如何快速高效的建立稳定细胞株

稳定细胞株构建方法我折腾了好久稳定细胞株构建方法，总算找到点门道。

说实话，稳定细胞株构建这事，我一开始也是瞎摸索。

我先讲讲我最开始犯的错啊。

我就想着只要把目的基因转染进细胞不就成了嘛。

我就用了脂质体转染法，转染的时候，我就按照说明书大概弄了一下那个比例，结果转染效率超级低。

就像你想给一群人送信，结果只找到几个人能帮忙送，大部分信都送不出去一样，失败得很彻底。

后来我就研究转染效率低的原因。

发现那个脂质体和DNA的比例很关键。

我就开始一点一点试着调整比例，每次调整完就做一次转染，看看效果。

这就像做饭，盐放多放少得试出个合适的量。

经过好多次尝试，转染效率终于提高了一些。

转染成功只是第一步。

接下来要用抗生素筛选。

我一开始用的抗生素浓度不太对。

浓度低了吧，好多没转染成功的细胞也能存活，这样建出的细胞株就不纯。

浓度高了呢，连转染成功的细胞都被杀死了。

这就是我又一个失败的经历。

然后我就查各种资料，询问身边的同行，大概确定了不同细胞类型适合的抗生素浓度范围，再在这个范围内进行多次测试，才找到了合适的浓度。

我还试过病毒感染的方法构建稳定细胞株。

这个方法呢，病毒包装就很关键。

我自己包病毒的时候，一不小心就容易污染，前面的努力就白费了。

就像盖房子，基础都被破坏掉了。

我总结的经验就是，在包病毒的时候，所有的操作都要超级小心，从试剂的准备开始，每一步都要保证是无菌的，手消毒，台面消毒，试剂瓶消毒一个都不能少。

还有一点，无论是哪种转染或者感染的方法，细胞状态很重要。

我有一次没注意细胞的状态，拿了状态不太好的细胞做实验，转染后细胞死了一大片。

所以呢，养成提前查看细胞状态的习惯特别好。

一定要找那些看起来很健康的细胞来进行构建操作。

总的来说，稳定细胞株构建真的是个需要耐心，不断尝试并且细心对待每一个环节的工作啊。

稳定细胞株构建技术原理哺乳动物稳定细胞系是指通过外源基因转染真核细胞后整合入基因组DNA，能够长期存在于细胞中，随染色体复制而传给子代，可以稳定表达目的基因的细胞系。

哺乳动物稳定细胞系的生产工艺开发过程通常包括分子构建、稳定细胞系筛选、上游发酵工艺开发、下游纯化工艺开发以及制剂工艺开发。

其中，分子构建和稳定细胞系筛选作为蛋白产品开发的起始部分，具有极其重要的意义。

一株稳定高产的工程细胞株不仅能显著增加单位体积产量，降低产品的生产成本，还可以降低下游纯化过程的复杂度，确保获得安全，高质量的蛋白产品。

工业上利用哺乳动物系统生产重组蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染通常用于制备少量蛋白，用于药物开发早期的蛋白活性检测。

