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异基因造血干细胞移植后发生胃肠道急性移植物抗宿主病的危险因素分析高艳林;王风霞;张雅文;胡丽娟;邱婷婷;李德鹏;黄一虹【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2024(53)5【摘要】目的探讨异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后发生胃肠道急性移植物抗宿主病(gastrointestinal acute graft-versus-host disease,GI-GVHD)的临床特征、相关危险因素和预后情况。
方法回顾性分析2017年1月~2020年7月在徐州医科大学附属医院行allo-HSCT的201例患者的临床资料,根据GI-GVHD发生情况进行分组。
单因素Logistic回归分析评价GI-GVHD发生的相关因素,多因素Logistic回归分析评价其发生的独立危险因素,进一步分析GI-GVHD对生存及预后的影响。
结果接受allo-HSCT的201例患者中,36例(17.9%)发生GI-GVHD,发生中位时间为34(9~88)天,中位生存时间为228(21~1759)天,总体生存率为36.1%。
随访中发生GI-GVHD患者的总生存期(overall survival,OS)较未发生者明显降低(36.1%vs 75.0%),差异有统计学意义(P=0.004)。
GI-GVHD患者以持续性恶心、呕吐、腹痛、腹泻和消化系统出血等症状为主,常伴有皮肤、肝脏等靶器官的损害。
单因素Logistic回归分析结果显示,供受者性别关系(P=0.012)、移植类型(P=0.054)、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)位点不合程度(P=0.015)、预处理期间使用碳青霉烯类抗生素(P=0.029)、预处理期间使用碳青霉烯类超过7天(P=0.007)、早期血流感染(bloodstream infection,BSI,P=0.023)是GI-GVHD发生的影响因素。
异基因造血干细胞移植术后Th9细胞重建特点的研究庞楠楠;杨艳新;曲建华;徐建丽;袁海龙;曹海洲;陈刚;江明;丁剑冰【摘要】目的探讨异基因造血干细胞移植术后Th9细胞重建特点.方法选取接受造血干细胞移植治疗的患者64例为研究对象,其中全相合组31例,单倍体组33例,20名健康人作为对照组,通过FCM和ELISA法动态检测患者及对照组外周血中Th9细胞和IL-9、TGF-β、IL-4的变化特点.结果全相合组和单倍体组的Th9细胞百分比值分别在移植后90 d和150 d基本恢复正常(P＞0.05),IL-9的动态变化趋势与Th9细胞的变化相一致,全相合组IL-9的浓度在移植后60 d和90 d时高于单倍体组(P＜0.05);全相合组TGF-β和IL-4在移植后90 d和60 d逐渐恢复至正常水平,单倍体组TGF-β和IL-4在移植后150 d和60 d恢复至正常水平;移植后发生aGVHD患者Th9细胞及IL-9和TGF-β浓度明显低于未发生aGVHD者,差异均有统计学意义(P＜0.05).移植后IL-9的浓度与TGF-β呈正相关.结论全相合组Th9细胞和IL-9的重建早于单倍体组,aGVHD患者Th9/IL-9重建延迟,IL-9可能有助于诱导机体免疫耐受.%Objective To investigate the characteristics of Th9 cell reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.Methods 64 patients with hematopoietic stem cell transplantation treatment and 20 healthy controls were enrolled in this study.Peripheral blood Th9 cells,IL-9,TGF-β and IL-4 from patients and controls were dynamically detected by Flow cytometry and ELISA.Results Th9 cells recovery started from day 90 and 150 in HLA-matched group and HLA-haploidentical group respectively (P ＞0.05);The dynamic trend of IL-9 was consistent with the changes of Th9 cells.The concentration of IL-9 in HLA-matched group were higher than that in HLA-haploidentical group atday 60 and day 90 (P ＜0.05).TGF-β and I L-4 gradually recovered to normal levels at day 60 and day 90 after transplantation in HLA-matched group.In HLA-haploidentical group,TGF-β and IL-4 returned to normal levels at 60 d and 150 d after transplantation;The number of Th9 cell and concentration of IL-9,TGF-β in patients with acute graft-versus-host disease (aGVHD) were significantly lower than patients without aGVHD after transplantation,which the differences were statistically significant (P ＜0.05).The concentration of IL-9 was positively correlated with TGF-β afber transplantation.Conclusion HLA-matched group showed earlier reconstitution of Th9 cells and IL-9 than HLA-haploidentical group;the reconstitution of Th9/IL-9 was delayed in aGVHD patients,and IL-9 might be helpful to induce immune tolerance.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2017(040)012【总页数】5页(P1564-1568)【关键词】异基因外周血造血干细胞移植;急性移植物抗宿主病;Th9细胞;白介素-9【作者】庞楠楠;杨艳新;曲建华;徐建丽;袁海龙;曹海洲;陈刚;江明;丁剑冰【作者单位】新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学公共卫生学院,乌鲁木齐830011;新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院血液病中心,乌鲁木齐830054;新疆医科大学基础医学院免疫教研室,乌鲁木齐830011【正文语种】中文【中图分类】R457.7目前，造血干细胞移植是治疗恶性血液病的最好方法之一，但是找到匹配的亲缘间HLA全相合(HLA-matched sibling donor ，MSD)的供者非常困难。
联合克拉屈滨预处理方案在难治／复发性急性髓系白血病患者异基因造血干细胞移植中的疗效观察王晴晴，夏凌辉ＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｕｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｃｌａｄｒｉｂｉｎｅｉｎａＩｌｏｇｅｎｅｉｃｈｅｍａｔｏ ｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ／ｒｅｌａｐｓｅｄａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａｐａｔｉｅｎｔｓＷＡＮＧＱｉｎｇｑｉｎｇ，ＸＩＡＬｉｎｇｈｕｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｏｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｏｎｇｊｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕｂｅｉＷｕｈａｎ４３００２２，Ｃｈｉｎａ．【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｃｏｍｂｉｎｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｃｌａｄｒｉｂｉｎｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ／ｒｅｌａｐｓｅｄａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ）ｗｉｔｈａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｄａｔａｏｆ１７ｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ／ｒｅｌａｐｓｅｄＡＭＬｗｈｏｕｎｄｅｒｗｅｎｔｃｏｍｂｉｎｅｄｃｌａｄｒｉｂｉｎｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｌａｎａｎｄｒｅｃｅｉｖｅｄａｌｌｏ－ＨＳＣＴｉｎｔｈｅｌａｍｉｎａｒｆｌｏｗｗａｒｄｏｆｏｕｒｈｏｓｐｉｔａｌｆｒｏｍＡｐｒｉｌ２０１７ｔｏＯｃｔｏｂｅｒ２０１９ｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｄｉｎａｌｌｔｈｅ１７ｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄｔｈｅｍｅｄｉａｎｔｉｍｅｏｆｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｗａｓ１２ｄ（９～２０ｄ），ａｎｄｔｈｅｍｅｄｉａｎｔｉｍｅｏｆｐｌａｔｅｌｅｔｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｗａｓ１１ｄ（９～３０ｄ）．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｏｎｅｐａｔｉｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｅｄｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｃｙｓｔｉｔｉｓ．４ｐａｔｉｅｎｔｓｏｃｃｕｒｒｅｄⅠ－ⅡｄｅｇｒｅｅｏｆａＧＶＨＤ．Ａｔｔｈｅｅｎｄｏｆｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ，８ｏｆｔｈｅ１１ｓｕｒｖｉｖｉｎｇｐａｔｉｅｎｔｓｈａｄｌｏｃａｌｉｚｅｄｃＧＶＨＤ．Ｆｉｖｅｐａｔｉｅｎｔｓｒｅｌａｐｓｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈａｍｅｄｉａｎｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｔｉｍｅｏｆ４ｍｏｎｔｈｓ（２～１９ｍｏｎｔｈｓ）．Ｔｈｅ１－ｙｅａｒｏｖｅｒａｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｗａｓ５７．２％，ａｎｄｔｈｅ１－ｙｅａｒｄｉｓｅａｓｅ－ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｗａｓ５５．２％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍｅｆｆｅｃｔｏｆｃｌａｄｒｉｂｉｎｅｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｓｂｅｔｔｅｒ，ｗｉｔｈｏｕｔｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｉｔｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ，ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０８）：１４１９－１４２２【摘要】 目的：评价联合克拉屈滨预处理方案在异基因造血干细胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）治疗难治／复发性急性髓系白血病（ＡＭＬ）中的疗效。
EBV-CTL治疗异基因造血干细胞移植后难治性EB病毒感染的分析缪晓娟;李业成;易海;苏毅;杨慧;孙浩平;付利;范方毅;王译;何光翠;赖思含;侯严堂【摘要】目的：研究EB病毒特异性细胞毒 T 淋巴细胞（EBV‐CTL）治疗异基因造血干细胞移植后难治性 EBV感染的疗效。
方法报道4例EBV‐CTL治疗异基因造血干细胞移植后难治性EBV感染病例并结合文献分析。
结果3例取得了较好疗效，分别于治疗后1、2、3个月转阴，分别随访8、12、6个月未复发，仅有1例在EBV‐DNA转阴后第6个月复发，再次EBV‐CTL治疗后，迅速进展为移植后淋巴细胞增殖性疾病（PTLD），治疗无效死亡。
结论EBV‐CTL是治疗难治性EBV感染的一种有效手段，但仍有部分病例治疗无效，值得进一步探讨和研究。
【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2015(000)029【总页数】3页(P4051-4053)【关键词】疱疹病毒4型 ,人;特异性细胞毒T淋巴细胞;异基因造血干细胞移植【作者】缪晓娟;李业成;易海;苏毅;杨慧;孙浩平;付利;范方毅;王译;何光翠;赖思含;侯严堂【作者单位】成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083;成都军区总医院血液科，成都610083【正文语种】中文【中图分类】R457.7EB病毒(EBV)感染是异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后常见并发症，通常采用减停免疫抑制剂、抗病毒药物和CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)治疗，部分病例病情可以得到有效控制，但仍有部分病例病情进展，成为难治性EBV感染，甚至可发展成移植后淋巴细胞增殖性疾病(post-transplantlymphoproliferativedisease，PTLD)[1]。
