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免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
设计免疫荧光实验报告# 设计免疫荧光实验报告## 引言免疫荧光实验是一种常用的生物分子检测方法，通过将荧光标记的抗体与目标分子结合，利用荧光显微镜观察标记物在样本中的分布和定位，从而实现对特定分子的检测和定量分析。
本实验设计旨在通过免疫荧光实验的方法检测样本中的特定抗原，并观察其在细胞中的定位，为相关疾病的研究提供实验数据。
## 材料与方法### 材料- 细胞培养物- 特定抗原抗体- Alexa Fluor 488荧光标记的二抗- 细胞培养基- PBS缓冲液- 封片剂### 方法1. 细胞培养：取细胞培养物并加入适量的细胞培养基，以适宜的条件培养细胞至充足生长。
2. 处理样本：将培养的细胞液滴在玻璃片上，利用离心机将细胞固定。
3. 渗透固定：用PBS缓冲液对细胞进行渗透固定处理，以提高抗体对细胞内抗原的渗透力。
4. 抗原结合：将特定抗原抗体滴加到玻璃片上的细胞上，使其与细胞中的目标抗原结合。
5. 洗涤：利用PBS缓冲液洗涤细胞片，去除未结合的抗体。
6. 二抗结合：将荧光标记的二抗添加到细胞样本中，与特定抗原抗体结合。
7. 洗涤：再次利用PBS缓冲液洗涤细胞片，去除未结合的二抗。
8. 涂片：将细胞样本利用封片剂加覆盖玻璃片，并封闭。
9. 检测：将封片放置在荧光显微镜下观察，在适当的波长下检测荧光信号。
## 结果与分析通过对实验设计中的步骤进行操作，观察结果如下：1. 细胞的生长情况良好，呈现正常形态和大小。
2. 细胞固定后，显微镜下观察细胞染色均匀，且不透明。
3. 特定抗原抗体与样品中的目标抗原结合成功。
4. 荧光标记的二抗与特定抗原抗体结合，形成荧光信号。
5. 在荧光显微镜下观察，样品中荧光信号强度明显增加。
根据观察到的结果，我们可以验证特定抗原的存在并定位，从而实现对相关疾病的研究与诊断。
## 结论免疫荧光实验是一种有效的分子检测方法，能够实现对特定抗原的检测和定位。
通过合理设计实验步骤和选用适当的荧光标记物，我们可以成功检测到样品中特定抗原的存在和定位信息。
免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术是一种通过将荧光标记的抗体与特定抗原结合来检测和定位生物分子的方法。
本实验旨在探究免疫荧光技术的原理和应用，并通过实验验证其可行性。
一、实验原理免疫荧光技术基于抗原与抗体的特异性结合原理。
在本实验中，我们选择了一种常用的抗原-抗体反应，即兔抗小鼠IgG。
首先，将小鼠IgG注射到兔体内，兔体会产生针对小鼠IgG的抗体。
然后，将这些抗体与荧光染料标记，形成荧光标记的抗体。
当荧光标记的抗体与小鼠IgG结合时，可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
二、实验步骤1. 准备样本：将小鼠IgG溶解在缓冲液中，制备不同浓度的小鼠IgG溶液。
2. 固定标本：将小鼠IgG溶液滴加到载玻片上，使其均匀分布，并用乙醇固定。
3. 孵育抗体：将荧光标记的兔抗小鼠IgG加入载玻片上，与固定的小鼠IgG反应。
4. 清洗样本：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的抗体。
5. 观察结果：在荧光显微镜下观察载玻片上的荧光信号。
三、实验结果在实验中，我们观察到荧光显微镜下载玻片上出现了荧光信号。
荧光的强度与小鼠IgG的浓度成正比，即小鼠IgG浓度越高，荧光信号越强。
这表明荧光标记的抗体与小鼠IgG发生了特异性结合。
四、实验分析免疫荧光技术的原理是利用抗体与抗原的特异性结合来检测和定位生物分子。
在本实验中，我们成功地将荧光标记的抗体与小鼠IgG结合，形成荧光信号。
这表明免疫荧光技术可以用于检测特定抗原，并通过荧光显微镜观察到信号。
免疫荧光技术在生物医学研究中具有广泛的应用。
它可以用于检测病原体、研究细胞蛋白定位、诊断疾病等方面。
例如，在病原体检测中，可以使用荧光标记的抗体来检测病原体的存在和定位，从而提高病原体的检测灵敏度和准确性。
在细胞蛋白定位研究中，免疫荧光技术可以用于观察蛋白在细胞内的分布情况，从而揭示蛋白的功能和相互作用关系。
在疾病诊断中，荧光标记的抗体可以用于检测特定抗原的存在，从而帮助医生进行疾病的早期诊断和治疗。
免疫荧光膜定位实验步骤
免疫荧光膜定位实验是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定抗原的位置。
下面是免疫荧光膜定位实验的一般步骤：1. 样本制备：将待检测的细胞或组织样本固定在载玻片上，可使用甲醛等固定剂进行固定。
2. 渗透处理：使用洗涤缓冲液（如PBS）对样本进行渗透处理，以去除细胞内的蛋白质交联物质。
3. 阻断处理：使用阻断液（如BSA、牛血清蛋白等）对样本进行阻断处理，以防止非特异性结合。
4. 一抗处理：加入特异性的一抗（即与待检测抗原特异性结合的抗体），与样本进行孵育反应。
5. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的一抗。
6. 二抗处理：加入与第一抗体结合的荧光染料标记的二抗，与样本进行孵育反应。
7. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的二抗。
8. 脱水和封片：使用适当的溶剂对样本进行脱水处理，并使用透明的封片剂封闭载玻片。
9. 观察和成像：使用荧光显微镜观察和成像样本，检测荧光信号并
定位待检测抗原的位置。
以上是免疫荧光膜定位实验的一般步骤，实验中可能会根据具体实验目的和抗体的选择进行一些调整和优化。
免疫荧光的原理与操作方法
免疫荧光是一种常用的生物学实验技术，其原理是利用特异性抗体与被检测目标结合，并通过荧光标记的二抗或标记的荧光染料来标记抗原或抗体，从而实现对目标物的定量或定位分析。
免疫荧光的操作方法如下：
1. 样品制备：根据需要检测的目标物选择相应的样品，如细胞、组织或酶解物等，然后进行固定和包埋处理，以保持目标物的完整性和稳定性。
2. 抗体处理：将特异性的抗体加入到样品中与目标物结合，通常先经过一定的预处理步骤，如洗涤样品等。
3. 溶液处理：将样品置于含有稀释的荧光标记物（如荧光染料或荧光素等）的缓冲液中，使标记物与样品中的抗原或抗体结合。
4. 洗涤：为去除非特异性结合的无标记物质，需要进行多次洗涤步骤。
洗涤步骤有助于提高免疫荧光实验的特异性和背景噪声的消除。
5. 扫描与图像分析：用荧光显微镜观察标记物质的荧光信号，并通过相应的图像采集与分析软件进行图像记录和荧光信号的定量分析。
需要注意以下几点：
- 对于不透明的组织，需要进行切片和脱水处理，以便抗体和标记物能够渗透到组织中。
- 抗体的选择应根据被检测目标物的性质和特异性来决定。
- 操作过程需注意无菌条件，避免污染样品。
- 实验中的洗涤步骤要彻底，以避免非特异性结合和背景噪声。
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。
2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。
3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。