瞬时转染并不产生克隆细胞株，它只是暂时将编码外源蛋白的质粒转导入宿主细胞，如HEK293或COS细胞。

随着细胞的分裂，外源基因不断丢失，因此蛋白产量较低。

与瞬时转染不同，稳定细胞株是为工业化生产治疗性蛋白而构建的。

稳定细胞株需要具备在不同的时间，不同的场地以及不同的批次间生产相同质量蛋白产品的能力。

01 转染转染是指通过质粒将编码目的蛋白的外源基因导入到宿主细胞内的过程。

质粒上除了目的基因外还带有抗性基因，比如抗生素抗性基因。

这样在转染后就可以利用选择压力富集整合了质粒的宿主细胞。

在哺乳动物细胞中质粒不能复制，因此，未整合到基因组中的质粒将随细胞分裂而逐渐丢失。

在一段时间的选择压力后，所有存活下来的细胞基因组中都整合了外源质粒。

外源基因是以质粒DNA的形式进入动物细胞的，同时质粒DNA 上带有提高外源基因转录和翻译水平的元件。

尽管病毒来源的载体和细菌来源的载体都被用来将外源基因导入动物细胞，但是工业上在构建细胞株的过程中极少用到病毒来源的载体。

目的基因可以由组成型，诱导型或条件型启动子进行启动转录。

在细胞分化和发育的研究中经常用到条件型启动子，它可以由某些特定因素引发，导致蛋白表达，影响细胞的分化。

如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。

为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。

细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。

转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。

Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。

选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。

过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。

在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。

单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。

为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。

三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。

根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。

细胞株构建方法说实话细胞株构建这事，我一开始也是瞎摸索。

我试过老多方法了，走了不少弯路。

我先讲讲最开始那种笨办法吧。

就像搭积木一样，我想一步一步从细胞开始构建，但是这个过程可难了。

首先得找个合适的细胞源，就像找原材料一样。

我当时就选错了细胞源，那细胞活性不行，根本没办法进行后面的操作，这就像盖房子的砖头都是碎的，那房子肯定盖不起来啊。

后来我就想，那得选活性好的细胞。

好不容易选好了细胞，那就开始搞转染的事儿。

转染就像是送快递，把目标基因这个包裹送到细胞内部。

我试过脂质体转染，这个就像是给基因裹上一层油乎乎的保护膜，然后送到细胞那去。

可这个过程特别不好控制，脂质体的量少了吧，基因送不进去，量多了呢，对细胞又有毒害作用。

有好几次啊，我的细胞就因为脂质体过量都死翘翘了，当时那个挫败感就别提了。

后来我又试了电转染，这个感觉就像给细胞通电，然后强行把基因塞进细胞里。

听起来不错吧，但这个特别挑细胞状态。

细胞状态稍微差点，一转染，细胞就受不了那电流的冲击，死一大片。

我就眼睁睁看着本来长得好好的细胞，弄了电转染之后就变得稀稀拉拉的，失败了好多次才有点经验。

后来我发现，有时候事先处理下细胞环境很重要。

比如说调整下培养基的成分，这就像给士兵准备好粮草一样。

合适的培养基能让细胞更强壮，更能接受后面的操作。

如果培养基里营养物质不够或者有什么毒素杂质，细胞自己都活不好，还谈什么构建细胞株啊。

再后来我找到一种病毒载体转染的方法。

这个病毒载体啊，就像是一个专门载客（基因）的高效小汽车。

它能比较准确地把基因送到细胞里面。

不过这个也要特别小心，病毒载体可能会有潜在的危险性，要是失控了那可不得了。

虽然现在我不敢说我构建细胞株就完全没毛病了，但是这些都是我实实在在经历过的。

我觉得在构建细胞株的时候，多尝试不同的方法肯定没坏处。

而且一定要细心，每个小环节都可能影响最终的结果。

还有啊，多看看那种比较新的研究成果，有时候新的方法就是要比旧的好使很多。

构建细胞稳转株（一）慢病毒包装：1．转染前24小时，将293T细胞以4-5×106接种于10cm的大皿中，加入10ml DMEM 完全培养基，轻轻摇晃，混匀，于37℃，5%CO2培养箱中培养。

注：细胞转染前密度应达到80%-90%。

3．充分混匀，离心管1，离心管2室温孵育5分钟。

4．将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。

注意加入顺序非常重要。

5．室温孵育转染混合液15分钟6．将步骤1准备的细胞换液（95%DMEM+5%灭活FBS）。

7．将1ml转染混合液逐滴加入换液好的细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀。

8．37℃培养。

4-6小时后，用10ml培养基换液（90%DMEM+5%灭活FBS+5%双抗）。

9．转染48小时收集细胞培养上清。

500g离心10min去除细胞碎片。

该上清可以直接用于慢病毒感染，也可进行病毒滴度测定或病毒浓缩。

如需长时间保存，可-80℃冻存。

注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。

（二）慢病毒感染待测细胞：1.取新包装的或冻存于-80℃冰箱的慢病毒于冰上缓慢解冻。

2.慢病毒与培养基（DMEM+5%灭活FBS+1%双抗）按一定的体积混匀，加转染增强剂polybrene至终浓度为10μg/ml。

3.待转染的细胞吸去原培养液，PBS洗3次。

4.把混合好的慢病毒培养基加到细胞培养瓶中进行感染。

5.将细胞培养瓶放回培养箱中培养过夜，PBS洗3次，更换为完全培养基继续培养。

6.感染72h后，荧光显微镜观察荧光，拍照，分析细胞生长状态。

（三）稳转细胞株筛选：将慢病毒感染成功的细胞继续培养，并在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。

