壳聚糖酶生产菌筛选鉴定及其酶学性质

产壳聚糖酶海洋真菌鉴定、寡营养培养基优化及廉价培养基研究朱利平;黄惠莉【摘要】A chitosanase-producing marine strain was isolated by our laboratory. Identification by rDNA - ITS sequence analysis, and it is Penicillium oxalicum. This is the first time that Penicillium oxalicum＇ s the ability of producing chitosanase is reported. For the purpose of fermentation chitosanase in industrial, we studied oligotrophic medium components, such as source of carbon, nitrogen source, saltresistance, acidresistance and rotary speed. We explored different kinds of cheap medium for production of chitosanase. We found the soybean powder was the best, and the medium of soybean powder was as follow （g/L seawater）： soybean powder 25 g, and the optimal enzyme activity was 8.5 U/mL. This medium was insufficient 5% of the cost of original. It provided direct theory and experiment foundation on industrialized production of chitosanase.%对筛选出的产壳聚糖酶海洋真菌进行了rDNA—ITS序列分析技术鉴定，确定该菌为Penicillium oxalitun，这是首次报道该菌属具有产壳聚糖酶的能力。

微生物壳聚糖酶的研究进展及应用现状几丁质（chitin）又名甲壳素、甲壳质，是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4-糖苷键相连而成，是地球上仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。

壳聚糖(chitosan)为几丁质脱乙酰化后的产物,是一种阳离子型多糖，也是目前唯一的商品化碱性多糖。

壳聚糖是一种高分子阳离子絮凝剂，由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等优良特性，在医药卫生、农业等方面得到广泛的应用。

如可作为离子交换剂，毛发固定剂、保湿剂和柔软剂，药物缓释剂、增溶剂，饲料添加剂，种子处理剂等。

但是壳聚糖的分子量大，水溶性较差，在人体内不易吸收，使其应用受到限制。

而壳聚糖的降解产物壳寡聚糖（Chitooligosaccharides）不仅具有水溶性好、易吸收等优点，近年来更是发现，低分子量壳寡聚糖（如五糖、六糖）具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，使其在医药领域有着广泛的应用前景。

壳寡糖的制备大多数是以虾、蟹等为原料，经过脱乙酰基等处理得到壳聚糖，再进一步水解得到壳寡糖。

目前，由壳聚糖制备壳寡糖主要有两种水解方法：酸解法和酶解法。

酸解法一般是用盐酸部分水解壳聚糖，用甲醇除去水解液中产生的大量单糖，经加Dowex离子交换树脂分离得到壳寡糖。

酸水解法的缺点是反应产物单糖较多，而壳寡糖含量低，反应条件苛刻，工艺烦琐，同时这一工艺由于产生大量废弃酸液，易给环境造成污染。

酶解法是指采用酶制剂在较温和的条件下降解壳聚糖。

一般分为两类：非专一性水解酶和专一性水解酶。

非专一性酶工艺，是利用如脂肪酶、溶菌酶等壳聚糖非专一性水解酶，降解壳聚糖。

但降解程度有限，而且产物复杂，不易分离，酶量使用大。

专一性水解酶是利用以壳聚糖为专一性底物的壳聚糖酶，专一性水解壳聚糖，该反应条件温和，可通过反应时间控制水解产物，为大规模生产壳寡糖提供了可能，是一种较为理想的壳寡糖制备方法。

壳聚糖酶（Chitosanase,EC.3.2.1.132）是催化壳聚糖降解的专一性酶。

青岛科技大学硕士学位论文木聚糖酶产生菌的筛选、酶学性质及宏基因组文库的构建与筛选姓名：郭清吉申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：石琰璟20080614青岛科技大学研究生学位论文木聚糖酶产生菌的筛选、酶学性质及宏基因组文库的构建与筛选摘要木聚糖酶可以水解木聚糖为低聚木糖和Ｄ．木糖，它在饲料、纸浆造纸、食品、纺织等方面有着广阔的应用前景。

本文综述了木聚糖酶的性质、研究进展及应用等，研究了木聚糖酶产生菌的筛选鉴定、产酶条件优化、酶学性质及宏基因组文库的构建与筛选，以丰富木聚糖酶的产酶菌种，提高产量，为其工业应用提供依据。

本研究采用透明圈法从云南腾冲温泉出水口土壤样品中筛选并纯化得到了１２株木聚糖酶的产生菌。

再通过摇瓶发酵，用３，５一二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法对每株菌的酶活力进行了测定，其中菌株Ｘｙｌａｎ一１２的酶活最大，达到６８．６７删ｍＬ。

通过１６ＳｒＤＮＡ序列相似性分析鉴定菌株Ｘｙｌａｎ一１２为Ｂ口ｃｆ，协．加Ⅷ砌ＰＭ螂。

为提高酶活力进行了一系列培养基及培养条件的优化实验，确定菌株Ｂ以ｃｆ胍加ｖＤ砌ｅ堋“ｓ产木聚糖酶的最适碳源是半纤维素＋麸皮的复合碳源，最适氮源是（ＮＨ４）２Ｓ０４，最佳产酶时间是发酵７２ｈ，培养基最佳初始ｐＨ为７．Ｏ。