第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。
2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。
3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。
4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。
第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。
一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。
2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。
3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。
4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。
5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。
6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。
第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。
2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。
3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。
细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。
不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo—1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%—100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X-100透化2—5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5％BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里,4度过夜9、1×PBS洗3次,每次10分钟10、加二抗(用1％BSA稀释)30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛,0.2%Triton，5％BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1。
取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3。
0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。
4。
与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5。
一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好,PBS洗三遍。
6。
二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7。
最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
免疫荧光（IF）实验操作步骤及详细说明一、试剂和溶液10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液：1× PBS：纯水稀释10X PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS 固定液：4%多聚甲醛：4g 多聚甲醛溶于100ml PBS 通透液：0.1% triton-100 封闭液：PBS 配制的3% BSA 抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释二、实验步骤1.细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在12 孔板中，然后接种细胞，置于37℃，5% CO2 培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为40%-50%（做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2 代后的细胞）；2.洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；3.固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置20min,倒掉多聚甲醛，加入适量PBS；4.冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至7）；5.解冻：常温下放置30 min；6.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；7.通透：加入适当体积的通透液室温放置10min。
（若蛋白为膜表达则无需此步）8.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；9.封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置30 min；10.一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育60min；11.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；12.二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗，37℃避光孵育50 min；（如果一抗是荧光素标记的则无需此步）；13.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；14.核染色：加入适当体积及稀释比的核染料DAPI 室温反应10min （如果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至16）；15.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；16.细胞骨架染色：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽，避光37℃孵育60 min 或4℃孵育过夜；17.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤2 次,每次5min，纯水轻微振荡洗涤5min；18.封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，盖在载玻片上；19.荧光显微镜观察，记录结果。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
