课程任务：
了解细胞培养及增殖方式。
掌握人染色体核型分析方法，运用该方法分析不同生物染色体核型，根据人染色体核型分析结果，判断生物性别、表型或综合症。
课程涉及内容：
1. 细胞培养讲解及细胞培养技术展示，观察各个培养状态的细胞，时长1h
2. 细胞增殖方式讲解。时长0.5h
3. 染色体形态及染色体异常致病讲解（细胞有丝分裂中期）：0.5h
4. 实操：人染色体核型分析实验1.5h
5. 设计：生物核型分析实验设计1.5h
6. 评价体系：实验设计的“作品展示”及“研究报告”的完成情况0.5h
第一部分：细胞培养技术（简要介绍动物细胞培养技术）
一、动物细胞培养
体外培养的动物细胞分类：原代细胞和传代细胞。
概念：原代细胞是指从机体中取出来后立即培养的细胞，进行传代（什么是传代）培养后的细胞即为传代细胞。
培养原则：动物细胞培养需从原代细胞培养开始。
选材：易于培养的动物细胞包括：幼年动物的肾、肺、卵巢、精巢、肌肉及肿瘤等组织。较难培养的动物细胞：神经细胞等。
培养技术（此处简要描述如下，可根据具体的时间要求讲解）：
单层细胞培养技术：首先取出健康动物的组织块，用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）等将细胞联接处消化分散，给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内的PH），在培养中进行静止或慢速转动培养。但无论用何种培养液一般都要加一定量的小牛（或胎牛）血清，这样细胞才能很好地贴壁生长和分裂。分散的细胞悬液在培养瓶中很快（在几十分钟或数小时内）就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。分散呈圆球形的细胞一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐步形成致密的细胞单层，称为单层细胞。原代培养的细胞一般传代到十代左右就不易继续传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能度过“危机”而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利的传40-50代次，并且仍然保持原有染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种细胞被称作为“细胞系”。一般情况下（胚胎干细胞等除外），当细胞传至50代以后又要出现“危机”，难以再传下去，这种传代次数有限的体外培养细胞通常称为“有限细胞系”；但在传代过程中如有部分细胞发生了遗传突变，并使其带有癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制的培养传代下去，这种传代细胞称为“永生细胞系或连续细胞系”，该细胞系细胞的根本特点是：染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制，容易传代培养。（根据具体时间安排，需具体补充：简要举例说明CHO细胞系、HeLa细胞系、BHK21细胞系等常用连续细胞系在再生医学领域的研究工作）
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1 实验四 人类染色体的识别与核型分析
一、 实验目的
1. 学习染色体核型的分析方法；
2. 了解人类染色体的特征。
二、实验原理
1．染色体组型(核型)是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征的总称。包括：染色体的总数，染色体组的数目，组内染色体基数，每条染色体的形态、长度、着丝粒的位置，随体或次缢痕等。染色体组型是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。组型分析能进行染色体分组外，还能对染色体的各种特征做出定量和定性的描述，是研究染色体的基本手段之一。利用这一方法可以鉴别染色体结构变异、染色体数目变异，同时也是研究物种的起源、遗传与进化，细胞遗传学，现代分类学的重要手段。
2．人类的单倍体染色体组(n=23)上约有30000-40000个结构基因。平均每条染色体上有上千个基因。各染色体上的基因都有严格的排列顺序，各基因间的毗邻关系也是较为恒定的。人类的 24种染色体形成了24个基因连锁群，所以，染色体上发生任何数目异常、甚至是微小的结构变异，都必将导致许多获某些基因的增加或减少，从而产生临床效应。染色体异常常表现为具有多种畸形的综合征，称为染色体综合征，其症状表现为多发畸形、智力低下和生长发育异常，此外还可看到一些特征性皮肤纹理改变。染色体畸变还将导致胎儿死产或流产。染色体病已成为临床上较常见的危害较为严重的病种之一，染色体病的检查、诊断已经成为临床实验室检查的重要内容。
1960年，在美国Denver市召开了第一届国际遗传学会议，讨论并确定正常人核型(karyotype)的基本特点即Denver体制，并成为识别人类各种染色体病的基础。按照Denver体制，将待测细胞的染色体进行分析和确定是否正常，以及异常特点即为核型分析。人类染色体分组及形态特征见表1。
表1 人类染色体分组及形态特征（非显带标本）
组别 染色体序号 形态大小 着丝粒位置 次缢痕 随体
人类染色体的识别与核型分析
应用人类染色体分析，为诊断疾病、探讨病因和发病机制，针对具体情况采取必要的措施提供了科学的依据。因此染色体的研究已成为临床医学中一个不可缺少的组成部分。人类染色体分析与鉴定是否可靠，直接关系到遗传咨询和产前诊断的准确性。因此如何准确识别染色体，鉴别正常与异常染色体是十分必要的。
(一)染色体的命名和常用命名符号
人类细胞遗传学标准化国际命名体制(ISCN1985)包括了1960年、1963年、1968年、1971年、1978年、1981年、1985年7次人类细胞遗传学国际命名会议的结果。主要决议的文本是人类细胞遗传学的国际法规，为了简便地记述人类染色体及染色体畸变，制定了统一的命名符号，详见表13-5。
表13-5染色体常用命名符号
表示符号
说明
表示符号
说明
ace
→
b cen
：
：：
cs
ct
del
der
dir
dic
dis
dup
无着丝粒片段
从→到
断裂
着丝粒
断裂
断裂与重接
染色体
染色单体
缺失
衍生染色体
正位 双着丝粒体
远侧端
重复
/
+
-
？
min
mos
p
ph1
prz
q
r
rcp
rea
rec
将不同的细胞分开
多余
丢失
不能确定
微小点 嵌合体
染色体短臂
费城染色体
粉碎
染色体长臂
环形染色体
相互易位
重排
山东大学实验报告 2011年12 月 12 日
姓名 程开源 系年级 2010级临床医学八年制 同组者 孙琳、孙晶鑫、窦云德
科目 分子细胞生物学 题目 染色体核型分析 学号 201000232012
1
【实验目的】
1. 了解小白鼠睾丸细胞染色体的形态及数目。
2. 初步掌握小白鼠睾丸细胞染色体的玻片标本制作方法。
3. 观察动物细胞染色体的数目和形态。
【实验原理】
染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养；对大型动物通常采用对骨骼、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。
制作染色体标本的先决条件
1. 细胞具有旺盛的分裂能力
选择活跃的组织：胸腺，骨髓，睾丸，小肠
施加药物使细胞分裂：PHA
2. 设法得到大量的中期细胞：秋水仙素
(1) PHA：粗细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞
(2) 秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。
(3) 低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体展开
(4) 空气干燥：使细胞和染色体展开
(5) 固定：用甲醇：冰醋酸=3:1作用使蛋白质变性，对染色体内的组蛋白讲，变性后硬度增加，保持了染色体的“及时形态”，对细胞膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。
对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。
