通常在最后测定前要采取适当的样品制备,即进行分离、纯・125・X收稿日期:2011-11-26 总第252期 内蒙古科技与经济化、浓集三步,必要时尚需对待测组分进行化学改性,为测定创造良好条件。
样品的预处理是体内药物分析中最复杂最繁琐也是最重要的一步,目的主要是排除干扰,提高分析灵敏度[14]。
2.4 定量分析体内药物的定量分析需要选择高灵敏度、高选择性的分析方法。
2.4.1 色谱分析法。
近年来,色谱技术不断发展和完善,使得对复杂生物样品中药物及其代谢物的测定变得更加准确、快速和简便[15]。
其中以高效液相色谱法(HP L C)[16]、气相色谱法(GC)最常用,新型色谱技术有手性色谱[17]、胶体色谱[18]、分子生物色谱(MBC)[18]等。
2.4.2 色谱联用技术。
色谱是分析体内药物的重要手段,但通常的检测器往往只能得到非常有限的分子结构信息。
所以近年来,色谱联用已经得到深入研究。
常用的色谱联用技术包括:液相色谱—核磁共振联用技术(HPL C-NMR)[19]、液相色谱-质谱联用技(L C-M S)[20]、气相色谱-质谱联用技术(GC -M S)[21]等。
2.4.3 免疫分析法。
免疫分析法分为放射免疫分析(RIA)[22]、酶免疫分析法(EIA)[23]、化学发光免疫分析(CL EIA)[24]、荧光免疫分析(F IA)[25]等。
免疫分析法与色谱法相比,在快速和简单操作方面具有优势,适合于自动化;免疫分析法特别适用于色谱法难以分析的药物。
但是,免疫分析法也有其不足之处。
首先,免疫分析法的灵敏度和选择性不及色谱技术。
其次,选用免疫分析法同时测定几个药物时,必需分别单独测定每一个药物,而与之相比,色谱法可同时测定样品中的几个药物[26]。
3 展望近年来体内药物分析发展迅速,各种新方法、新技术的联合使用使得从样品的采集、处理、分离到检测完全自动化成为了现实,LC-MS、L C-NM R、L C-NM R等的联合正深刻改变并推动着体内药物分析的发展,采集样品的无损化、微量化、获得信息的高通量化、在线化,试剂消耗的低量化,已成为今后体内药物分析发展的新方向,体内药物分析将受到越来越多的关注与重视。
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