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酵母双杂原理
酵母双杂原理是指在酵母菌中同时存在两个不同的杂合体（heterozygote）基因型，这种基因型通常由一对等位基因（alleles）构成，一个来自母本，一个来自父本。
每个等位基因会对一个特定的基因座（locus）进行编码，基因型是指一个个体在所有基因座上的等位基因组合。
在酵母双杂原理中，两个不同的杂合体基因型具有不同的表型（phenotype），即表现出不同的外部特征。
酵母双杂原理是一种非常重要的遗传学实验方法，可以用来研究基因的功能、表达和调控。
通过将两个不同的杂合体基因型分别交配，得到一个新的杂合体基因型，这个新的基因型包含了来自父本和母本的两个不同等位基因的组合。
通过对这个新的基因型进行表型分析，可以确定不同基因座的遗传性状和表达模式，从而研究基因的功能和调控机制。
酵母双杂原理的应用非常广泛，包括研究基因调控机制、发现新的基因和蛋白质相互作用关系、检测基因突变和修饰等。
此外，酵母双杂原理也被用于筛选新药物和治疗方法，以及研究人类疾病的基因遗传学。
酵母双杂（共转）酵母双杂交的原理及实验步骤吴健2015.12.25一酵母双杂交的原理在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1的转录。
GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。
将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。
说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。
酵母双杂交系统就是在这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。
由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。
除了将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。
Fig1. 酵母双杂原理图Fig2. 常用两种酵母菌的基因型Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图二酵母双杂交的基本步骤1 酵母感受态的制备配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。
1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种；2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h；3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震荡培养20 h，直到OD 600 =0.3；4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5；5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块；6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块；7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec；8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。
酵母双杂交系统原理(一)酵母双杂交系统1. 什么是酵母双杂交系统？•酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，用于测试两个蛋白质是否相互作用，并进一步研究其相互作用的特点和机制。
•这个系统基于酵母菌（酿酒酵母或拟南芥酵母）的特性，当两个蛋白质相互作用时，可以触发酵母的生长或表达特定的报告基因。
2. 酵母双杂交系统的原理•酵母双杂交系统基于两个重要的分子域：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。
•DBD通常来自于一个转录因子，可以与DNA结合并调节基因的转录水平。
•AD则是一个激活域，可以与其他蛋白质相互作用并激活报告基因的表达。
•在酵母双杂交系统中，将待测蛋白的DBD与一个对照蛋白的AD 融合，构建成DBD-融合蛋白，而待测蛋白的AD与一个对照蛋白的DBD融合，构建成AD-融合蛋白。
•当两个融合蛋白相互作用时，DBD和AD相互结合，激活报告基因的表达，从而观察到酵母生长或报告基因的表达。
3. 酵母双杂交系统的应用•酵母双杂交系统广泛应用于蛋白质相互作用和功能研究领域。
•可以用于筛选蛋白质相互作用的伙伴，发现新的蛋白质复合物。
•可以用于研究蛋白质的亚细胞定位和功能等特性。
•可以用于研究蛋白质结构和功能的变异。
•可以用于研究蛋白质与其他生物分子（如DNA、RNA、小分子化合物等）的相互作用。
•可以用于研究蛋白质的信号传导途径和调控机制。
4. 酵母双杂交系统的优缺点优点：•酵母双杂交系统是一种简单、快速、高通量的方法，可以同时测试多个蛋白质相互作用。
•可以研究蛋白质相互作用的强度和特异性。
•可以在活细胞环境下进行研究，更接近生物体内的情况。
缺点：•酵母双杂交系统可能存在假阳性和假阴性的问题，需要进行进一步的验证。
•酵母双杂交系统对蛋白质的折叠状态和局部结构要求较高，对于某些复杂蛋白质可能不适用。
•酵母双杂交系统无法直接观察蛋白质相互作用的动力学过程，只能得到静态的结果。
总结酵母双杂交系统是一种重要的蛋白质相互作用研究方法，基于酵母菌的特性，通过构建融合蛋白实现对蛋白质相互作用的测试。
酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。
本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。
一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。
该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。
1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。
–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。
当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。
2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。
–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。
通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。
2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。
例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。
3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。
通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。