最佳培养基为（∥Ｌ）：半纤维素６，麸皮４，（ＮＨ４）２Ｓ０４Ｏ．５，Ｋ２ＨＰ０４１．０，ＭｇＳ０４・７Ｈ２０Ｏ．３，ＣａＣｌ２・２Ｈ２０Ｏ．２，Ｋ２Ｓ０４Ｏ．１，ＮａＣｌＯ．２，Ｔｗｅｅｎ．８０Ｏ．１％，ｐＨ７．０。

经优化Ｘｙｌａｎ—１２的酶活力提高了２１．４％。

对曰口ｃｉ刀“ｓ加ｖＤ砌绷淞产木聚糖酶的酶学性质进行了研究，改变木聚糖酶作用时的温度和ｐＨ值，确定该酶的最适值及其耐受性。

研究表明，召以ｃｆ批触阳砌Ｐ删“ｓ产木聚糖酶的最适反应温度是６５℃，最适反应ｐＨ是６．Ｏ：该酶的热稳定性非常好，在８０℃保温时，残余酶活力也有近７０％，这种在高温稳定的特性利于工业生产的应用；该酶在ｐＨ７．０时酸碱稳定性最好，其ｐＨ稳定性范围较宽。

一株产木聚糖酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化【摘要】本研究旨在筛选和鉴定一株产木聚糖酶的菌株，并优化其产酶条件。

首先采用特定方法筛选出目标菌株，然后利用鉴定技术确认其身份。

接着通过优化产酶条件，包括培养基成分、温度、pH值等因素，最大化提高木聚糖酶的产量。

通过酶活测定和条件优化结果的比对分析，可以评估产酶效果并得出结论。

本研究结果有望为生物制药和生物质转化领域提供具有潜在应用前景的菌株和技术支持。

未来的研究可以进一步探讨优化条件对酶活性的影响，并拓展该菌株在其他领域的应用前景。

【关键词】产木聚糖酶菌株、筛选、鉴定、产酶条件优化、酶活测定、效果分析、成果总结、未来展望。

1. 引言1.1 研究背景目前，虽然已经有许多研究报道了不同菌株的木聚糖酶产生情况，但是为了提高木聚糖酶的产量和活性，仍然需要进一步深入研究。

通过筛选与优化得到高效的产木聚糖酶菌株，并确定最佳的产酶条件，对于提高木聚糖降解效率和生物质资源的利用率具有重要意义。

本研究旨在针对一株潜在的产木聚糖酶菌株进行鉴定和产酶条件优化，为木聚糖酶的应用和产业化提供理论基础和实验支持。

1.2 研究意义产木聚糖酶（xylanase）是一种能够降解木质纤维素中木聚糖的酶类，具有在生物质资源转化、饲料添加剂、食品工业等领域广泛应用的潜力。

随着全球对可再生能源和绿色化工的需求不断增长，发掘和利用高效产木聚糖酶的菌株成为研究的热点。

筛选出高产木聚糖酶的菌株并优化其产酶条件，不仅可以提高木聚糖酶的产量和活性，同时也可以降低生产成本，推动相关产业的发展。

1.3 研究目的研究目的：本研究旨在筛选出一株产木聚糖酶活性较高的菌株，并通过鉴定和优化产酶条件，提高其木聚糖酶产量。

通过对产酶条件进行优化，探索最适合该菌株生长和酶活性表达的环境参数，为提高木聚糖酶的产量提供理论依据。

本研究旨在分析优化后的产酶条件对木聚糖酶酶活的影响，评价优化效果，为进一步应用该菌株生产木聚糖酶提供参考。

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究韩宝芹,杨菊林,刘万顺,郝日光(中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)摘　要:　以本实验室分离的产壳聚糖酶YJ02菌株出发,制备壳聚糖酶发酵液,经离心、(N H 4)2SO 4分级盐析、Q -Sepharose F ast Flow 阴离子交换、Sephacry S -100凝胶过滤分离纯化步骤,SDS -PAG E 显示为一条带,壳聚糖酶纯化了28.9倍,收率为47.6%。

该酶的性质研究表明,该酶的分子量为66.2K D ,最适反应温度为50℃,最适反应pH 为6.0;M n 2+对酶活力有明显的促进作用,Cu 2+,Fe 3+,Hg 2+对酶活力有抑制作用;小分子有机物ED TA 和SDS 对酶活力有抑制作用,而IAA 和β-巯基乙醇对酶活力稍有促进作用。

该壳聚糖酶对高脱乙酰度壳聚糖底物水解作用强,酶解位点可能为N Glc -NG lc ,酶最大反应速度V max =4.1μmol /min ,常数K m 为64mmol /L 。

此壳聚糖酶水解壳聚糖制备的壳寡糖数均分子量为2400Da 。

关键词:　壳聚糖酶;分离纯化;酶学性质;壳寡糖中图法分类号:　Q 503 文献标识码:　A 文章编号:　1672-5174(2006)02-255-06 壳聚糖是由2-氨基-D -葡萄糖(GlcN )和2-乙酰氨基-D -葡萄糖(GlcNAc )通过β-1,4糖苷键连接而成的天然高分子多糖。