《多发性骨髓瘤患者T淋巴细胞及其细胞因子的变化研究》篇一一、引言多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是一种常见的恶性浆细胞病，其特征为骨髓中异常浆细胞增生并产生大量的单克隆免疫球蛋白。
患者体内免疫系统紊乱，往往伴随着T淋巴细胞及其细胞因子的变化。
因此，深入研究多发性骨髓瘤患者T淋巴细胞及其细胞因子的变化对于揭示疾病的发病机制、诊断、治疗及预后具有重要意义。
本文将就此问题展开研究，为临床提供更多理论支持。
二、材料与方法本研究选取了近期入院诊断为多发性骨髓瘤的患者，共60例作为研究对象。
通过流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，检测患者外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+）的分布及细胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-10等）的水平。
同时，选取健康人群作为对照组，进行同样的检测。
三、T淋巴细胞亚群的变化1. 检测结果通过流式细胞术检测发现，多发性骨髓瘤患者外周血中T淋巴细胞亚群分布与健康人群相比存在显著差异。
具体表现为CD3+、CD4+ T淋巴细胞数量减少，而CD8+ T淋巴细胞数量增多。
这表明多发性骨髓瘤患者存在T淋巴细胞免疫功能的紊乱。
2. 影响因素分析研究发现，T淋巴细胞亚群的变化与患者疾病分期、病情严重程度及治疗方案等密切相关。
早期患者T淋巴细胞亚群紊乱较轻，随着病情发展，紊乱程度加重。
经过化疗等治疗后，T淋巴细胞亚群分布有所改善。
四、细胞因子的变化1. 检测结果通过ELISA法检测发现，多发性骨髓瘤患者外周血中细胞因子水平与健康人群相比也存在显著差异。
如IFN-γ、IL-4等炎症相关细胞因子水平升高，而IL-10等免疫调节细胞因子水平降低。
这表明多发性骨髓瘤患者体内存在炎症反应和免疫失衡。
2. 细胞因子与T淋巴细胞的关系研究发现在多发性骨髓瘤患者中，T淋巴细胞亚群的变化与细胞因子水平密切相关。
CD4+ T淋巴细胞数量的减少可能导致IL-4等细胞因子水平降低；而CD8+ T淋巴细胞的增多可能引起IFN-γ等细胞因子水平升高。
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外周血T细胞受体删除环(TRECs)定量测定在评估骨髓移植术后免疫重建中的应用概况及进展武小亮;韩娟;王靖;卢林纲【摘要】骨髓移植成功的关键在于移植后免疫系统的重建状况,特别是T细胞数量及功能的重建.T细胞受体删除环(TRECs)作为胸腺近期输出naive T细胞含量的标志,在细胞中十分稳定,可作为评价胸腺近期的输出功能及T细胞免疫重建状况的指标.鉴于TRECs对评价骨髓移植术后免疫重建状况具有重要现实意义,该文就TRECs的定量检测及其在评价骨髓移植后免疫重建状况中的应用概况及进展进行综述.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2019(034)004【总页数】6页(P1-5,27)【关键词】T细胞受体删除环(TRECs);骨髓移植;免疫重建【作者】武小亮;韩娟;王靖;卢林纲【作者单位】农业农村部食物与营养发展研究所评价研究室,北京 100081;农业农村部食物与营养发展研究所评价研究室,北京 100081;农业农村部食物与营养发展研究所评价研究室,北京 100081;农业农村部食物与营养发展研究所评价研究室,北京 100081【正文语种】中文【中图分类】R457.7;R392.4胸腺是人体重要的中枢免疫器官，是T淋巴细胞生长、发育和成熟的重要场所[1]。
来自骨髓中的前T细胞在胸腺中发育形成naive T细胞，随血流运输至外周血发挥免疫作用。
胸腺naive T细胞的输出能力，一定程度上反映了机体的免疫水平。
研究表明，胸腺输出功能与年龄呈现明显的相关性，随着年龄的增长胸腺逐渐萎缩，胸腺输出功能逐渐降低，但还是能够维持最基本的输出naive T细胞的能力并对机体发挥免疫作用[2-3]。
除年龄增长所引起胸腺萎缩及输出功能下降外，HIV，CHB，AIDs，白血病等病毒和疾病，临床中的化疗、放疗、骨髓移植、实体器官移植、免疫治疗，或长期接触有害化学物质如苯等，均会引起胸腺输出功能降低[4-6]。