4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。
通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。
三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种常用的遗传交互技术，用于检测蛋白质之间的相互作用关系。
其原理基于两个主要组成部分：DNA 结合域和活化域。
在酵母双杂交系统中，常用的DNA结合域是DNA结合蛋白Gal4，它可以结合在特定的DNA序列上，形成Gal4-DNA复合物。
同时，活化域是Gal4的活化域，它具有激活靶基因表达的能力。
当两个蛋白质相互作用时，可以通过特定的实验设计，将待测蛋白质A与Gal4的DNA结合域、待测蛋白质B与Gal4的活化域结合，从而在酵母细胞中形成Gal4-DNA-A-B的复合物。
这个复合物可以激活靶基因的表达，从而使被激活的基因产生可观察的表型改变（比如生长能力、荧光等），表明蛋白质A 和B之间存在相互作用。
另外，在酵母双杂交系统中引入了质粒的概念，可以通过构建不同的融合质粒来进一步验证蛋白质相互作用的强弱以及特异性。
例如，可以构建融合质粒A-DNA结合域-AD活化域和融合质粒B-DNA结合域-BD活化域，并通过检测酵母细胞的表型改变来判断蛋白质A和B之间的相互作用。
总体来说，酵母双杂交技术基于蛋白质与蛋白质之间的相互作用，通过构建特定的融合质粒和酵母细胞表型改变的观察，来验证蛋白质之间的相互作用关系。
这项技术在生命科学研究中广泛应用，有助于揭示蛋白质网络的复杂关系和功能。
酵母双杂交的原理引言：酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
本文将详细介绍酵母双杂交的原理及其在科研领域中的应用。
一、酵母双杂交的基本原理酵母双杂交技术是基于酵母细胞的遗传特性和蛋白质相互作用的原理而发展起来的。
其基本原理可简单概括为以下三个步骤：第一步：构建酵母双杂交载体将目标蛋白质分别与DNA的两个片段（称为“鱼饵”和“猎物”）融合，构建酵母双杂交载体。
鱼饵片段通常与DNA结合蛋白质相连，而猎物片段通常与转录激活蛋白质相连。
第二步：转化酵母细胞将构建好的酵母双杂交载体转化到酵母细胞中。
这里使用的是酵母的双杂交株，其特点是缺失了酵母中的两个转录因子基因。
第三步：筛选蛋白质相互作用在含有适当选择性培养基的培养条件下，酵母细胞将仅在存在蛋白质相互作用的情况下存活下来。
通过对酵母细胞进行筛选，可以筛选出与目标蛋白质相互作用的蛋白质。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术已经被广泛应用于生物学研究中，尤其是在蛋白质相互作用的研究方面。
以下是酵母双杂交技术在不同领域的应用：1. 蛋白质相互作用研究酵母双杂交技术是研究蛋白质相互作用的重要方法。
通过酵母双杂交技术，可以筛选出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，进一步研究其功能和调控机制。
2. 蛋白质与DNA或RNA相互作用研究酵母双杂交技术也可以用于研究蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
通过将目标蛋白质与DNA或RNA片段进行融合，可以筛选出与目标蛋白质相互作用的DNA或RNA序列。
3. 药物靶点筛选酵母双杂交技术在药物研发中也起到了重要的作用。
通过将潜在药物分子与蛋白质片段进行融合，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白质，从而寻找药物的靶点。
4. 疾病相关基因研究酵母双杂交技术也被广泛应用于疾病相关基因的研究中。
通过将疾病相关基因与其他基因片段进行融合，可以筛选出与疾病相关基因相互作用的蛋白质，进一步研究其功能和调控机制。
基于转录因子结构域设计的酵母双杂交原理一、概述酵母双杂交技术作为一种重要的蛋白质相互作用研究方法，已经在生物科学领域得到广泛应用。
通过酵母双杂交技术，研究人员可以快速、精确地筛选出蛋白质相互作用的靶标，从而深入了解蛋白质功能以及信号转导通路等生物学过程。
而基于转录因子结构域设计的酵母双杂交原理，为该技术的发展提供了新的思路和方法。
二、酵母双杂交原理简介酵母双杂交技术是一种利用酵母细胞内蛋白质相互作用的筛选方法。
其基本原理是利用酵母细胞内的转录因子结构域将两个感兴趣蛋白质的互补结构域连接在一起，当这两种蛋白质在酵母细胞内发生相互作用时，转录因子结构域得到激活，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断两个蛋白质是否发生了相互作用。
三、转录因子结构域设计的酵母双杂交原理在设计基于转录因子结构域的酵母双杂交实验时，首先需要选择合适的转录因子结构域。
常用的转录因子结构域有Gal4、LexA等，这些结构域在酵母细胞内可以有效地激活报告基因的表达。
将两个感兴趣蛋白质的互补结构域连接到选定的转录因子结构域上，使得它们可以在酵母细胞内形成一个复合蛋白质。
当这两个蛋白质发生相互作用时，复合蛋白质激活了选择的报告基因，从而实现了蛋白质相互作用的筛选。
四、基于转录因子结构域设计的酵母双杂交技术应用基于转录因子结构域设计的酵母双杂交技术已经在许多生物学研究中得到了广泛的应用。
通过该技术，研究人员可以快速、精确地筛选出大量的蛋白质相互作用靶标，并且可以用于分析特定蛋白质在生物学过程中的相互作用网络。
该技术还可以用于筛选潜在的药物靶标、疾病相关蛋白质等。
五、总结基于转录因子结构域设计的酵母双杂交原理为蛋白质相互作用研究提供了一种新的思路和方法。
通过该原理，研究人员可以快速、准确地筛选出具有特定蛋白质相互作用的靶标，从而深入了解蛋白质功能和信号转导通路等生物学过程。
未来，随着生物学研究的不断深入，相信基于转录因子结构域设计的酵母双杂交技术一定会发挥出更大的作用，促进科学研究的进步和发展。
酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。
本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。
转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。
在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。
如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。
三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。
设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。
2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。
它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。
具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交筛选原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。
Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。