由于其相对分子量大,分子内强大的氢键引力,壳聚糖不溶于水,在人体内不易被吸收,从而使其应用受到限制。

壳聚糖酶(Chitosanase ,EC 3.2.1.132)是一类能水解壳聚糖的水解酶,广泛存在于一些真菌、放线菌、细菌中,在植物、病毒中也发现有此酶的存在[1-4]。

壳聚糖经酶水解可形成壳寡糖,具有抑制细菌和真菌生长,调节机体免疫和抗肿瘤等功能[5-7]。

由酶法水解壳聚糖制备壳寡糖反应条件温和,生产工艺无污染,产品质量好,受到食品、化学工业、生物医学等领域的青睐。

Penicillium oxalicum论文：草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）产壳聚糖酶发酵条件及酶性质研究【中文摘要】本研究针对目前国内所报道的壳聚糖酶的酶活力普遍偏低、真正产酶量大且适用于工业化大规模生产的菌种很少、商品壳聚糖酶价格居高不下的问题,以得到具有工业化潜在应用价值的酶源为目标,开发海洋微生物资源,获取新颖的产壳聚糖酶的海洋真菌一株,对该菌所产壳聚糖酶进行了发酵条件、酶的纯化和酶学性质等方面的研究,为大规模微生物产壳聚糖酶的生产及其应用提供实验依据;具有很好的理论研究价值和实用意义。

通过研究得到如下实验结果:⑴通过菌落的形态观察、电子显微镜观察和rDNA-ITS相结合的现代分子生物学方法等多项指标进行鉴定为:草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）,标记为:Penicillium oxalicum PCS-7。

这是首次发现该菌具有产壳聚糖酶的能力。

⑵对发酵产酶培养基进行优化:①采用寡营养培养基（蛋白胨9 g,葡萄糖10 g,壳寡糖10 g,pH 7.2,海水）进行发酵研究,发现Penicillium oxalicum在改良后的寡营养培养基中的生长量和产酶量基本不受营养条件贫瘠的影响;研究表明该菌发酵产酶所需培养基中可以直接利用海水而不必添加额外的无机盐成分,这样可以省掉在培养基中添加无机盐,同时可以减少发酵时所需的淡水消耗量,降低发酵培养基成本。

②本研究进一步尝试多种廉价原料进行发酵产酶实验,结果表明:采用培养基成分（g/L）:黄豆粉25 g,壳寡糖14 g,海水,pH值自然;在温度为25℃、摇床转速为150rpm条件下,培养4 d,酶活力达到最大值为8.5 U/mL。

本研究显示:可以利用黄豆粉海水培养基进行发酵产壳聚糖酶,该培养基的成本不足原发酵培养基的5%,大大降低了壳聚糖酶产生菌培养基的成本。

⑶壳聚糖酶的纯化研究中发现,Penicillium oxalicum在采用黄豆粉培养基进行发酵的过程中,分泌胞外壳聚糖酶。

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究作者：袁建平侯晓强来源：《湖北农业科学》2013年第15期摘要：利用芽孢杆菌（Bacillus sp.）Yg菌株发酵产壳聚糖酶，采用分段醇析法分离纯化发酵产物，通过不连续SDS-PAGE法测定壳聚糖酶相对分子质量。

结果表明，发酵产物先用体积分数40%的乙醇初步醇析，离心去除沉淀，而后加乙醇至体积分数为60%再次醇析，所得沉淀冷冻干燥即为壳聚糖酶，所得酶的回收率和纯度均较高。

所得壳聚糖酶的相对分子质量约为41.7 ku，最适反应温度为45 ℃，最佳反应pH为5.5。

该酶在4 ℃条件下保存稳定性较好，在65 ℃及以上温度下短时间内即全部失活。

关键词：壳聚糖酶；发酵；纯化；酶活力；稳定性中图分类号：TQ925+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3647-03壳寡糖为壳聚糖降解产物，具有水溶性好、易吸收、无毒、无变异性的特性，具有很高的生物活性，应用领域广泛[1，2]。

壳聚糖酶是专一性水解壳聚糖生成壳寡糖的酶，壳聚糖酶水解法是目前制备壳寡糖的最佳方法[3]。

我国目前还没有自主研发的壳聚糖酶制品，壳聚糖酶的研究与开发利用已成为我国壳寡糖生产和应用的关键与瓶颈。

本研究利用前期自行分离获得的产壳聚糖酶芽孢杆菌（Bacillus sp.）Yg菌株发酵产壳聚糖酶，对产物进行分离、纯化，并对壳聚糖酶的相关性质进行了研究。

1 材料与方法1.1 材料芽孢杆菌Yg菌株由廊坊师范学院生命科学学院提供。

壳聚糖（脱乙酰度>80%，国药集团化学试剂有限公司）。

Marker：MBP-[3-galactosidase（175 ku）、MBP-CBD（62 ku）、Triosephosphate isomerase（32.5 ku）、β-Lactoglobulin A（25 ku）。

丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、β-巯基乙醇、溴酚蓝、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250、无水乙醇、冰醋酸均为分析纯。