筛选持续一周，在荧光显微镜下观察，至感染效率达到80%嘌呤霉素最佳筛选浓度测定：将对数生长期的细胞消化，均匀铺在24孔板上，5×104/孔。

隔夜将细胞换液，并设置嘌呤霉素梯度：0 ug/ml；0.5 ug/ml；1.0 ug/ml；1.5 ug/ml；2.0 ug/ml；2.5 ug/ml48 h后换正常培养基。

单克隆稳转株的构建技术原理
对感染并筛选后的混合克隆稳转株细胞进⾏稀释培养，挑取单⼀细胞⽣长⽽成的细胞克隆，再进⾏扩⼤培养，以获得性状单⼀、表达稳定的细胞株：
具体步骤如下：
1）将细胞消化后接种于96孔板中，接种的细胞密度为1个/孔（可通过有限稀释的⽅法，也可通过流式分选）；
2）标记出具有单个细胞的孔等细胞扩增后⽤puro进⾏筛选；
3）筛选完毕后，收集细胞进⾏qPCR或Western Blot鉴定，选择鉴定结果正常的单克隆细胞冻存保种
另外⼩编也整理了⼀些稀释法的⽅案给⼤家作为参考：
1）倍⽐稀释筛选
细胞计数设定⾸排的浓度，例如⾸孔设置10* cells/孔，每孔50*μl （细胞
浓度：100* cells/ml），96孔板补⾜最终培养体积100ul。

倍⽐稀释⽅法举例
注：标*体积均为参考，⼤家可以根据⾃⼰的实际情况进⾏调整
2）两步系列稀释筛选
两步系列稀释⽅法举例
稀释倍数参考：以⾸孔浓度选择1E4cell/孔*举例，标红区域出现1个细
胞的概率更⼤
3）直接稀释⾄1个/孔：以96孔板为例，将细胞消化后接种于96孔板
中，接种的细胞密度为1个/孔。