他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。
由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。
通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。
在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。
这个改造过的LacZ 基因被整合到酵母染色体URA3位上。
而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失, 从而排除了细胞内源调控因子的影响。
已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。
结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性, 单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。
目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。
这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。
其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3基因。
经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。
HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。
大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ。
这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。
通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。
其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进, 这里不一一详述。
在双杂交鉴定过程中要经过两次转化, 这个工作量是相当大的, 特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。
而且, 酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。
因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。
Bendixen等人通过酵母接合型的引用, 避免了两次转化操作, 同时又提高了双杂交的效率。
在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型, 这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体, 但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。
根据酵母有性生殖的这一特点, 他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞, “诱饵”表达载体转化a接合型细胞。
然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn), 再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上, 原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。
单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。
长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。
这项改进不仅简化了实验操作, 而且也提高了双杂交的筛选效率。
在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中, 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。
针对实际工作中的这种需要, Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system)。
这项技术的关键是报道基因URA3的引入。
URA3基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。
该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。
Vidal等人通过改造在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。
这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。
在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。
然而如果目的蛋白, 即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用, URA3基因不表达, 则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。
通过这种方法，Vidal等人筛选到了转录因子E2F1的突变物, 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB, 但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力。
结果得到了体外结合实验的验证。
通过对这些突变蛋白基因的测序, 他们发现了新的E2F1同DP1结合的位点。
酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。
该法由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。
酵母双杂交衍生系如酵母双杂交的二元诱饵系统、逆向双杂交系统、非转录读出特点的双杂交系统（如Sos蛋白招募系统、PI3K介导的靶蛋白识别系统和断裂-泛素为基础的双杂交系统）以及转录激活因子与其相关蛋白之间的相互作用的双杂交系统（如以polⅢ为基础的杂交系统和RTA系统）等在很大程度上克服了传统酵母双杂交系统的局限性，扩大了被研究的蛋白质的范围，提高了系统的灵敏度。
酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。
一、酵母双杂交系统原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。
单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点①易于转化、便于回收扩增质粒；②具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因；③酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