刘进杰ꎬ吕娟娟ꎬ陈国忠ꎬ等.莫海威芽孢杆菌产壳聚糖酶的分离纯化及酶学性质分析[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１９ꎬ４７(１４):２３１－２３５.ｄｏｉ:１０.１５８８９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２－１３０２.２０１９.１４.０５４莫海威芽孢杆菌产壳聚糖酶的分离纯化及酶学性质分析刘进杰１ꎬ吕娟娟１ꎬ陈国忠１ꎬ张㊀娟２ꎬ程仕伟１ꎬ冯志彬１(１.鲁东大学生命科学学院ꎬ山东烟台２６４０２５ꎻ２.鲁东大学农学院ꎬ山东烟台２６４０２５)㊀㊀摘要:纯化从烟台海域沙质土壤分离得到的莫海威芽孢杆菌菌株ａｍｙＰ２１６来源壳聚糖酶ꎬ并对其进行酶学性质分析ꎮ以发酵液为原料ꎬ依次进行超声波破碎菌体㊁２０％~７０％硫酸铵分级盐析㊁纤维素ＤＥ－３２阴离子交换层析㊁葡聚糖凝胶Ｇ－７５过滤层析ꎬ得到壳聚糖酶ꎮ采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳测定分子量为３０ｋｕꎬ全波段扫描结果显示在３２４ｎｍ处出现最高峰ꎮ然后对壳聚糖酶的酶学性质进行研究ꎮ结果表明ꎬ最适反应温度为５５ħꎬ且在一定范围内温度越低ꎬ其热稳定性越高ꎻ最适反应ｐＨ值为５.５ꎬ中性条件下酶活性最稳定ꎻ在金属离子中Ｍｎ２＋对其激活作用最明显ꎬ其他金属离子对其有抑制作用ꎻ该酶具有相对较好的底物特异性ꎮ㊀㊀关键词:壳聚糖酶ꎻ莫海威芽孢杆菌ꎻ分离纯化ꎻ酶学性质ꎻ底物特异性㊀㊀中图分类号:Ｓ１８８＋.３㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２－１３０２(２０１９)１４－０２３１－０５收稿日期:２０１８－０４－０８基金项目:山东省烟台市科技计划(编号:２０１５ＺＨ０６８)ꎮ作者简介:刘进杰(１９７８ )ꎬ女ꎬ山东莱州人ꎬ硕士ꎬ讲师ꎬ主要从事食品生物技术研究ꎮＴｅｌ:(０５３５)６６８１０５３ꎻＥ－ｍａｉｌ:Ｊｉｎｊｉｅ７８＠１２６.ｃｏｍꎮ通信作者:冯志彬ꎬ硕士ꎬ讲师ꎬ主要从事微生物发酵与酶催化研究ꎮＴｅｌ:(０５３５)６６８１０５３ꎻＥ－ｍａｉｌ:ｆｅｎｇｚｈｉｂｉｎ２５７＠１６３.ｃｏｍꎮ㊀㊀壳寡糖在食品㊁医药㊁农业等行业都有着很高的应用价值ꎬ具有抗疲劳㊁调节免疫力和抗肿瘤的功效[１－４]ꎬ可有效抑制肝损伤[５－６]ꎬ还具有降血脂㊁降血糖的功能[６－９]ꎮ壳寡糖还可用于调节植物生长㊁延长果蔬保鲜等[１０－１３]ꎮ壳寡糖是由壳聚糖酶专一性地降解壳聚糖后生成的ꎬ因此寻求具备高效降解能力的壳聚糖酶ꎬ具有较高的工业应用价值ꎮ壳聚糖酶是一类可催化氨基葡萄糖间的β－１ꎬ４－糖苷键断裂的酶[１４]ꎬ其来源广泛ꎬ广泛存在于一些真菌㊁细菌㊁放线菌中ꎬ甚至在植物病原菌㊁病毒中也有存在[１５－１９]ꎮ由于壳聚糖酶来源不同ꎬ酶学性质也就不同ꎬ酶解产物壳寡糖的聚合度也会有所不同[２０]ꎮ因此ꎬ对不同微生物来源的壳聚糖酶进行分离纯化ꎬ研究其酶学性质ꎬ已经成为国内外的研究热点ꎮ前期工作中ꎬ笔者在烟台海域沙质土壤中分离到１株壳聚糖酶产生菌株 莫海威芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ)ａｍｙＰ２１６ꎬ并对其发酵产生壳聚糖酶的条件进行了优化[２１]ꎮ在本研究中ꎬ对发酵液中的壳聚糖酶进行分离纯化ꎬ探讨其酶学性质ꎬ为该壳聚糖酶的更深入研究奠定理论基础ꎬ也为该酶的工业应用提供依据ꎮ１　材料与方法１.１㊀试验材料与设备１.１.１㊀菌株㊀莫海威芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ)菌株ａｍｙＰ２１６ꎬ由笔者所在实验室从烟台海岸带沙质土壤分离筛选获得ꎮ１.