急性髓性白血病患者异基因造血干细胞移植后早期T细胞免疫重建的研究（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：吴秀丽李扬秋朱康儿, 杨力建陈少华, 卢育洪陈洁, 刘启发【摘要】目的: 监测急性髓性白血病(AML)患者接受异基因造血干细胞移植(allo HSCT)后外周血中的T细胞受体重排删除环(TRECs)水平, 了解移植后早期的T细胞免疫重建情况。
方法: AML患者15例分别在allo HSCT前以及allo HSCT后每隔2周收集外周血, 采用实时定量PCR法检测外周血单个核细胞(PBMNCs)中的TRECs水平; 7例年龄相近的正常人外周血样本作为对照。
流式检测CD45RA+细胞亚群和CD45RO+细胞亚群的阳性率。
结果: allo HSCT组移植前的TRECs 平均拷贝数为(1.42±1.51)拷贝/1000 PBMNCs, 明显低于正常组的(3.03±0.45)拷贝/1000 PBMNCs水平; 移植后第12周的TRECs平均拷贝数为(1.67±1.93)拷贝/1000 PBMNCs, 与正常相比仍然较低。
移植后8周内以CD45RO+/CD4+细胞的扩增为主, 而外周血TRECs水平在allo HSCT后4周左右出现短暂地升高趋势, 随后又下降, 至allo HSCT 8周后才开始稳步上升。
有急性移植物抗宿主病(aGVHD)病史的移植患者的外周血TRECs水平显著降低, 明显低于无aGVHD病史移植患者的外周血TRECs水平。
3例移植后早期复发的患者的外周血TRECs水平降至基线水平或检测不到。
结论: 不同个体T细胞免疫重建时间存在差异; AML患者在allo HSCT后早期(90 d内)的胸腺输出功能仍处于恢复阶段, 移植后4周内的免疫重建仍以来源于供者细胞的外周扩增为主; 外周血TRECs水平可能与AML患者allo HSCT后病情的发展、转归有关。
【关键词】造血干细胞移植, 异基因; T细胞受体重排删除环; 免疫重建异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo HSCT)是目前治疗急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia, AML)等恶性血液病的有效方法之一, 已广泛应用于临床。
造血干细胞移植后造血功能的全面重建主要包括两个方面, 即造血细胞数量和功能的恢复, 后者主要是指免疫功能重建。
临床上往往将中性粒细胞和血小板的恢复作为造血恢复的指标, 容易忽视免疫功能的恢复。
免疫功能重建现在被认为是评价移植疗效的重要因素之一, allo HSCT后重建T细胞特异性免疫功能, 需要来源于胸腺依赖途径所产生的初始T细胞, 即经胸腺发育而输出的na ve细胞, 而目前能够作为na ve T细胞的标志的是T细胞受体删除DNA环(T cell receptor excision DNA circles, TRECs)[1-3]。
为了解AML患者接受allo HSCT后早期的T细胞免疫重建情况, 我们对其胸腺近期输出功能(外周血TRECs水平)进行了监测, 并对外周血CD45RA+/CD4+、 CD45RO+/CD4+及CD45RA+/CD8+细胞亚群进行了流式细胞术分析。
1 对象和方法1.1 对象接受allo HSCT治疗的AML患者15(男13, 女2)例, 年龄18～56(中位年龄35.7)岁, 其中M2 5例, M3 2例, M4 5例, M5 3例; 供者为HLA位点完全相合同胞或无关供者; 采用联合氟达拉宾的减量清髓预处理方案; 移植后受者全部植活(中性粒细胞连续 3 d ≥0.5×109/L为粒细胞植活, 血小板连续7 d≥20×109/L为血小板植活), 所有受者移植后均为完全供受者嵌合体; 所有患者allo HSCT后临床上未采用改变细胞亚群数量的特殊治疗方案, 并均告知同意及医院伦理委员会同意。
分别于移植前、移植后每间隔2周收集患者外周血样本; 同时收集7例与移植组年龄相近的正常人(均为男性)外周血样本作为对照, 年龄17～48(中位年龄31.6)岁。
1.2 方法1.2.1 流式细胞术检测CD45分子表达和DNA提取按常规方法收集各样本的外周血单个核细胞(PBMNCs), 计数后一部分细胞用于免疫荧光标记(鼠抗人CD4+、 CD8+、 CD45RA、 CD45RO mAb, Fermentas), 利用流式细胞术进行CD45RA+/CD4+、 CD45RO+/CD4+及CD45RA+/CD8+细胞亚群阳性率的检测; 剩余细胞提取DNA(QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAgen), 并用紫外分光光度计检测DNA的浓度及纯度。
1.2.2 引物设计从T细胞受体(TCR)δ基因组序列(ACCESSION AE000661)中于δRec基因片段的下游设计一下游引物(T1)和在ψJα的上游设计一上游引物(T2)[2], 引物的方向恰好与一般的PCR引物相反(所检测的是δRec和ψJα的两个基因片段删除后重组形成的环形DNA, 即TRECs), 并在该扩增片段中间设一荧光素标记探针(T3); 选择RAG2基因作为细胞定量对照: 分别在RAG2基因组序列(ACCESSION M94633)中设计一对引物(R1和R2)及一荧光素标记探针(R3)。