稳定细胞株的构建流程以稳定细胞株的构建流程为标题，写一篇文章细胞株是一种在实验室中长期培养的细胞群体，可以用于研究细胞功能和生物学过程。

在科学研究中，稳定细胞株的构建是一项重要的技术，可以用于表达感兴趣的基因或蛋白质，并进行相关功能研究。

本文将介绍稳定细胞株的构建流程，帮助读者了解该技术的基本原理和操作步骤。

1. 选择合适的细胞株稳定细胞株的构建首先需要选择一个合适的细胞株作为基础。

常用的细胞株有HEK293、CHO、HeLa等。

选择细胞株时需要考虑其易于培养、易于转染以及适合研究目的的特点。

2. 构建表达载体表达载体是构建稳定细胞株的关键，它可以帮助将感兴趣的基因或蛋白质引入到细胞中。

常用的表达载体有质粒、病毒、RNA干扰等。

根据实验需要选择合适的表达载体，并将感兴趣的基因或蛋白质插入到载体中。

3. 转染细胞将构建好的表达载体转染到目标细胞中。

转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法、病毒介导转染等。

选择合适的转染方法，将表达载体引入到细胞中。

4. 选择稳定细胞转染后的细胞群体中，只有少数细胞成功地表达了目标基因或蛋白质。

为了筛选出这些稳定细胞，可以加入适当的筛选物质。

例如，如果表达载体中带有抗生素抗性基因，可以在培养基中加入相应的抗生素，只有表达了该基因的细胞才能存活下来。

5. 单克隆分离从筛选后的细胞中挑选出单个细胞，进行单克隆分离。

这可以通过限稀稀释法或流式细胞分选法来实现。

将单个细胞分离培养，得到单克隆细胞株。

6. 鉴定稳定细胞株对得到的单克隆细胞株进行鉴定，确认其是否稳定地表达目标基因或蛋白质。

常用的鉴定方法有Western blot、荧光定量PCR等。

7. 扩大培养经过鉴定的稳定细胞株可以进一步扩大培养，得到足够数量的细胞供后续实验使用。

在扩大培养过程中，需要注意细胞的培养条件、培养基的配方等。

8. 长期保存为了保证稳定细胞株的长期保存，可以采取冻存的方法。

将稳定细胞株冻存于液氮中，以备将来使用。

实验步骤1
1. 转染：
用CHO或者N2a细胞转染BACE-HA后培养48小时，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；
2. 加G418:
去掉培养液，PBS洗一次，加入浓度为800ug/ml的G418筛选培养基。

3. 换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。

筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；
4. 挑单克隆：
制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/5ul。

在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液5ul/孔。

待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

5. 单克隆鉴定：
细胞大量扩增后，同时用原细胞系转染PCDNA3.1,并设置对照组即空白对照，提蛋白，做western blot检测。

实验步骤2
1. 将处于对数生长期的CHO或者N2a细胞按比例接种于12孔板，待细胞长到60%时转染。

转染方法同瞬时转染。

2. 待24-48小时后换为含800ug/mlG418的选择性培养基，将细胞按1:10稀释后稳定培养两周换为含600ug/mlG418的选择培养基
3. 将混合细胞吹打成单细胞悬浮计数，调整细胞数为每孔20个/孔，加入100ul含200ug/mlG418的选择培养基，待抗性克隆长出后挑选良好的克隆，逐步放大，压力由含200ug/mlG418的培养基增加至含800ug/mlG418的培养基继续筛选，最后稳定用含800ug/mlG418培养基培养。

稳定细胞株的构建流程以稳定细胞株的构建流程为标题，写一篇文章。

一、引言稳定细胞株的构建是生物学研究中常用的实验技术之一。

通过构建稳定细胞株，可以使目标基因在细胞中稳定表达，从而对其功能进行深入研究。

本文将介绍稳定细胞株的构建流程。

二、选择适当的宿主细胞稳定细胞株的构建首先需要选择适当的宿主细胞，常用的细胞包括人类胚胎肾细胞293细胞、小鼠骨髓细胞NIH3T3细胞等。

选择宿主细胞时需要考虑其易于转染、高细胞增殖率和细胞稳定性等因素。

三、构建载体1.选择适当的表达载体：常用的表达载体有质粒和病毒载体，根据实验需要选择合适的载体。

质粒载体便于操作和大规模扩增，而病毒载体能够高效地转染细胞。

2.插入目标基因：将目标基因插入表达载体中，可以通过PCR扩增得到目标基因片段，并使用限制酶切将其与表达载体连接。

连接后进行酶切鉴定和测序验证。

3.构建转染载体：将表达载体转化至适当的细菌宿主中，利用细菌的复制机制进行扩增。

扩增后提取纯化质粒。

四、转染宿主细胞1.选择合适的转染方法：常见的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒转染法等。

根据宿主细胞的特性和实验要求选择最适合的转染方法。

2.优化转染条件：转染条件的优化对于获得高转染效率和稳定性的细胞株至关重要。

可以调整转染剂的浓度、时间和转染温度等因素。

3.筛选转染细胞：在转染后，使用适当的筛选压力，如抗生素选择、荧光标记等，筛选出转染成功的细胞。

五、稳定细胞株的筛选和鉴定1.单克隆细胞的筛选：通过稀释法将转染细胞稀释至单个细胞，然后培养形成单克隆细胞株。

2.目标基因表达的鉴定：通过Western blot、RT-qPCR等方法对目标基因的表达进行检测，确认稳定细胞株中目标基因的稳定表达。

3.稳定性的验证：长期培养稳定细胞株，观察目标基因的表达是否稳定，并进行细胞传代实验，验证细胞株的稳定性。

六、应用稳定细胞株稳定细胞株的构建完成后，可以用于进一步的实验研究，如基因功能研究、药物筛选和蛋白质表达等。