１.２㊀试剂㊀磷酸二氢钠㊁磷酸氢二钠㊁醋酸㊁乙酸钠㊁３ꎬ５－二硝基水杨酸㊁氢氧化钠㊁四水酒石酸钾钠㊁苯酚㊁无水亚硫酸钠ꎬ均为国产分析纯ꎻ葡聚糖凝胶Ｇ－７５(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)㊁纤维素ＤＥ－３２ꎬ购自江苏南京奥朵福尼生物科技有限公司ꎻ壳聚糖ꎬ购自山东济南海得贝生物工程有限公司ꎻ标准蛋白ｍａｒｋｅｒꎬ由中国科学院上海生物化学研究所监制ꎮ１.１.３㊀仪器设备㊀Ф３.５ｃｍˑ７０ｃｍ层析柱ꎬ购自上海华美实验仪器厂ꎻＨＬ－２恒流泵ꎬ购自上海沪西仪器厂有限公司ꎻＳＢＳ－１００数控记滴自动部分收集器ꎬ购自上海青浦沪西仪器厂ꎻＺ－３２３－Ｋ高速冷冻离心机㊁ＴＤＬ－６０Ｂ低速台式离心机ꎬ购自上海安亭科学仪器厂ꎻＷＦＪ７２００可见光分光光度计ꎬ购自尤尼科(上海)仪器有限公司ꎻＭＤ３４透析袋(美国Ｖｉｓｋａｓｅ)ꎻＢＳ２２４Ｓ电子分析天平ꎬ购自北京赛多利斯仪器有限公司ꎻＫＤＳ超声波细胞粉碎机ꎬ购自浙江宁波新芝科技有限公司ꎻＨＨ－６水浴锅ꎬ购自江苏省金坛市双捷实验仪器厂ꎮ１.２㊀菌株培养１.２.１㊀培养基㊀ＬＢ斜面培养基:酵母浸粉５ｇ/Ｌ㊁蛋白胨１０ｇ/Ｌ㊁ＮａＣｌ２.５ｇ/Ｌ㊁琼脂２０ｇ/ＬꎬｐＨ值７.０ꎮ液体种子培养基:胶体壳聚糖１０ｇ/Ｌ㊁酵母浸粉５ｇ/Ｌ㊁ＭｇＳＯ４０.５ｇ/Ｌ㊁ＮａＣｌ２.５ｇ/Ｌ㊁ＫＨ２ＰＯ４２ｇ/ＬꎬｐＨ值６.５ꎮ发酵培养基:壳聚糖２０ｇ/Ｌ㊁酵母浸粉１０ｇ/Ｌ㊁ＭｇＳＯ４０.５ｇ/Ｌ㊁ＮａＣｌ２.５ｇ/Ｌ㊁ＫＨ２ＰＯ４２ｇ/Ｌ㊁ＣａＣｌ２０.１ｇ/ＬꎬｐＨ值６.５[２１]ꎮ１.２.２㊀培养方法㊀菌种活化:取甘油管保藏菌种划线至ＬＢ斜面培养基ꎬ３０ħ培养２４ｈꎮ种子液:挑取单菌落接种至液体种子培养基ꎬ３０ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ培养２４ｈꎮ摇瓶发酵:５００ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ发酵培养基ꎬ按５％接种量将种子液接入发酵培养基ꎬ３０ħ㊁２２０ｒ/ｍｉｎ培养６０ｈꎮ发酵罐培养:按５％接种量将种子液接入装有３Ｌ发酵培１３２ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１４期养基的５Ｌ自控发酵罐中ꎬ转速６００ｒ/ｍｉｎꎬ通气量２Ｌ/(Ｌ ｍｉｎ)ꎬ温度３０ħ[２１]ꎮ１.３㊀壳聚糖酶的分离纯化取发酵罐培养的发酵液ꎬ４ħ㊁８０００ｒ/ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ后ꎬ收集菌体ꎮ超声波破碎２０ｍｉｎ后ꎬ４ħ㊁６０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ加入硫酸铵至饱和度２０％ꎬ４ħ过夜ꎬ１００００ｒ/ｍｉｎ低温离心３０ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ继续加入硫酸铵固体至饱和度７０％ꎬ４ħ过夜ꎬ１００００ｒ/ｍｉｎ低温离心３０ｍｉｎꎬ收集沉淀ꎮ将沉淀溶解于０.０２ｍｏｌ/Ｌ磷酸盐缓冲液(ｐＨ值８ꎬ含１ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)中ꎬ透析浓缩后得粗酶液[１６ꎬ２２]ꎮ取粗酶液３ｍＬ进行纤维素ＤＥ－３２柱层析ꎬ并用０.０２ｍｏｌ/Ｌ磷酸盐缓冲液(ｐＨ值８ꎬ含１ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)进行洗脱ꎬ合并有酶活的部分并浓缩ꎮ然后采用葡聚糖凝胶Ｇ－７５柱层析ꎬ并用０.