Coordinated nuclease activities counteract Ku at single-ended DNA double-strand breaks
Immunofluorescence
Cells were seeded on ~160 μm thick coverslips (VWR International) 24 h before experiments. After treatments, cells were pre-extracted by two incubation of 3 min at room temperature with CSK buffer (10 mM PIPES (pH 7), 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2 and 0.7% Triton X-100) containing 0.3 mg ml−1 RNase A
(CSK+R), except for RAD51 foci for which pre-extractions were performed once with CSK on ice for 5 min. After pre-extraction, cells were washed with PBS and fixed
15–20 min with 2% paraformaldehyde in PBS before being washed three times with PBS. Before staining, cells were permeabilized 5 min with PBS/0.2% Triton X-100, washed with PBS and blocked with PBS/0.1% Tween-20 (PBS-T) containing
5% bovine serum albumin (BSA). Coverslips were incubated 75 min with primary antibodies in PBS-T/5% BSA, then washed with PBS-T and incubated 45 min with appropriate goat secondary antibodies coupled to AlexaFluor 488 or 594 fluorophores (Thermo Fisher Scientific for anti-mouse and rabbit and Abcam for anti-rat) in
PBS-T/5% BSA. Note that for RAD51 staining, the primary antibodies were incubated sequentially. After washes in PBS-T and PBS, coverslips were incubated 15–30 min with 1 μg ml−14′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PBS. After washes in PBS, coverslips were dipped in water and mounted on glass slides using VectaShield (Vector Labs) mounting medium.
p75 Neurotrophin Receptor Cleavage by α- and γ-Secretases Is Required for Neurotrophin-mediated Proliferation of Brain Tumor-initiating Cells*
Ki67 Immunostaining for Cell Proliferation
BTICs were transfected with control siRNA, p75NTR siRNA, wild type p75NTR, or cleavage-resistant mutant p75NTR (p75FasTM); and cells were also treated with DAPT (200 nm), TAPI-2 (500 nm), or K252a (200 nm) and with NGF (25, 50, and 100 ng/ml), BDNF (50 ng/ml; Peprotech, catalogue no. 450-02), NT3 (50 ng/ml; Millipore, catalogue no. GF031), anti-NGF (0.1 μg/ml; Millipore, catalogue no. MAB5260Z), or control IgG (0.1 μg/ml; Calbiochem, catalogue no. N101), fixed in 4% paraformaldehyde, and processed for the proliferative marker Ki67 by immunostaining. Cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 and 0.1% sodium citrate for 10 min at room temperature, washed with 1× PBS, and blocked with 10% normal goat serum for 1 h at room temperature. Then cells were incubated with the Ki67 antibody (1:100 dilution; Biocare Medical, catalogue no. CRM 325C) in PBS containing 0.1% Triton X-100 overnight at 4 °C. This was followed by incubation with anti-rabbit Alexa 488 (1:500 dilution; Molecular Probes, catalogue no. A11008) or anti-rabbit Alexa 546 (1:500 dilution; Molecular Probes, catalogue no. A11010) in 1× PBS for 1 h at room temperature and staining with DAPI (Vector Labs) to visualize nuclei. Cells were viewed and captured using an LSM 710 Meta confocal micro scope (Zeiss) at ×40. The number of Ki67-positive (mainly nuclear) cells was quantified by examining the total number of cells counted (by DAPI staining), and proliferation was expressed as a percentage.。
