实验一根系活性的测定
1．原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。根对α-萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系，日本人相见、松中等人认为α-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对α-萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。
α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定α-奈胺含量。
2.药品：
（1）40ppm（ug/ml）α-萘胺溶液：精确称取0.10g分析纯α-萘胺，先用2ml95%酒精溶解，加约50ml蒸馏水移入100ml容量瓶中，然后稀释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。用前稀释25倍（40ml稀释至1000ml）即为40ppm溶液。
（2）１％对氨基苯磺酸溶液：称1ｇ对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸（醋酸）中。（3）100ppm亚硝酸钠溶液：称0.10g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。
（4）0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液
分子量0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）Ｎa2HPO4.2H2O 178.057.1184g
Ｎa2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g
KH2PO4136.09 3.6292g
Ｎa2HPO4.2H2O 7.1184g (或Ｎa2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中。
3.方法与步骤：
(1)α-萘胺标准曲线的绘制：用40ppmα-萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ppm
各浓度α-萘胺的配制：用40ppm溶液配制
α-萘胺标准曲线的绘制
混匀，置室温（20~25度）下５分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml, 摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为０，读取光密度，以α-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。
(2)将待测根系吸净吸干附着水称取1g放入100ml三角瓶中，加40ppm的α-萘胺溶液和磷
酸缓冲液各25ml，混匀。
(3)静置5-10分钟后（根吸附以完毕），从瓶中取2ml溶液放入25ml容量瓶。将其余的溶
液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在25℃下震荡3-6小时（如无震荡器时要在反应期间，
定时的摇动），反应时间完毕后，再取2mL溶液放入另一刻度试管，因为α-萘胺溶液会自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；用切碎的根，α-萘胺溶液的氧化量会意外增加）。
(4)在上述两次及空白试验所吸取的2ml测定液中，各加入10ml蒸馏水，混匀后再加入1%
对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml，混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为25ml，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出α-萘胺含量。也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为准确些）。
(5)结果计算
根系对α-萘胺的生物氧化量Y（ug.g-1.h-1）按下式进行计算
Y=[（A-B）-（C-D）]*E/（t*W）
式中：A-第一次取液测定值（ug.ml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应；
B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的α-萘胺浓度（ug.ml-1）。A-B即α-萘胺氧化总量；
C-第一次空白测定值（ug.ml-1）；
D-第二次空白测定值；
C-D即α-萘胺自发氧化量；
E-稀释倍数24（48/2）（因从48ml中又取2ml）；
t-3小时；
W-样品鲜重（也可以用干重计算）；
实验二、硝酸还原酶活性的测定-活体法
[原理]：
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]
1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；
2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml；
3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）；
4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；
5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中；6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中；
7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。
[方法]
摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。
2.样品中硝酸还原酶活力测定
1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中
1份作对照，另外2份作酶活性测定用。
3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml
0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再
抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
4.比色测定：将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入
1ml萘基乙烯胺，再在35℃水浴中显色15min ，后比色，540nm
5.空白溶液：2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。同样和样液一样进行水浴15min。