０２ｍｏｌ/Ｌ磷酸盐缓冲液(ｐＨ值８ꎬ含１ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)作为洗脱液进行洗脱ꎬ合并有酶活的部分并进行浓缩[２２－２４]ꎮ浓缩后的样品采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳的方法进行酶蛋白的纯度分析以及相对分子质量的测定ꎬ分离胶的质量分数为１５％ꎬ浓缩胶质量分数为５％[２５]ꎮ１.４㊀壳聚糖酶的酶学性质研究１.４.１㊀温度及最适温度的测定㊀将酶液与壳聚糖底物分别放于３５㊁４５㊁５５㊁６５㊁７５㊁８５ħ水浴中反应１５ｍｉｎꎬ以确定酶的最适反应温度ꎮ将酶液在上述温度中保温１２０ｍｉｎꎬ以探讨热稳定性ꎮ１.４.２㊀ｐＨ值及最适ｐＨ值的测定㊀将酶液与壳聚糖底物放于ｐＨ值分别为４㊁５㊁６㊁７㊁８㊁９的磷酸缓冲液中反应３０ｍｉｎꎬ测定酶活ꎬ以确定最适反应ｐＨ值ꎮ将酶液放于上述的缓冲液中ꎬ保温２ｈꎬ测定酶活性ꎬ以探讨ｐＨ值稳定性ꎮ１.４.３㊀金属离子对酶活性的影响㊀等量酶液与底物混合ꎬ加入不同金属离子ꎬ使离子浓度达到０.５ｍｍｏｌ/Ｌꎮ不同金属离子分别为Ｍｎ２＋(ＭｎＳＯ４)㊁Ｍｇ２＋(ＭｇＳＯ４)㊁Ｃａ２＋(ＣａＣＬ２)㊁Ｃｕ２＋(ＣｕＳＯ４)㊁Ｆｅ３＋[Ｆｅ２(ＳＯ４)３]㊁Ｂａ２＋(ＢａＳＯ４)㊁Ｌｉ＋(Ｌｉ２ＳＯ４)㊁Ｚｎ２＋(ＺｎＳＯ４)ꎬ以不加金属离子为对照ꎬ计算相对酶活性并作图ꎬ以探讨金属离子对酶活性的影响ꎮ１.４.４㊀底物特异性㊀分别取１％壳聚糖醋酸溶液㊁胶体壳聚糖㊁羧甲基壳聚糖㊁胶体甲壳素㊁羧甲基纤维素钠作为底物反应ꎬ保温１５ｍｉｎꎬ以壳聚糖为底物作为对照ꎬ计算相对酶活性并作图ꎬ以探讨壳聚糖酶对底物的专一性ꎮ１.５㊀检测方法１.５.１㊀壳聚糖酶活性测定㊀采用３ꎬ５－二硝基水杨酸(ＤＮＳ)测定还原糖的方法测定壳聚糖酶的活性[１６ꎬ２４]ꎮ以氨基葡萄糖为标准绘制标准曲线ꎬ其回归方程为ｙ＝０.０８３９３ｘ＋０.０３３７ꎮ式中:ｙ为吸光度Ｄ值ꎻｘ为浓度ꎬμｍｏｌ/ｍＬꎻｒ２＝０.９９６７７ꎮ酶活性单位定义为１ｍＬ发酵液１ｍｉｎ下释放生成的微摩尔还原糖ꎮ１.５.２㊀蛋白质浓度测定㊀蛋白质浓度采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法[２５]ꎬ以牛血清白蛋白(ＢＳＡ)为标准绘制标准曲线ꎬ牛血清蛋白标准曲线的回归方程为ｙ＝１.５９３４３ｘ－０.０４２１２ꎮ式中:ｙ为Ｄ值ꎻｘ为浓度ꎬμｍｏｌ/ｍＬꎻｒ２＝０.９９９２６ꎮ１.６㊀数据处理与分析利用ＳＰＳＳ１９.０进行数据处理和误差分析ꎬ用Ｏｒｉｇｉｎ８绘图软件绘制图形ꎮ每组试验做３个平行试验ꎬ以３组数据进行误差分析以得到准确的试验结论ꎮ２　结果与分析２.１㊀壳聚糖酶的分离纯化将破壁㊁盐析㊁透析后壳聚糖酶粗酶液上样于磷酸盐缓冲液平衡好的ＤＥＡＥ层析柱ꎬ随后用０.０２ｍｏｌ/Ｌ磷酸盐缓冲液(ｐＨ值８ꎬ含１ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ)进行洗脱ꎬ洗脱结果如图１所示ꎮ试验共收集３０管样品ꎬ每管２.５ｍＬꎮ在第１８管处出现第１个酶活性和蛋白质浓度最高峰ꎬ且酶活性峰值与蛋白浓度峰值基本重合ꎻ在第２２管处出现第２个酶活性和蛋白质浓度高峰ꎬ但其酶活性和蛋白质含量明显低于第１个峰ꎮ可见ꎬ壳聚糖酶的酶活性主要集中在第１个蛋白峰处ꎮ㊀㊀把经纤维素ＤＥ－３２洗脱得到的第１个蛋白峰处的样品收集㊁浓缩ꎬ上样到葡聚糖凝胶Ｇ－７５层析柱进一步分离纯化ꎬ洗脱图谱如图２所示ꎮ试验中共收集１７管样品ꎬ每管４ｍＬꎬ酶活性检测发现第６管和第１１管处的蛋白样有明显的壳聚糖酶活性ꎬ第６管酶活性较高ꎮ蛋白峰出现在第５管和第１０管处ꎬ第５管处蛋白浓度略高ꎮ㊀㊀由表１可知ꎬ经过盐析㊁纤维素ＤＥ－３２交换层析和葡聚糖凝胶Ｇ－７５层析等一系列纯化后ꎬ壳聚糖酶比活力达到８.