引物和探针由德国柏林TIB生物公司合成。
1.2.3 RAG2TREC标准品的构建利用两对引物分别扩增所需的RAG2和TRECs的基因片段, 经序列分析证实后分别将其连接到TA载体上(TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen), 转入感受态细菌扩增, 抽提、纯化质粒后再经酶切、 PCR和测序证实目的基因片段的准确性; 用凝胶电泳和紫外分光光度计检测质粒的浓度及纯度, 根据质粒分子量换算为拷贝数, 稀释标准质粒, 将其调整为梯度浓度: 107、106、 105、 104、 103、 102和10拷贝/2 μL。
1.2.4 实时定量PCR 每一标本分别检测2次RAG2和2次TRECs, 总反应体积为25 μL, 其中含标准品2 μL或约100 ng基因组DNA, 0.5 μmoL/L引物, 0.2 mmoL/L dNTP, 1.5 U Ampli TaqGold(ABI, USA), 0.1 μmoL/L的6 FAM TAMRA探针和PCR缓冲液(含4 mmoL/L MgCl2)。
在95℃ 10 min变性后, 共进行45个循环扩增, 每一循环包括95℃30 s和64℃ 1 min。
反应在MJ Opticon Monitor(BIO RAD)中进行。
反应分别设标准组(7个浓度)、阳性对照组(两个平行反应)、阴性对照(两个平行反应)及样品组。
1.3 统计学分析根据所检测样本中RAG2的实测数值来确定所检测样本中所含的细胞数(每个细胞含2个RAG2拷贝), 然后计算每1000个PBMNCs中所含的TRECs拷贝数, 计算公式为: n=2×1000×[TRECs(1)+TRECs(2)]/[RAG2(1)+RAG2(2)]; 使用SPSS 13.0软件包进行统计学处理, 采用非参数检验的Mann Whitney U检验进行组间比较; 各组样本中的平均TRECs水平以x±s表示。
2 结果2.1 allo HSCT后CD45RA+细胞亚群及CD45RO+细胞亚群阳性率的变化 allo HSCT后各时间组的CD45RA+细胞亚群和CD45RO+细胞亚群的平均阳性率显示出一定的变化趋势(图1)。
CD45RO+/CD4+、CD45RA+/CD8+细胞亚群的阳性率在移植后第4周时均明显较低, 随后逐步上升, 8～12周又出现下降趋势; CD45RA+/CD4+细胞亚群的阳性率在移植后12周内均维持在较低水平; 移植后8周内以CD45RO+/CD4+细胞的扩增为主。
图1 allo HSCT后90 d内CD45RA+细胞亚群及CD45RO+细胞亚群阳性率变化2.2 实时定量PCR的敏感性、重复性和特异性最大敏感性可达到10个拷贝/μL, 且1×107～1×102拷贝/μL的重复性良好; 模板在10个拷贝数以下时结果不稳定, 故将检出限为10拷贝数以上; 经电泳可见到符合目的片段大小的条带(RAG2为245 bp, TRECs为390 bp)。
标准曲线的斜率(slope)均为-0.28, 系列稀释的标准品浓度与循环阈值具有较好的相关关系(r=0.996, 0.998)。
无模板对照未见任何扩增。
2.3 allo HSCT后外周血TRECs水平的变化 PBMNCs中的TRECs水平有着较大的个体差异。
正常对照组外周血中的TRECs平均拷贝数为(3.03±0.45拷贝/1000 PBMNCs); allo HSCT组移植前的TRECs 平均拷贝数为(1.42±1.51拷贝/1000 PBMNCs), 明显低于正常组(Mann Whitney U检验, P0.05)。
移植后TRECs水平的变化也有较大个体差异, 移植后各时间组的平均TRECs水平存在着一定的变化趋势, 其中7例allo HSCT后90 d内未发生GVHD的患者的TRECs 水平变化见图2。
在allo HSCT后4周左右, 外周血TRECs水平出现短暂的升高趋势, 但维持时间不长, 随后又复下降; 在allo HSCT后第8周时, 外周血TRECs水平降低最为明显, 接近或达到基线水平; 之后TRECs水平开始缓慢平稳上升, 移植后第12周的TRECs平均拷贝数为(1.67±1.93拷贝/1000 PBMNCs), 虽然稍高于移植前水平, 且有1例患者的TRECs水平已经达到甚至超过正常人平均水平, 但总体与正常对照组相比仍然较低(Mann Whitney U检验, P0.05)。
allo HSCT后有急性移植物抗宿主病(acute graft vs host disease, aGVHD)病史的移植患者(3例发生肠道aGVHD, 2例发生皮肤aGVHD)外周血TRECs水平显著降低(0.07±0.14拷贝/1000 PBMNCs), 明显低于同时期无急性GVHD病史的移植患者外周血TRECs 水平(0.82±1.12拷贝/1000 PBMNCs), 甚至趋于基线水平(Mann Whitney U检验, P0.05)。
