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cdna文库构建流程

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cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。

▲1x MOPS:10x MOPS 30ml加DEPC水270ml，用时现配。

▲4x RNA Loading buffer:10x MOPS 400ul甘油（高压过）200UL溴酚兰10ul甲醛(37%) 72ul去离子甲酰氨310ulEDTA(0.5M PH 8.0) 8ulErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul在4℃可保持3个月▲10x PBSpH=7.4NaCl 80gKCl 2gNa2HPO4 14.4gKH2PO4 2.4g定容至1000ml▲变性电泳胶：称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液：在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml2.动物组织total RNA的提取1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。

2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。

3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。

4．根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

5．冰浴10分钟。

6．4︒C，12000g离心20分钟。

7．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。

蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8．加入等体积的异丙醇，-20︒C沉淀30分钟以上。

10．根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11．加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。

12．4︒C，12000g离心20分钟。

13．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20︒C沉淀至少30分钟。

14．4︒C，12000g离心20分钟。

15．弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。

4︒C，12000g离心10分钟。

16．弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。

用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

17．取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80︒C冰箱中保存。

3.植物组织total RNA的提取1.先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。

（1g样品加入3ml变性裂解液）。

3.加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。

4.加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。

5.冰浴10min。

4℃，12000g离心10min6.小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。

7.4℃，12000g离心20min。

8.去上清，取沉淀。

加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。

9.4℃，13000rpm离心15min。

10.用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。

11.4℃，13000rpm离心10min。

12.取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。

14.弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。

15.弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。

16.用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17.取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。

4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)1．查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free 离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2．将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。

3．室温温育10分钟。

4．据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。

5．4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。

6．转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。

根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。

7．4ºC,12000g离心10分钟。

8．去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9．4ºC，7500g离心5分钟。

10．去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。

加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11．取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。

二.mRNA的分离1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法准备工作：1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。

2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。

3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。

试验步骤：1.Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul2.根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension，轻弹1.5ml离心管彻底混匀3.置于70℃水浴中3min4.取出置于室温（20℃－30℃）10min5.13000rpm室温离心2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。

6.用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到SpinColumn中，RT ，13000rpm，离心1min7.将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT，13000rpm，离心1min8.将Spin Column 转移到一个新的1.5ml管中，取出25ulOER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。

9.取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温13000rpm，离心1min。

10.测OD,并电泳定量。

2.磁珠法分离mRNA1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.2. 65ºC加热10分钟。

3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。

4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。

用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。

6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。

7. 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。

8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。

9.用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。

11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。

12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。

13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。

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cdna文库的构建步骤

cdna文库的构建步骤

cdna文库的构建步骤CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。

下面将介绍CDNA文库的构建步骤。

一、RNA提取RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。

RNA提取需要注意以下几点：1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。

2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。

3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。

4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。

二、反转录反转录是将RNA转化为cDNA的过程。

反转录需要注意以下几点：1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。

2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。

三、二代测序前的PCR扩增PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。

PCR扩增需要注意以下几点：1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。

2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。

四、文库构建文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。

文库构建需要注意以下几点：1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。

2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。

3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。

五、二代测序二代测序是对CDNA文库进行高通量测序的过程。

二代测序需要注意以下几点：1. 选择合适的平台和测序模式，如Illumina HiSeq、NovaSeq等平台。

2. 测序深度要根据实验需求进行调整，以保证数据质量和覆盖度。

3. 测序后得到原始数据后，需要进行质控、去除低质量数据、拼接等步骤，得到高质量的测序数据。

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。

（2）cDNA第一条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。

）。

2. 混匀后，70℃反应10分钟。

3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。

4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。

7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。

cDNA 文库的构建

cDNA 文库的构建

第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。

cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。

cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。

cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。

图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。

通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。

目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。

1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。

2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。

低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。

3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。

cDNA文库制备非常详细

cDNA文库制备非常详细

cDNA⽂库制备⾮常详细cDNA⽂库组标准流程⼀. Total RNA的提取 (2)⼆. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)⼋．pBlueScript cDNA库扩增 (18)⼀.Total RNA的提取1.试剂配制准备⼯作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均⽤锡纸包裹⼝部，置于烤箱内,180℃，烤6⼩时。

2、50ml/1.5ml离⼼管、枪头等塑料制品⽤0.1‰DEPC⽔浸泡过夜后，121℃20mins ⾼压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳⼦⽤3%双氧⽔处理。

4、常⽤试剂及其配⽅：▲DEPC⽔：在1000ml去离⼦⽔中加⼊100ul DEPC, 静置过夜后⾼压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三⽔合柠檬酸纳22.94g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。

▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。

▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC⽔定容⾄250ml，室温放置备⽤临⽤前加β-巯基⼄醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC⽔定容⾄100ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g⽤NaOH调PH值⾄8.0，定容到100ml，⾼压灭菌，室温放置备⽤▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml⽤NaOH调PH值 6.5 , DEPC⽔定容到1L，室温避光放置备⽤。