０１ｍｏｌ/(ｍｉｎ ｍｇ)ꎬ回收率为４.４％ꎮ㊀㊀对葡聚糖凝胶Ｇ－７５层析中第６管处样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测其分析纯度和相对分子质量ꎬ结果如图３所示ꎮ样品为单一条带ꎬ说明所分离的壳聚糖酶纯度较高ꎬ与标准蛋白ｍａｒｋｅｒ比对ꎬ可以得出分子量约为３０ｋｕꎬ这与Ｓｈｉｍｏｓａｋａ等(３１.９ｋｕ)[１９]㊁孙菲等(３０ｋｕ)[２３]㊁段妍等(３０.５ｋｕ)[２４]所纯化的壳聚糖酶相对分子质量大致相当ꎻ但是与Ｇａｏ等(４１ｋｕ)[２６]㊁Ｍｕｓｌｉｍ等(４５ｋｕ)[１８]㊁韩宝芹等２３２ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１４期表１　壳聚糖酶分离纯化纯化步骤总体积(ｍＬ)总酶活性[μｍｏｌ/(ｍｉｎ ｍＬ)]总蛋白量(ｍｇ)比活力[μｍｏｌ/(ｍｉｎ ｍｇ)]纯化倍数得率(％)粗酶４００１６８８.６８５３１４.６７０.３２１.００１００.０硫酸铵盐析３００１３４０.４１２５４９.４５０.５３１.６５７９.４ＤＥＡＥ层析３０２０８.６５６３.８４３.２７１０.２９１２.４ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５层析１０７４.９５９.３６８.０１２５.２１４.４(６６.２ｋｕ)[２７]㊁Ｗａｎｇ等(２１㊁１８ｋｕ)[２８]㊁Ｓｈｅｈａｔａ等(１３０ｋｕ)[２９]纯化相差较大ꎮ可见ꎬ不同来源的壳聚糖酶的相对分子质量有明显的差异ꎮ㊀㊀由图４可知ꎬ壳聚糖酶在３２４ｎｍ处有最大吸光度ꎬ数值为０.２６５ꎬ具有一般酶蛋白的紫外吸收特征ꎮ２.２㊀壳聚糖酶酶学性质研究２.２.１㊀温度及温度稳定性测定㊀由图５可知ꎬ曲线呈现先上升后下降的趋势ꎬ最高点出现在５５ħ处ꎮ５５~６５ħꎬ曲线呈直线下降ꎬ当超过６５ħ时ꎬ酶活性降至很低ꎬ可能是因为温度过高使壳聚糖酶变性失去活性ꎮ可见ꎬ壳聚糖酶反应的最适温度在５５ħꎬ这与杨立红等所纯化的壳聚糖酶的最适温度[１６ꎬ２２ꎬ３０]相同ꎬ但是与Ｇａｏ等(６０ħ)[２６]㊁Ｗａｎｇ等(５０ħ)[２８]㊁Ｓｈｅｈａｔａ等(４０ħ)[２９]所纯化的壳聚糖酶的最适温度不同ꎮ㊀㊀由图６可见ꎬ在一定范围内ꎬ温度越低ꎬ对酶的稳定性越好ꎮ所有曲线都呈现下降趋势ꎮ在保温６０ｍｉｎ后５０㊁６０ħ保温条件下ꎬ酶活性均消失ꎬ在６０ħ下壳聚糖酶更快失去酶活ꎻ保温９０ｍｉｎ后ꎬ３０㊁４０ħ也失去了酶活ꎬ４０ħ保温条件下ꎬ相对酶活性下降得更快ꎬ即壳聚糖酶更容易失去酶活性ꎮ２.２.２㊀ｐＨ值及ｐＨ值稳定性测定㊀ｐＨ值对壳聚糖酶活性的影响如图７所示ꎬ曲线呈先上升后下降的趋势ꎮ在ｐＨ值５.５之前ꎬ酶活性随ｐＨ值的升高而上升ꎬ当ｐＨ值达到６以３３２ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１４期后ꎬ酶活性急剧下降ꎬ在ｐＨ值５.５处出现最高峰ꎬ可见壳聚糖酶反应的最适ｐＨ值为５.５ꎬ这与Ｓｈｅｈａｔａ等(４０ħ)[２９]㊁隋斯光等[３１]研究的壳聚糖酶的最适ｐＨ值相同ꎮ当ｐＨ值为６.０时ꎬ本试验所纯化得到的壳聚糖酶的活性大大降低ꎬ但是Ｇａｏ等纯化的壳聚糖酶的最适ｐＨ值却是６.０[２６ꎬ３２]ꎮ这表明不同来源的壳聚糖酶的最适ｐＨ值差距较大ꎬ莫海威芽孢杆菌ａｍｙＰ２１６来源的壳聚糖酶的最适ｐＨ偏酸性ꎮ㊀㊀ｐＨ值对酶活稳定性的影响如图８所示ꎮ时间越长ꎬ相对酶活性越小ꎬ在ｐＨ值为７即中性环境下ꎬ相对酶活性降低较慢ꎬ说明保温时间对酶活性的影响最小ꎻｐＨ值６环境下ꎬ酶活性降低程度次之ꎻｐＨ值４和５对酶活性的稳定性影响较大ꎬｐＨ值为４时相对酶活性下降最快ꎬ对酶活性稳定性影响最大ꎮ由此可得ꎬｐＨ值７最适合壳聚糖酶的保存ꎮ２.２.３㊀金属离子对酶活性的检测㊀金属离子对壳聚糖酶的影响结果如图９所示ꎬ本试验所验证的金属离子中ꎬ正１价金属离子Ｌｉ＋对酶活性有明显的抑制作用ꎬ在浓度达到０.５ｍｍｏｌ/Ｌ时ꎬ其相对酶活性为７６.７％ꎮ正２价金属离子中ꎬＭｎ２＋对酶活性有激活作用ꎬ在金属离子浓度为０.５ｍｍｏｌ/Ｌ时ꎬ其相对酶活性达到２６３.１％ꎬ其原因可能与酶的活性中心有关ꎮＭｇ２＋㊁Ｃａ２＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｂａ２＋㊁Ｚｎ２＋等都有一定的抑制作用ꎬ其中Ｂａ２＋的抑制作用最弱ꎬ相对酶活性为９０.１％ꎬＣｕ２＋的抑制作用最强ꎬ相对酶活性达到３９.７％ꎮ正３价金属离子Ｆｅ３＋对酶活性同样有严重的抑制作用ꎬ是以上８种离子中抑制作用最强的ꎬ相对酶活性达到３４.３％ꎮ㊀㊀在本试验所研究的金属离子中ꎬ只有Ｍｎ２＋对酶活性有激活作用ꎬ其他金属对酶活性均有抑制作用ꎮ这与其他来源的壳聚糖酶的试验结果也有所不同ꎮＷａｎｇ等研究发现Ｍｎ２＋会抑制ＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓＴＫＵ０１１来源的壳聚糖酶[２８]ꎬ周念波等研究发现Ｚｎ２＋㊁Ｃａ２＋对Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＬＳ产的壳聚糖酶有一定的激活作用[２２]ꎬ这进一步表明不同微生物来源的壳聚糖酶的酶学性质是有差异的ꎮ２.２.４㊀底物特异性检测㊀如表２所示ꎬ壳聚糖酶对壳聚糖的水解能力最强ꎬ对羧甲基纤维素钠㊁ＤＥＡＥ纤维素和甲壳素也有一定的水解能力ꎬ其水解能力依次降低ꎮ可见ꎬ纯化所得的壳聚糖酶底物特异性较好ꎮ３㊀结论壳聚糖酶是理想的制备壳寡糖的酶制剂ꎬ本研究以高产壳聚糖酶的莫海威芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ)ａｍｙＰ２１６发表２㊀壳聚糖酶底物特异性底物相对酶活性(％)壳聚糖１００.０羧甲基纤维素钠７９.２ＤＥＡＥ纤维素７７.６甲壳素７５.２酵液为原料ꎬ经过超声波破壁处理㊁硫酸铵分级沉淀㊁纤维素ＤＥ－３２阴离子交换柱层析㊁葡聚糖凝胶过滤层析等方法纯化后ꎬ得到了电泳纯壳聚糖酶ꎬ纯化倍数达到２５.２１倍ꎬ相对酶活性为８.０１ｍｏｌ/(ｍｉｎ ｍｇ)ꎬ回收率为４.４％ꎮ电泳法测定莫海威芽孢杆菌来源壳聚糖酶相对分子质量为３０ｋｕꎬ全波段扫描结果显示在３２４ｎｍ处出现最高峰ꎬ峰值为０.２６５Ａｂｓꎮ经酶学性质研究发现ꎬ该壳聚糖酶的最适反应温度为５５ħꎬ在试验范围内ꎬ温度越低ꎬ酶的稳定性越好ꎻ最适反应４３２ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１４期ｐＨ值为５.５ꎬ在ｐＨ值７时酶的稳定性较好ꎻ在试验范围内ꎬ金属离子Ｍｎ２＋对其激活作用最明显ꎬＭｇ２＋㊁Ｃａ２＋㊁Ｃｕ２＋㊁Ｂａ２＋㊁Ｚｎ２＋等金属离子对其有抑制作用ꎻ该酶具有相对较好的底物特异性ꎮ下一步研究将对该酶进行基因工程研究ꎬ以提高酶的表达量ꎬ为其产业化奠定基础ꎮ参考文献:[１]尹雨芳ꎬ林㊀强ꎬ曹建民ꎬ等.壳寡糖抗运动疲劳及对运动性免疫抑制的影响[Ｊ].中国实验方剂学杂志ꎬ２０１６ꎬ２２(４):１４６－１４９. 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